稻瘟病抗性基因Pik-h及其應用的制作方法

專利名稱：稻瘟病抗性基因Pik-h及其應用的制作方法
稻瘟病抗性基因Pik-h及其應用技術領域
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種水稻稻瘟病抗性基因Pik-h及其克 隆和應用。
背景技術：
植物在生長的過程中，常常受到多種病原物的侵害，而植物則采取多種防御策 略以保護自身，避免受其侵襲。植物中一個最重要的防御機理就是能夠識別專性致病微 生物的存在并啟動自身的防御應答系統。植物對病原菌的識別由抗病基因所介導。因 此，對抗病基因產物結構進行分析與研究，是了解植物抗病機制的基礎，對于其病害的 預防和控制也具有重要的指導意義。
迄今為止，已經從植物中分離了 80多個抗病基因。對這些抗病基因的結構和 產物的研究發現，雖然寄主植物不同，所對應的病原物也有真菌、細菌、病毒和線蟲等 差異，但抗病基因的結構和產物卻有許多共同的結構特征，如C-端存在富亮氨酸重復 序列(leurine-richrepeat, LRR), N-端存在核苷酸結合位點(nucleotide binding site, NBS)，亮氨酸拉鏈(leucinezipper，LZ)，卷曲螺旋結構域(coiled-coil，CC),跨膜結構 域(transmembrane domain, TM)，蛋白激酶(protein kinase, PK)，以及果蠅 Toll 蛋白 及哺乳動物白介素-I受體(Toll andinterleukin-lreceptor, TIR)等。根據它們所編碼蛋 白的結構特征，可將抗病基因分為7類(Hammond-Kosack&Jones，1997 ； Dangl&Jones 2001 ； Iyer&McCouch 2004)。
第一類，毒素還原酶類抗病基因。如玉米抗病基因Hml，它是第1個被克隆的 植物抗病基因，它控制對真菌Cochliobolus carbonum小種1的抗性。Hml編碼的解毒酶 能鈍化病原真菌所產生的HC毒素，而HC毒素是真菌C.carbonum小種1產生的致病因 子，它決定該病菌只能感染玉米的某些基因型(Johal等，1992)。第二類，NBS-LRR類 抗病基因。它們編碼的蛋白近N端為NBS，而近C端則由LRR組成。如RPS2 (Bent etal.，1994)、RPMl (Grant et al.，1995)、12 (Simon et al.，1998) ； RPP5 (Parker et al., 1997)、N(Dodd etal., 2001)、L6 (Lawrence et al.，1995)、Mlal (Zhou et al.，2001)、 Mla6 (Halterman et al., 2001)；水稻的抗病基因如 Xal (Yoshimura et al., 1998)、 Pib (Wang et al., 1999)、Pita (Bryan et al., 2000)等。第三類，PK 類抗病基因。如番 茄Pto基因，其產物是一種位于細胞內的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，沒有LRR結構域 (Martin etal.，1993)。第四類，LRR-TM類抗病基因。番茄抗葉霉病不同生理小種的 基因 Cf—2 (Dixon et al., 1996)、Cf_4 (Thomas etal., 1997)、Cf-5 (Dixon et al., 1998)、 Cf-9 (Jones etal., 1994)，以及甜菜抗胞囊線蟲的基因 HsIpk^1 (Cai et al.，1997)等。第 五類，LRR-TM-PK類抗病基因，以水稻抗白葉枯病基因Xa21 6ong etal.，1995)為代 表。第六類，以擬南芥的RPW8為代表，其編碼的蛋白僅含有完整的CC和NBS結構域 (Xiao et al., 2001)。第七類，以水稻的xa5基因為代表，其編碼的蛋白為一個轉錄因子 (TFIIA □ ) (Iyer&McCouch，2004)。
編碼NBS-LRR類抗病蛋白的抗病基因是植物抗病基因中最大的一類抗病 基因，根據NBS-LRR類抗病蛋白N末端的結構特點，又可將該類基因分為兩大類 TIR-NBS-LRR 和 CC-NBS-LRR (Meyers et al.，2002 ； Pan et al.，2000 ； Cannon et al.， 2002； Richlyetal., 2002)。TIR_NBS_LRR類抗病基因主要發現在雙子葉植物，至今還 沒有在單子葉植物基因組中發現(Bai et al., 2002 ； Meyers et al., 2002)。目前在單子葉 植物中鑒定到的抗病基因主要編碼CC-NBS-LRR類抗病蛋白，雙子葉植物中也存在大量 的CC-NBS-LRR類抗病基因，相對而言，單子葉植物中的CC-NBS-LRR類抗病基因比 雙子葉植物中的更豐富多樣(Cannon et al., 2002)。
研究表明，NBS、CC> TIR結構域可能參與信號傳導(Hammond-Kosack&Jones 1997)，盡管這類R蛋白不具有內在的激酶活性，但NBS可以激活激酶或G蛋白，NBS 具有結合ATP或GTP以及水解酶活性(Traut et al., 1994)。TIR結構可能參與植物抗病 防衛反應下游的信號傳導(Jones etal.，1994)。最近的證據表明，亞麻的L族多樣性選擇 也發生在TIR區域，這個區域與相應的LRR區域共進化形成特異性(Luck et al., 2000)。 LRR結構域的功能主要涉及到蛋白質-蛋白質和與配體的相互作用(Jones&Jones，1996 ； Kajava et al., 1998)，據推測是抗病基因產物直接和病原菌無毒基因編碼的產物或間接產 物相互作用的部位(Bent，1996 ； Baker et al., 1997)。Jia et al. (2000)通過酵母雙雜交證 明AVR-Pita編碼的蛋白加工為一個176氨基酸的活性蛋白AVR-Pita176小種特異性的激發 子，傳遞到植物細胞質特異地與Pita受體的LRD區域結合，從而激活細胞內Pita介導的 防衛反應。當Pita中的Ala變為Ser后Av_rPita176不能與LRD結合，因而表現感病。這 一結果直接證明了 LRR結構域可能就是病原菌識別的區域；Pita與AvrPita的互作第一次 從分子水平驗證了水稻與稻瘟病菌的“基因對基因”關系。
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有一半以上的人口以稻米為主食。由 病原真菌Magnapothe oryzae(無性態Pyriculariaoryzae)引起的稻瘟病是對水稻生產危害 最嚴重的病害之一，每年都造成嚴重的糧食損失。從環境保護與農業的可持續發展的觀 點來看，抗病品種的育成與利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是，由于稻瘟病菌 群體的多樣性及易變性，加之人們缺乏對抗性基因的有效利用，以及對抗性機理缺乏充 分的了解，以致抗病品種的感病化問題不但沒有得到解決，反而因有效抗源基因的缺乏 和抗病品種的短命化而成為育種學家最為棘手的問題。因此，發掘、鑒定和克隆抗病基 因并合理地應用于抗病育種計劃中，已成為農業科研中優先解決的重要問題。
隨著分子生物學的快速發展，迄今，至少有80多個水稻稻瘟病主效抗性基因 已經被報道，其中60個已經被分子定位。目前，除了水稻的第3染色體上還沒有被 鑒定到稻瘟病主效抗性基因之外，其余的11條染色體上均被鑒定到有主效抗性基因位 點，并且有的染色體上含有多個稻瘟病抗性位點，而且有些基因位點的抗性基因是成簇 存在的。目前，在稻瘟病抗性基因的克隆研究方面，正式報道的已有13個抗性基因， Pib (Wang et al., 1999)，Pita (Bryan et al., 2000)，Pi9 (Qu et al., 2006)，Pid2 (Chen et al., 2006)，Piz-t 禾口 Pi2 (Zhou etal.，2006b), Pi36 (Liu et al.，2007a), Pi 3 7 (Lin etal., 2007)，Pik-m(Ashikawa etal., 2008)，Pit(Hayashi etal., 2009)，Pi5(Lee etal., 2009)， Pid3 (Shang et al., 2009)禾口 pi21 (Fukuoka et al., 2009)。
克隆抗病基因是對水稻抗性機理深入研究的前提，揭示水稻抗稻瘟病的分子機理可以更好地控制和降低稻瘟病菌對水稻的危害。同時，對克隆的抗病基因進行修飾和 改造，可以人為地控制和增加植物的抗病性，拓寬植物的抗譜。這些方面是采用常規植 物育種和改良技術所不能達到的。發明內容
本發明的目的是提供一種水稻稻瘟病抗性基因和包含調控這個基因的啟動子的 DNA片段。本發明的另一個目的是提供上述稻瘟病抗性基因所編碼的蛋白質。本發明 的另一個目的是提供上述含有上述抗性基因的載體。本發明的另一個目的是提供上述載 體的宿主細胞。本發明的另一個目的是提供上述基因在制備轉基因植物中的應用。本發 明的進一步目的是提供上述抗性基因產生的分子標記及其在選育對稻瘟病具有抗病性的 水稻中的應用。
本發明從水稻品種K3中分離得到Pik-h基因，包括2個編碼NBS-LRR類蛋 白的基因Pikh-I和Pikh-2,其核苷酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示，它們 分別編碼SEQ IDN0.3以及SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列，結構如附圖6和附圖7所 示。它們的蛋白都包含2個主要的結構域NBS和LRR區域，其中Pikh-INBS結構 域含有保守的 kinase Ia GLPGGGKTTVAR, kinase2 NKKYLIVIDDIW, kinase3a DLGGRIIMTTRLNSI, GLPL EDSPCYDIVNMCYGMPLALI ； Pikh_2NBS 結構域含 有保守的 kinasela VLSIVGFGGVGKTTIA, kinase2 LEQLLAEKSYILLIDDIW, kinase3a GGRIIVTTRFQAV, GLPL EQVPEEIWKICGGLPLAIV, RNBS-D CLLYLSIFPKGWK, MHDV KTFQVHDMVLEYI。而 Pikh-Ι 蛋白的 C-末端為 16 個不 完整的LRR重復，其亮氨酸含量為14.0% (附圖6) ； Pikh-2蛋白的C-末端為13個不完 整的LRR重復，其亮氨酸含量為17.0% (附圖7)。
應當理解，在不影響蛋白活性的前提下(不在蛋白的活性中心)，本領域技術人 員可對SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一 個或幾個氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考慮到密碼子的簡并性，例如 可在其編碼區，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區在不影響蛋白表達的條 件下，對編碼上述蛋白的基因序列進行修改。本發明還包括基于所述基因的正義序列或 反義序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達載體、含有所述載體的 宿主細胞、含有所述核苷酸序列或其片段的轉化的植物細胞和轉基因植物。
本發明同樣包括將Pik-h抗性基因的主要結構部分有效地連接上合適的調節序 列所形成的嵌合基因，以及在基因組中包含這種基因的植物和這種植物的種子。這種基 因可以是天然的或是嵌合的。例如，將包含該基因的片段和一個組成型表達的啟動子連 接，該啟動子可以在任何條件下和細胞發育的任何時期表達。這種組成型表達的啟動子 包括花椰菜花葉病毒的35S啟動子等。另一方面，也可以將該基因和一個組織特異性表 達的啟動子或發育時期特異性表達的啟動子或精確環境誘導的啟動子連接，這些啟動子 稱之為誘導型啟動子。這樣，環境的改變，發育時期的不同都可以改變該基因的表達。 同樣地，也可以將該基因的表達限定在某一個組織內，使由該基因誘導的抗病反應得到 人為的控制。其中環境條件包含病原菌的攻擊、厭氧條件和光等，組織和發育時期包括 葉、果實、種子和花等。
本發明還進一步克隆得到所述基因的啟動子，包含調控該基因的啟動子的DNA 片段分別如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示。
根據本發明提供的Pik-h基因序列信息6EQ ID No.l和SEQ ID No.2)，本領域技術人員可以通過以下方法容易地獲得與Pik-h等同的基因(1)通過數據庫檢索獲得； (2)以Pik-h基因片段為探針篩選水稻或其它植物的基因組文庫或cDNA文庫獲得；(3) 根據Pik-h基因序列信息設計寡核苷酸引物，用PCR擴增的方法從水稻或其它植物的基因 組、mRNA和cDNA中獲取；(4)在Pik_h基因序列的基礎上用基因工程方法改造獲得； (5)用化學合成的方法獲得該基因。
本發明提供的稻瘟病抗性基因Pik-h具有重要的應用價值，其賦予植物對稻瘟病 菌(Magnaportheoryzae)所引起的病害產生特異性的抗病反應。其適用于對所有對該病原 菌敏感的植物，這些植物包括單子葉植物和雙子葉植物。應用之一是將所述的Pik-h基 因序列連接到任何一種植物轉化載體，用任何一種轉化方法將Pik-h抗病基因導入水稻或 其他植物細胞，可獲得表達所述基因的轉基因抗病品種，從而應用于生產。本發明所述 的基因構建到植物轉化載體中，可以對所述基因或其調控序列作適當的修飾，也可以在 其轉錄起始密碼子前用其它啟動子取代所述基因原有的啟動子，從而拓寬和增強植物對 病原菌的抗性。
本發明提供的抗性基因的另一個應用是根據所述基因序列信息產生特異性的分 子標記，包括但不限于SNP (單核苷酸多態)、SSR(簡單序列重復多態)、RFLP (限制性 內切酶長度多態)、CAPS (切割擴增片段多態)。用此標記可鑒定水稻或其它植物的抗 性基因型，用于分子標記輔助選擇育種，從而提高育種的選擇效率。
本發明具有明顯的優點和效果。將克隆的抗病基因轉入感病的植物，有助于產 生新的抗病植物。特別是可以用轉化技術在植物中累加多個抗病基因，而不會產生傳統 育種技術中伴隨出現的基因組中不良基因的連鎖問題，并且可以縮短育種時間。抗病基 因的克隆是克服傳統育種中不能在植物種間轉移抗病基因的問題的前提。
本發明能夠進一步提供或應用基于上述DNA片段獲得的抗病的轉基因植株和相 應的種子，以及用本發明的基因或基于該基因的重組體轉化的植株或由這類植株獲得的 種子。可以用有性雜交的方式將本發明的基因轉入其他的植株中。


圖1.水稻稻瘟病抗性基因Pik-h的圖位克隆技術路線圖。
圖2.P&簇等位基因對8個稻瘟病菌群體抗譜的比較。圖中縱坐標為抗性頻率， 橫坐標為8個稻瘟病菌群體(GD，廣東；FJ，福建；YN，云南；GZ，貴州；SC，四 川；JS，江蘇；JL，吉林；HLJ，黑龍江)。5個Pik簇等位基因(SWn 2，Pik-s ； K60， Pik-p ； Kusabue, Pik ； Tsuyuake, Pik-m ； K3, Pik-h) 由此可以看出，Pik_h對廣東、 福建、云南、貴州、四川、江蘇的稻瘟病菌群體表現高度的抗性。
圖3A.Pik_h基因位點的連鎖標記圖。橫線上面的數字為標記之間的物理距離[用 堿基(bp)表示]；括號內的數字為該標記檢測出的重組體/配子體。
圖3B.Pik_h基因位點在日本晴類型基因組上存在的具有NBS-LRR保守結構的6 個抗病候選基因。
圖3C.Pik_h基因位點在K3/K60/Tsuyuake類型基因組上存在的具有NBS-LRR保守結構的2個抗病候選基因。由此可以看出，在Pik-h基因位點存在兩種類型的基因 組，彼此之間存在很大的缺失/插入；Pik-h基因只有2個候選基因(Pikh-I和Pikh-2)。
圖4 (左).水稻稻瘟病抗性基因Pik-h之組成基因Pikh-I之遺傳互補Ttl植株的 抗性鑒定實物圖。圖中所有轉化植株都表現感病，說明單一的Pikh-I不具備抗性功能。
圖4(右).水稻稻瘟病抗性基因Pik_h(由Pikh-I和Pikh-2組成)之遺傳互補 Ttl植株的抗性鑒定實物圖。圖中實線箭頭所指的是抗病植株，虛線箭頭所指的是感病植 株，說明抗性基因Pik-h由Pikh-I和Pikh-2組成才能表現功能。
圖5.水稻稻瘟病抗性基因Pik-h遺傳互補的部分Ttl轉化體的選擇標記HPT 基因的PCR檢測圖。圖中由左至右，泳道1:分子量標記DL2000;泳道2 空載體 (Vector),陽性對照；泳道3: H2O,陰性對照；泳道4 受體品種龍粳對，陰性對照； 泳道5-14: Ttl轉化體。結果表明，所有抗病的轉化體都檢測到了選擇性標記的PCR擴 增產物，而感病的轉化體沒有檢測到選擇性標記的PCR擴增產物，說明抗病的轉化體是 由于轉化構建體已經整合到了高感的受體品種中獲得了表達而恢復了抗性。R:高抗； MR:中抗；MS:中感；S:感病。
圖6A.水稻稻瘟病抗性基因Pik-h之組成基因Pikh-I的基因結構圖。
圖中淺色方框表示5’和3’ -UTR ；深色方框表示外顯子；線條表示內含子； 該基因編碼區的啟動子(ATG)和終止子(TAG)以及各個區域的大小(bp)亦標示于其中。
圖6B.水稻稻瘟病抗性基因Pik-h之組成基因Pikh-I編碼的氨基酸多肽序列及結 構圖。
圖中CC結構域中的斜體字表示形成CC motif的氨基酸，NBS區域帶下劃線的 黑體字表示NBS中保守的氨基酸序列。下部分獨立列出的氨基酸殘基為C-末端LRR區 域；帶下劃線的黑體字表示形成LRR區域的xLDL保守基序；LRR區域后面還帶有一段 CNL(C端非LRR區域)氨基酸序列。雙下線標示的氨基酸序列為Pik-h特異的氨基酸替 換[substitution，與Pik簇的其他其他等位基因(Pik，Pik-s, Pik-p, Pik_m)相比]。
圖7A.水稻稻瘟病抗性基因Pik-h之另一組成基因Pikh-2的基因結構圖。
圖中淺色方框表示5’和3’ -UTR ；深色方框表示外顯子；線條表示內含子； 該基因編碼區的啟動子(ATG)和終止子(TAG)以及各個區域的大小(bp)亦標示于其中。
圖7B.水稻稻瘟病抗性基因Pik-h之另一組成基因Pikh-2編碼的氨基酸多肽序列 及結構圖。圖中CC結構域中的色斜體字表示形成CC結構的氨基酸，NBS區域帶下劃線 的黑體字表示NBS中保守的氨基酸序列。下部分獨立列出的氨基酸殘基為C-末端LRR 區域；帶下劃線的黑體字表示形成LRR區域的xLDL保守基序。雙下線標示的3個氨基 酸序列為等位基因特異的氨基酸替換(substitution，與已被克隆的Pik-m基因相比)。
圖8.水稻稻瘟病抗性基因Pik-h表達特性的定量RT-PCR檢測圖。左圖為組 成基因Pikh-I在不同的接種時間點(Ohr，12hr，24hr，72hr)的相對表達水平，由此可 以看出，該基因呈逐步上調的表達類型。中圖為另一個組成基因Pikh-2在不同的接種 時間點的相對表達水平，由此可以看出，該基因也呈逐步上調的表達類型，但是后者 逐步上調的幅度比前者的大。右圖為病原菌誘導表達基因PBZ1 (pathogenesis-related probenazole-inducible gene)作為對照的相對表達水平，由此可以看出，該基因在接種對照(H2O)和接種病原菌之間表現明顯不同的誘導型表達。2個組成基因都表現為組成型 表達，因為接種之前和之后都能檢測到2個基因的表達。圖9.利用水稻稻瘟病抗性基因Pik-h特異性分子標記的基因型鑒定圖。由此可 以看出，利用該分子標記可以把抗性品種K3的基因型(Pikh/Pikh)；感病品種AS20-1的 基因型(pikh/pikh)；含有與Pik-h等位的抗性品種Kusabue的基因型(Pik/Pik)；抗性品 種Tsuyuake的基因型(Pikm/Pikm)；抗性品種K60的基因型(Pikp/Pikp)；以及抗性品種 K3與感病品種AS20-1的雜交F2之感病個體S1-S6的基因型(pikh/pikh)鑒別出來。圖 中，M:分子量標記DL2000。
具體實施例方式以下 實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背 離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于 本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常 規手段。在本發明的實施例部分，我們闡述了 Pik-h基因的分離過程(附圖1)和該基因 的特點，分離的Pik-h基因能夠與適當的載體連接，轉入植物體中，使該植物體帶有一定 的抗性。實施例1 抗性基因Pik-h的抗性特征首先，為了比較和明確在Pik位點上5個等位基因(Pik，Pik-p, Pik-s, Pik-m, Pik-h)的抗譜，利用從廣東(60個菌株)，福建(40個)，云南(43個)，貴州(60個)， 四川(66個)，江蘇(72個)，吉林(60個)，黑龍江(63個)，收集的總計464個菌株對 上述5個等位基因所持品種(分別是Kusabue，K60, Shin 2，Tsuyuake和K3)進行了抗 譜比較分析。結果表明，Pik-h對廣東、福建、云南、貴州、四川、江蘇的稻瘟病菌群 體表現高度的抗性。由此說明該基因可在上述地區使用。水稻品種K3已在文獻(Xu et al.Efficient authentic finemapping of the rice blast resistance gene Pik-h in the Pik cluster, using new Pik-h-differentiatingisolates.Molecular Breeding, 2008, 22 289_2")中公開。水稻 品禾中 Shin 2, K60, Kusabue, Tsuyuake, AS20—1 已在文獻(Wang et al.Characterization of rice blast resistance genes in thePik cluster and fine mapping of the Pik-p locus.Phytopathology, 2009，99 900-905)中公開。實施例2 水稻稻瘟病抗性基因Pik-h的定位及電子物理作圖本發明對由粳稻抗病品種K3與秈稻感病品種AS20-1的雜交組合由來的F2群 體，接種對雙親品種表現分明的非親和性/親和性反應的菌株CHL867，CHL1946, M028 (Wang et al.Characterization of rice blast resistance genes in the Pik cluster and fine mapping of the Pik-plocus.Phytopathology, 2009，99: 900-905)。結果表明，該 F2 群體 中抗病植株與感病植株的分離比都符合3 1。由此推斷，K3所表現的對3個接種菌株 的抗性都是由一對顯性基因控制的。對該F2群體對應的抗性基因進行連鎖分析，結果表 明它們受同一顯性基因控制，因此，構建了由634個體組成的一個作圖群體(相當于1268 個配子體)。前期的遺傳分析表明Pik-h基因與Pik-m基因是等位的，而申請人所在的研究室 已經對 Pik-m 基因進行了精細定位(Li et al.2007, Molecular Breeding, 20 179-188)。因此，申請人利用Lietal(2007)開發的分子標記進行了連鎖分析。結果表明，在標記 K37和K25分別檢測出了 1個和22個重組體(圖3)。為了縮小Pik_h位點的染色體區 域并找到與之共分離的標記(沒有重組體的標記)，進一步在K37-K25區域內，從Li et al(2007)開發的標記中獲得了 5個多態性標記(K36，K34，K39，K33，K28)，并對上 述23個不同的重組體進行了連鎖分析。結果表明，除了在K28位點檢測出13個重組體 之外，其余4個標記都與Pik-h位點表現完全的共分離。因此，Pik-h位點最終被界定于 K37-K28之間的區域內，其中4個標記與之完全共分離。為了構建Pik-h位點的電子物理圖，把與之連鎖的標記通過生物信息學方法著陸 于水稻品種日本晴(Nipponbare)的參考序列上，并由此構建了該基因位點的重疊群。由 參考序列可以推測Pik-h位點被界定于側翼標記K37和K28之間約200kb的范圍內。實施例3 水稻稻瘟病抗性基因Pik-h候選基因的注釋及序列分析為了確定Pik-h的候選基因，申請人利用日本晴的參考序列，通過3種基因 預測軟件 RiceGAAS (http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)、Gramene (http://143.48.220.116/ resources/)和 Softberry 的 FGENESH(http://www.softberry.com)對目的基因區域進行了 基因預測及注釋分析，初步確定了 Pik-h的候選抗性基因為6個核苷酸結合位點和富亮氨 酸重復(nucleotidebinding site-leucine-rich repeat，NBS-LRR)的候選基因(Pikhl-NP， Pikh2-NP, Pikh3-NP, Pikh4_NP，Pikh5_NP，禾口 Pikh6_NP)。對6個候選基因進行基于基因特異性標記的存在/缺失(presence/absence，P/ Α)分析，結果表明，在日本晴參考序列存在的4個候選基因(Pikhl-NP，Pikh2-NP, Pikh3-NP, Pikh4-NP)在K3中是不存在的。因此，Pik_h的候選抗性基因只有Pikhl_K3 和Pikh2-K3，下一步將通過以下的基因功能互補實驗確認其功能(附圖3)。實施例4 水稻稻瘟病抗性基因Pik-h的遺傳互補實驗及轉化子的抗性鑒定首先，利用高保真酶phusion結合長片段PCR (long-range PCR, LR-PCR)技 術，以 K3 的總 DNA 為模板，根據或參考 Liuetal. (2007，Genetics, 176 2541-2549)和 Linetal. (2007，Genetics, 177 1871-1880)描述的實驗方法和程序，分別擴增、克隆了 Pikh-I和Pikh-2 ；并進行了遺傳互補實驗，結果表明，這2個候選基因都沒有在感病受 體品種 Q1063 (Linet al.，2007，Genetics, 177 1871-1880)中實現功能互補，見表 1 禾口 附圖4左。擴增、克隆Pikh-I的引物為正向引物TTTTGGCGCGCCGCCAGTGTCCACCAACCACAGTAATAAA；反向引物TTTTGGCGCGCCGAACAGCCTGAGGAAGCAGAACATCGTCo擴增、克隆Pikh-2的引物為正向引物TTTTGGCGCGCCGCAAGATCAGTACCATCACGAGTAATAGCA；反向引物TTTTGGCGCGCCAGGGACAGAATGACAGTGTAAGTGAGTTTG。當將上述2個候選基因拼接為一個整體的基因進行遺傳互補實驗時，則獲得了 功能互補的轉化體，見表1和附圖4右。利用轉化載體中的潮霉素基因(HPT)標記對轉 化體進行了 PCR檢測。檢測結果證明目的基因片段已經導入抗病轉化體中，而沒有導入 感病轉化體中，見附圖5。 表l.Pik-h 2個組成基因的遺傳互補實驗分析結果
權利要求
1.稻瘟病抗性基因Pik-h，其至少編碼a)和b)所述氨基酸序列中的一種，其中a)SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列；b)SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列。
2.如權利要求1所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.1或SEQ IDN0.2 所示。
3.權利要求1或2所述基因的cDNA序列。
4.權利要求1或2所述基因編碼的蛋白。
5.由權利要求1或2所述基因或權利要求3所述cDNA與啟動子構建的表達盒。
6.含有權利要求1或2所述基因或權利要求3所述cDNA的表達載體。
7.權利要求1或2所述基因、權利要求3所述cDNA、權利要求4所述蛋白、權利要 求5所述表達盒或權利要求6所述表達載體在制備轉基因植物中的應用。
8.權利要求1或2所述基因、權利要求3所述cDNA、權利要求4所述蛋白、權利要 求5所述表達盒或權利要求6所述表達載體在提高水稻抗稻瘟病中的應用。
9.根據權利要求1或2的所述基因產生的分子標記。
10.權利要求9所述的分子標記在水稻抗稻瘟病的輔助育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種稻瘟病抗性基因Pik-h及其應用。本發明提供了所述水稻稻瘟病抗性基因Pik-h的核苷酸序列及其編碼的氨基酸多肽序列，該序列包含有2個基因，都屬于CC-NBS-LRR抗性基因家族的成員，且皆為組成型表達的基因。本發明還提供了該基因在轉化水稻或其它植物培育抗病品種方面的應用以及根據該基因序列產生的分子標記在育種中的應用。
文檔編號C12N15/29GK102021176SQ20101010569
公開日2011年4月20日 申請日期2010年2月2日 優先權日2010年2月2日
發明者林菲, 潘慶華, 王玲, 翟純, 董忠秋 申請人:華南農業大學