專利名稱：鴨出血性卵巢炎病毒毒株、滅活疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種病毒毒株及滅活疫苗，尤其涉及一種鴨出血性卵巢炎病毒毒株、 滅活疫苗及其制備方法，屬生物工程技術領域。
背景技術：
鴨出血性卵巢炎(Duck Hemorrhagic, DH)是新近流行的、急性、高度接觸性的一種鴨傳染病，其病原為鴨出血性卵巢炎病毒(Duck Hemorrhagic Ovaritis Virus, DHOV), 在病毒分類上屬于黃病毒科的成員，感染不同日齡鴨，引起鴨卵巢出血，產蛋下降，卵巢、睪丸、輸卵管和輸精管萎縮，商品肉鴨死淘率增加。自2010年6月，該病在中國廣東、廣西、福建、江西、浙江、安徽、江蘇、山東、河北和北京等地區發生以來，鴨出血性卵巢炎已經成為近期危害中國養鴨業的主要疫病之一。該病毒主要危害蛋鴨(紹興鴨、縉云麻鴨、山麻鴨、金定鴨、康貝爾鴨、臺灣白改鴨等)、肉種鴨 (櫻桃谷鴨、北京鴨等)、野鴨種鴨。受染鴨群幾乎100%發病，死亡率為5% 30%不等。疾病潛伏期短，發病急，病毒感染鴨群后3 5天可導致鴨群采食量和產蛋量急劇下降，鴨群甚至絕產。約200日齡鴨群的產蛋量恢復到發病前的水平需要30天或者更長的時間，部分大日齡鴨群發病后由于生產性能下降而淘汰。種鴨發病后種蛋的受精率和孵化率降低。商品肉鴨感染后死淘率明顯增加。因此，該病給養鴨業帶來巨大的經濟損失，這使得養鴨業一度陷入絕境。在病毒分類地位的研究中，曹貞貞、張存等人通過對鴨出血性卵巢炎病毒與黃病毒屬恩塔亞病毒群(Ntay a virus group，NTAV群)和乙型腦炎病毒群(Japanese encephalitis virus group, JEV群)中選NSl序列已知的病毒進行序列同源性分析和進化分析，發現該病毒與黃病毒科黃病毒屬的巴格扎病毒的遺傳距離位于病毒分類學種的水平。蘇敬良、萬春和、施少華等人的研究也表明分離獲得的引起種(蛋)鴨產蛋驟降新病毒的核苷酸序列第9-777位與坦布蘇病毒(TMUV)的同源性最高，為88. 7% ；遺傳進化分析表明 WR株病毒與坦布蘇病毒、圣路易斯腦炎病毒(SLEV)、以色列火雞腦膜炎病毒(ITV)、恩塔亞病毒(NTAV)具有相似的祖先。在診斷方面，曹貞貞、萬春和、蘇敬良、滕巧泱等人報道可以采用臨床癥狀、大體及組織病理變化、PCR擴增和病毒分離等方法確診該病。但是目前由于沒有找到較好疫苗株、 大規模和高效價培養病毒的實驗室宿主、疫苗評價模型尚未建立，制約著目前疫苗的開發。因此，目前養鴨業亟需一種免疫效果好的鴨出血性卵巢炎疫苗。
發明內容
本發明目的之一是提供一種鴨出血性卵巢炎病毒毒株，以便為研制免疫效果好的鴨出血性卵巢炎疫苗奠定基礎；
本發明目的之二是提供一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗； 本發明目的之三是提供所述鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的制備方法。
本發明所述病毒毒株命名為黃病毒屬鴨出血性卵巢炎病毒HB株，采用常規方法接種敏感鴨胚分離獲得，保藏號為CCTCC V201122 ；所述鴨出血性卵巢炎病毒是ssRNA病毒，有囊膜；病毒顆粒大體呈球狀，直徑40 60nm ；所述病毒對外界環境的抵抗力較強， 在4°C中存放幾周，在_20°C中存放幾個月，其感染力均不受影響；所述病毒對乙醚、氯仿敏感；大多數去污劑能將它迅速滅活；在37°C條件下，用0. 福爾馬林熏蒸他便可把它滅活；所述病毒不能凝集雞、鴨、火雞的紅細胞，可以凝集1%鴿紅血球；所述病毒可在9 13 日齡鴨胚尿囊腔、胚絨毛尿囊膜，9 10日齡雞胚尿囊腔、胚絨毛尿囊膜，6日齡雞胚卵黃囊，7 8日齡鴨胚卵黃囊中培養，也可在鴨胚成纖維細胞、BHK21細胞和Vero細胞上培養。一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗，所述滅活疫苗由鴨出血性卵巢炎病毒經接種、收獲、滅活、濃縮和乳化而得，所述鴨出血性卵巢炎病毒毒株為黃病毒屬鴨出血性卵巢炎病毒 HB 株，保藏號為 CCTCC V201122。一種制備上述鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，它將鴨出血性卵巢炎病毒接種于敏感鴨胚，收獲含毒鴨胚組織液，經甲醛溶液滅活、濃縮和乳化制得；具體步驟如下
a.接種將鴨出血性卵巢炎病毒經尿囊腔途徑按照IO2 IO4ELD5tl/枚的劑量接種于 10 13日齡敏感鴨胚，37°C孵育；
b.收獲收獲接種后48 120小時死亡且病痕明顯的鴨胚胚體、絨毛尿囊膜和尿囊液，20000r/min搗碎2min，反復凍融2次，存于_20°C即為鴨胚組織液；按照《中華人民共和國獸藥典》(二〇一〇年版三部)附錄7規定的半數致死量、半數感染量測定方法，進行病毒含量測定，增殖病毒效價應彡106 0ELD50/0. Iml ；
c.滅活向鴨胚組織液中加入質量濃度為37%的甲醛液并使其最終含量達0.08% 0. 2%，搖勻，37°C滅活16 36小時或4°C滅活5 7天；
d.乳化
水相制備將上述滅活病毒組織液采用3500r/min離心15min、棄沉渣，上清液用無菌 0. IM pH7. 2的PBS稀釋1 3倍，再用50KD膜包進行濃縮至原體積，如此反復2 4次，處理滅活的鴨胚組織液甲醛殘留量不大于0. 1%，總蛋白含量不大于40(^g/ml，按(V/V) 4% 6%加入無菌吐溫-80，攪拌均勻，即為水相；
油相制備在進口白油中按(W/V) 0. 8% 2. 0%加入硬脂酸鋁，按(V/V) 4%加入司本-80，滅菌后即為油相；
將水相和油相按1:1. 67 1:3比例混合乳化，即成鴨出血性卵巢炎滅活疫苗，病毒含量不低于IO6 tlELD5tl/羽份。本發明提供的另一種制備上述鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法是
它將鴨出血性卵巢炎病毒接種于鴨胚成纖維細胞，收獲含毒細胞，經甲醛溶液滅活、濃縮和乳化制得；具體按如下步驟進行
a.接種將鴨出血性卵巢炎病毒細胞適應毒按0.02% 1%的比例接種于鴨胚成纖維細胞單層；
b.收獲接種后72 96小時產生細胞病變(CPE)達到80% 90%時收獲細胞，并將盛有收獲細胞沉淀的無菌燒杯放在0°C冰浴中用細胞裂解儀于85%功率條件下裂解30s/ 次，裂解3次，-20°C凍存即為病毒細胞裂解液；按照《中華人民共和國獸藥典》(二〇一〇 年版三部)附錄7半數致死量、半數感染量測定方法進行病毒含量測定，增殖病毒效價應≥106 0TCID50/0. Iml ；
c.滅活向上述病毒細胞裂解液中加入質量濃度為37%的甲醛液并使其最終含量達 0. 05% 0. 12%，搖勻，37°C滅活16 36小時或4°C滅活5 7天； d乳化
水相制備將上述滅活病毒組織液采用3500r/min離心15min，棄沉渣，上清液用無菌 0. IM pH7. 2的PBS稀釋1倍，再用50KD膜包進行濃縮至原體積，如此反復2 4次，滅活的細胞培養液甲醛殘留量不大于0. 1%，總蛋白含量不大于40(^g/ml ；并按V/V加入4% 6% 無菌吐溫-80，攪拌均勻，即為水相；
油相制備在進口白油中按(W/V)0. 8% 2. 0%加入硬脂酸鋁，按(V/V)4%加入司本-80， 滅菌后為油相；
將水相和油相按1:1. 67 1:3比例混合乳化，即成鴨出血性卵巢炎滅活苗，檢測其病毒含量不低于IO6 tlTCID5ci/羽份。本發明所述疫苗具有以下特點
所述疫苗采用進口白油作為油佐劑制備，黏度小、穩定性好，在37°C保存3個月，4°C存放12個月，未出現分層、變色等異常；
安全全性好，采用2倍使用劑量免疫鴨，觀察2周，精神狀態、采食量和蛋鴨產蛋量等均未見任何異常；
免疫應答產生迅速，免疫持續期長，將其免疫鴨，10天內產生免疫應答，2周內即可產生較強的免疫力，免疫期至少5個月，攻毒保護率> 80% ；
應用該疫苗的產蛋鴨場未發生明顯的與該病相關的采食量和產蛋下降等異常臨床表現，商品肉鴨死淘率明顯下降，屠宰后特級率提高；
研究結果表明，本發明疫苗穩定、安全、有效。為該病的防治提供一種切實可行的滅活疫苗。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
做進一步的說明，這些實例僅用于說明，而不用于限制本專利的保護范圍。本發明所述病毒毒株命名為黃病毒屬鴨出血性卵巢眼病毒HB株，于2011年07月 01日保藏在中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC V201122 ；所述病毒是 ssRNA病毒，有囊膜；病毒顆粒大體呈球狀，直徑40 60nm ；所述病毒對外界環境的抵抗力較強，在4°C中存放幾周，在-20°C中存放幾個月，其感染力均不受影響；所述病毒對乙醚、 氯仿敏感；大多數去污劑能將它迅速滅活；在37°C條件下，用0. 福爾馬林熏蒸他便可把它滅活；所述病毒不能凝集雞、鴨、火雞的紅細胞，可以凝集1%鴿紅血球；所述病毒可在 9 13日齡鴨胚尿囊腔、胚絨毛尿囊膜，9 10日齡雞胚尿囊腔、胚絨毛尿囊膜，6日齡雞胚卵黃囊，7 8日齡鴨胚卵黃囊中培養，也可在鴨胚成纖維細胞、BHK21細胞和Vero細胞上培養。實施例1
a.接種將鴨出血性卵巢炎病毒經尿囊腔途徑按照IO3ELD5tl/枚的劑量接種于10日齡敏感鴨胚，37°C孵育；b.收獲收獲接種后48 120小時死亡且病痕明顯的鴨胚胚體、絨毛尿囊膜和尿囊液，20000r/min搗碎2min，反復凍融2次，存于_20°C即為鴨胚組織液；按照《中華人民共和國獸藥典》(二〇一〇年版三部)附錄7規定的半數致死量、半數感染量測定方法，進行病毒含量測定，增殖病毒效價為107_ 1ELD5tlA). Iml ；
c.滅活向鴨胚組織液中加入質量濃度為37%的甲醛液并使其最終含量為0.2%，搖勻后37°C滅活16小時；
d.乳化
水相制備將上述滅活鴨胚組織液采用3500r/min離心15min棄沉渣，上清液用無菌 0. IM pH7. 2的PBS稀釋2倍，再用50KD膜包進行濃縮至原體積，如此反復4次，滅活的鴨胚組織液甲醛殘留量為0. 08%，總蛋白含量為38(^g/ml，并按(V/V) 6%加入無菌吐溫-80，攪拌均勻，即為水相；
油相制備在進口白油中按(W/V) 0.8%加入硬脂酸鋁，再按(V/V)4%加入吐溫-80，滅菌后即為油相；
將水相和油相按1:3比例混合乳化，即成鴨出血性卵巢炎滅活苗，病毒含量為 IO61ELD5tl/羽份。所述疫苗經性狀測定，為油包水類型，穩定性良好，粘度小，安全可靠。該疫苗在 4°C保存12個月不出現分層。安全檢驗采用2倍使用劑量免疫鴨，觀察2周，未見任何異常。效力檢驗試驗鴨接種本疫苗后10 14天產生免疫力，免疫期為5個月，免疫期內的攻毒保護率為80%。實施例2
a.接種將鴨出血性卵巢炎病毒細胞適應毒按0.1%的比例接種于鴨胚成纖維細胞單
層；
b.收獲接種后72 96小時產生細胞病變(CPE)達到80% 90%時收獲細胞，并將盛有收獲細胞沉淀的無菌燒杯放在0°C冰浴中用細胞裂解儀于85%功率條件下裂解30s/次， 裂解3次，-20°C凍存即為病毒細胞裂解液；按照《中華人民共和國獸藥典》(二〇一〇年版三部)附錄7規定的半數致死量、半數感染量測定方法進行病毒含量測定，增殖病毒效價為 106· 5TCID50/0. Iml ；
c.滅活向病毒細胞裂解液中加入質量濃度為37%的甲醛液并使其最終含量達0.1%， 搖勻后4°C滅活7天；
d乳化
水相制備將上述滅活病毒細胞裂解液采用3500r/min離心15min棄沉渣，上清液用無菌0. IM pH7. 2的PBS稀釋1倍，再用50KD膜包濃縮至原體積，如此反復2次，滅活的細胞裂解液甲醛殘留量為0. 06%,總蛋白含量為20(^g/ml ；并按(V/V) 6%加入無菌吐溫-80， 攪拌均勻，即為水相；
在進口白油中按(W/V) 2.0%加入硬脂酸鋁，再按(V/V) 4%加入司本-80，滅菌后即為油
相；
將水相和油相按1:1.67比例混合乳化，即成鴨出血性卵巢炎滅活苗，病毒含量不低于 IO6 qTCID5q/羽份。
該疫苗經性狀測定，為油包水類型，穩定性良好，粘度小，安全可靠。該疫苗在4°C 保存12個月不出現分層。安全檢驗采用2倍使用劑量免疫鴨，觀察2周，未見任何異常。效力檢驗試驗鴨接種本疫苗后10 14天產生免疫力，免疫期為5個月，免疫期內的攻毒保護率為80%。
權利要求
1.一種鴨出血性卵巢炎病毒毒株，其特征在于，所述病毒毒株命名為黃病毒屬鴨出血性卵巢炎病毒HB株，保藏號為CCTCC V201122 ；所述病毒是ssRNA病毒，有囊膜；病毒顆粒大體呈球狀，直徑40 60nm ；所述病毒對外界環境的抵抗力較強，在4°C中存放幾周， 在-20°C中存放幾個月，其感染力均不受影響；所述病毒對乙醚、氯仿敏感；大多數去污劑能將它迅速滅活；在37°C條件下，用0. 福爾馬林熏蒸他便可把它滅活；所述病毒不能凝集雞、鴨、火雞的紅細胞，可以凝集1%鴿紅血球。
2.一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗，其特征在于，所述滅活疫苗由鴨出血性卵巢炎病毒經接種、收獲、滅活、濃縮和乳化而得，所述鴨出血性卵巢炎病毒毒株為黃病毒屬鴨出血性卵巢炎病毒HB株，保藏號為CCTCC NO :V201122。
3.一種制備如權利要求2所述得鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，其特征在于，它將鴨出血性卵巢炎病毒接種于敏感鴨胚，收獲含毒鴨胚組織液，經甲醛溶液滅活、濃縮和乳化制得；具體步驟如下a.接種將鴨出血性卵巢炎病毒經尿囊腔途徑按照IO2 IO4ELD5tl/枚的劑量接種于 10 13日齡敏感鴨胚，37°C孵育；b.收獲收獲接種后48 120小時死亡且病痕明顯的鴨胚胚體、絨毛尿囊膜和尿囊液，20000r/min搗碎2min，反復凍融2次，存于_20°C即為鴨胚組織液；按照中華人民共和國獸藥典、二〇一〇年版三部附錄7規定的半數致死量、半數感染量測定方法，進行病毒含量測定，增殖病毒效價應彡106 0ELD50/0. Iml ；c.滅活向鴨胚組織液中加入質量濃度為37%的甲醛液并使其最終含量達0.08% 0. 2%，搖勻，37°C滅活16 36小時或4°C滅活5 7天；d.乳化水相制備將上述滅活鴨胚組織液采用3500r/min離心15min、棄沉渣，上清液用無菌 0. IM pH7. 2 PBS稀釋1 3倍，再用50KD膜包進行濃縮至原體積，如此反復2 4次，處理滅活的鴨胚組織液甲醛殘留量不大于0. 1%，總蛋白含量不大于40(^g/ml，按(V/V)4% 6% 加入無菌吐溫-80，攪拌均勻，即為水相；油相制備在進口白油中按(W/V)0. 8% 2. 0%加入硬脂酸鋁，按(V/V) 4%加入司本-80，滅菌后即為油相；將水相和油相按1:1. 67 1:3比例混合乳化，即成鴨出血性卵巢炎滅活疫苗，其病毒含量不低于IO6 tlELD5tl/羽份。
4.一種制備如權利要求2所述滅活疫苗的方法，其特征在于，它將鴨出血性卵巢炎病毒接種于鴨胚成纖維細胞，收獲含毒細胞，經甲醛溶液滅活、濃縮和乳化制得；它按如下步驟進行a.接種將鴨出血性卵巢炎病毒細胞適應毒按0.02% 1%的比例接種于鴨胚成纖維細胞單層，b.收獲接種后72 96小時產生細胞病變(CPE)達到80% 90%時收獲細胞，并將盛有收獲細胞沉淀的無菌燒杯放在0°C冰浴中用細胞裂解儀于85%功率條件下裂解30s/次， 裂解3次，-20°C凍存即為病毒細胞裂解液；按照《中華人民共和國獸藥典》(二〇一〇年版三部)附錄7規定的半數致死量、半數感染量測定方法進行病毒含量測定，增殖病毒效價應彡 106 0TCID50/0. Iml ；c.滅活向上述病毒細胞裂解液中加入質量濃度為37%的甲醛液并使其最終含量達 0. 05% 0. 12%，搖勻，37°C滅活16 36小時或4°C滅活5 7天； d乳化水相制備將上述滅活病毒組織液采用3500r/min離心15min，棄沉渣，上清液用無菌 0. 1Μ、ρΗ 7. 2的PBS稀釋1倍，再用50KD膜包進行濃縮至原體積，如此反復2 4次，滅活的細胞培養液甲醛殘留量不大于0. 1%，總蛋白含量不大于40(^g/ml ；并按(V/V)4% 6%加入無菌吐溫-80，攪拌均勻，即為水相；油相制備在進口白油中按(W/V)0. 8% 2. 0%加入硬脂酸鋁，按(V/V)4%加入司本-80， 滅菌后為油相；將水相和油相按1:1. 67 1:3比例混合乳化，即成鴨出血性卵巢炎滅活苗，檢測其病毒含量不低于IO6 tlTCID5ci/羽份。
全文摘要
一種鴨出血性卵巢炎病毒毒株、滅活疫苗及其制備方法，所述鴨出血性卵巢炎病毒命名為黃病毒屬鴨出血性卵巢炎病毒HB株，保藏號為CCTCC V201122；所述病毒是ssRNA病毒，有囊膜；病毒顆粒大體呈球狀，直徑40～60nm；所述病毒對乙醚、氯仿敏感；大多數去污劑能將它迅速滅活；在37℃條件下，用0.1％福爾馬林熏蒸6h便可把它滅活；鴨出性卵巢炎病毒不能凝集雞、鴨、火雞的紅細胞，可以凝集1%鴿紅血球。所述滅活疫苗由所述鴨出血性卵巢炎病毒毒株經接種、收獲、滅活、濃縮和乳化而得。所述疫苗具有安全性好、免疫應答產生迅速、免疫持續期長等優點。
文檔編號C12N7/00GK102304494SQ20111025511
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月31日 優先權日2011年8月31日
發明者何平有, 劉月煥, 徐倩倩, 楊保收, 林健, 梁武, 潘潔, 郁宏偉, 韓春華 申請人:北京市農林科學院畜牧獸醫研究所, 瑞普(保定)生物藥業有限公司