專利名稱：稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記及其方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于農業生物技術領域，特別涉及一種稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記Pia-C-FNP及其方法與應用。
背景技術：
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有一半以上的人口以稻米為主食。由稻痕病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻痕病是對水稻生產危害最嚴重的病害之一,每年都造成嚴重的糧食損失。從環境保護與農業可持續發展的觀點來看，抗病品種的育成與利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。傳統的水稻抗性育種依賴于抗性表型的鑒定，這不僅要求育種者必須具備豐富的接種、調查經驗，而且還容易受到環境以及人為因素的影響，鑒定 結果容易造成誤差，目標基因的選擇效率往往較低。隨著分子標記技術的產生以及利用，其方便、直接、不受環境影響等優點使得該技術的應用價值及前景越來越受到關注。在育種方面，通過開發與目標基因緊密連鎖的分子標記，特別是在基因內部開發其功能特異性的分子標記來對目標基因進行選擇，不僅選擇可靠性高，而且還大大加快了育種步伐。水稻稻痕病抗病基因Pia被定位于第11染色體短臂端(Zeng et al. 2011.Characterization and fine mapping of the rice blast resistance gene Pia.Science China Life Sciences 54:372-378)上，并已成功地被克隆(Okuyama et al. 2011.A multifaceted genomics approach allows the isolationof the rice Pia-blastresistance gene consisting of two adjacent NB S-LRR protein genes. Plant Journal66:467-479)。此外，申請人通過圖位克隆方法(Map-based cloning),在水稻供體品種C039(Zeng et al. 2011. SCIENCE CHINA 54:372-378)中分離、鑒定到了一個具有獨特抗譜的稻瘟病抗性基因Pia-C。對Pia-C的序列分析過程中發現，在包含Pia-C位點的基因組區域中，Pia-C供體品種C039與Pia的供體品種AichiAsahi具有相似的基因組結構，即與參考序列日本晴之間存在著大片段的插入/缺失。進一步的功能互補實驗結果證明了 Pia-C屬于Pia的等位基因(申請人未發表數據)。研究表明，Pia-C基因的稻瘟病抗性須由2個相鄰的NBS-LRR類型的抗病基因共同介導。同時，在水稻群體中，包含該基因的基因組區域存在著基因型的分化，即當相鄰的2個功能性的NBS-LRR基因同時存在時，該基因型定義為A型；當相鄰的2個功能性的NBS-LRR基因同時不存在時，該基因型定義為N型(基因型與感病水稻參考品種日本晴的相同)。進一步地，在功能性A型品種中，當相鄰的2個功能性的NBS-LRR基因結構和功能與Pia相似時，該基因型定義為A型；當相鄰的2個功能性的NBS-LRR基因結構和功能與Pia-C相似時，該基因型定義為C型。Pia-C型所具有的獨特抗譜，使之可以廣泛地應用于稻瘟病抗性育種計劃中。因此，為了加快Pia-C在抗病育種工作中的應用，如在大量的水稻種質資源中篩選、鑒定該功能性抗性基因，以及在分子標記輔助選擇育種、抗性基因Pia-C與其他功能基因的聚合育種、以及轉基因育種等，開發出準確有效的Pia-C功能特異性分子標記顯得尤其重要。
發明內容
為了克服現有技術的不足和缺點，本發明的首要目的是提供一種稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記Pia-C-FNP。本發明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記Pia-C-FNP的檢測方法。本發明的再一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記Pia-C-FNP 的應用。本發明目的通過以下技術方案實現一種稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記Pia-C-FNP，它由Pia-C-IFNP和 Pia-C-2FNP組合而成，分別由引物對SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2，以及SEQ ID NO: 3和SEQ ID N0:4從水稻總DNA中擴增出來的核苷酸序列，分別經特異性酶切之后電泳檢測，與稻瘟病抗性基因Pia-C呈特異性帶型的分子標記；所述引物對的核苷酸序列如下所示SEQ ID NO. I (5，_3，)TGCAAGCTAATGGCTGGTCGA ；SEQ ID NO. 2 (5’ _3，)TAGACTGGTGTAGTTGCGGAC ；SEQ ID NO. 3 (5’ _3，)GTGCAGTCCTGATCAGTACTC ；SEQIDN0. 4 (5’ _3’)AGAGCCACCAGGCGAACAG ；所述的水稻品種為C039 ；所述稻瘟病抗性基因Pia-C包括2個編碼NBS-LRR類蛋白的基因Pia_C_l和Pia-C-2, 2個編碼基因的DNA序列分別如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示；所述的稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記Pia-C-FNP的檢測方法，通過對多個水稻稻瘟病抗性基因Pia-C的等位基因序列與SEQ ID NO. 5及SEQID NO. 6做比對的方法，分析得到能區別于其等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pia-C功能特異性的一對單堿基差異(single nucleotide polymorphism, SNP),再通過設計分別得到 SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2，以及SEQ ID NO. 3和SEQID NO. 4引物，分別對水稻基因組DNA進行擴增、 酶切，分別得到Pia-C功能特異性分子標記Pia-C-IFNP和Pia_C_2FNP，二者組合為Pia-C功能特異性分子標記Pia-C-FNP。優選的，所述的稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記Pia-C-FNP的檢測方法，包括以下步驟(I)通過常規PCR法擴增，獲得多個A型和C型水稻品種的Pia-C等位基因的編碼區DNA序列。(2)利用多序列比對軟件工具(http://multalin. toulouse. inra. fr/multalin/)，將步驟(I)所獲得的序列翻譯成蛋白質序列后進行比對，得到Pia-C型抗性基因所特異的2個SNP，分別位于Pia-C組成基因中的Pia-C-I的NB區域和Pia_C_2的LRR區域，最終導致功能特異性氨基酸的改變；(3)根據步驟(2)所得到的2個SNP，分別設計出引物對SEQ ID NO. I和SEQ IDNO. 2，以及SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4 ;并用這2組引物分別對不同水稻品種的總DNA進行PCR擴增反應，得到擴增產物A和擴增產物B ;然后分別對擴增產物進行酶切、電泳，比較驗證，分別獲得與稻瘟病抗性基因Pia呈特異性帶型的核苷酸片段Pia-C-IFNP和Pia-C-2FNP ；。(4)對步驟(3)所獲得的分子標記在不同水稻品種中進行驗證，從而確定Pia-C抗性基因的功能特異性的分子標記Pia-CFNP。更優選的，步驟(I)中所述的水稻品種為C039、C101LAC、Aichi Asahi 以及 Dongnong363 ;
步驟(2)中所述的序列比對優選為將核苷酸序列翻譯成蛋白質序列后進行比對；步驟(3)中所述的擴增產物A的大小為128bp，Sail酶切后大小仍為128bp，表明為C型(相鄰的2個功能性的NBS-LRR基因結構和功能與Pia-C相似);擴增產物A經過SalI酶切后為lllbp，表明為A型(相鄰的2個功能性的NBS-LRR基因結構和功能與Pia相似)；步驟(3)中所述的擴增產物B的大小為137bp，Pvu II酶切后大小仍為137bp，表明為A型；Pvu II酶切后大小為83bp，表明為C型；步驟(3)中在Pia-C-I的SNP處,根據dCAPS標記的設計原理,設計帶有錯配堿基的功能特異性引物Pia-C-IFNP-F JBSEQ ID NO. I所示；在該SNP下游100_200bp處設計功能特異性下游引物Pia-C-IFNP-R，如SEQ ID NO. 2所示；根據CAPS標記的設計原理，在在Pia-C-2的SNP上游60-100bp處設計功能特異性上游引物Pia-C_2FNP_F，如SEQ ID NO. 3所示；在上述SNP下游60-100bp處設計功能特異性下游引物Pia-C-2FNP-R，如SEQ ID NO. 4所示。步驟(3)中所述的PCR擴增反應，其中擴增產物A的PCR擴增反應體系如下
權利要求
1.一種稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記Pia-C-FNP，其特征在于它由Pia-C-IFNP和Pia-C-2FNP組合而成；分別通過引物對SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2，以及SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4從水稻總DNA中擴增出來的核苷酸序列，并經特異性酶切之后，與稻瘟病抗性基因Pia-C呈特異性帶型的分子標記； 所述引物對SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2，以及SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 4的核苷酸序列如下所示SEQ ID NO. I :5’ -TGCAAGCTAATGGCTGGTCGA-3’ ；SEQ ID NO. 2 :5’ -TAGACTGGTGTAGTTGCGGAC-3’ ；SEQ ID NO. 3 :5’ -GTGCAGTCCTGATCAGTACTC-3’ ；SEQ ID NO. 4 :5’ -AGAGCCACCAGGCGAACAG-3’。
2.根據權利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記Pia-C-FNP，其特征在于所述的水稻為水稻品種C039。
3.根據權利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記Pia-C-FNP，其特征在于所述的稻瘟病抗性基因Pia-C包括2個編碼NBS-LRR類蛋白的基因Pia-C-I和Pia-C-2, 2個編碼基因的DNA序列分別如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示。
4.根據權利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pia-C的功能特異性分子標記Pia-C-FNP，其特征在于所述的特異性酶切為通過SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2擴增得到的PCR產物使用SalI酶切；通過SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4擴增得到的PCR產物使用Pvu II酶切。
5.權利要求I 4任一項所述的稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記的檢測方法，其特征在于通過對多個水稻稻瘟病抗性基因Pia-C的等位基因序列與SEQ ID NO. 5及SEQ ID NO. 6序列做比對的方法，分析得到能區別于其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pia-C功能特異性的一個對單堿基差異，再通過設計分別得到SEQ ID NO. I和SEQID NO. 2，以及SEQ ID NO. 3和SEQID NO. 4引物，對水稻DNA擴增，分別得到Pia-C功能特異性分子標記Pia-C-IFNP和Pia-C-2FNP。
6.根據權利要求5所述的稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記的檢測方法，其特征在于包含了以下步驟 (1)通過常規PCR法擴增，獲得多個A型和C型水稻品種的Pia-C等位基因的編碼區DNA序列； (2)利用多序列比對軟件工具，將步驟(I)所獲得的序列翻譯成蛋白質序列后進行比對，得到Pia-C型抗性基因所特異的2個SNP，分別位于Pia-C組成基因中的Pia-C-I的NB區域和Pia-C-2的LRR區域，最終導致功能特異性氨基酸的改變； (3)根據步驟(2)所得到的2個SNP，分別設計出引物對SEQID NO. I和SEQ ID NO. 2，以及SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4 ;并用這2組引物分別對不同水稻品種的總DNA進行PCR擴增反應，得到擴增產物A和擴增產物B ;然后分別對擴增產物進行酶切、電泳，比較驗證，分別獲得與稻瘟病抗性基因Pia呈特異性帶型的核苷酸片段Pia-C-IFNP和Pia_C_2FNP ； (4)對步驟(3)所獲得的分子標記在不同水稻品種中進行驗證，從而確定Pia-C抗性基因的功能特異性的分子標記Pia-CFNP。
7.根據權利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記的檢測方法，其特征在于步驟(I)中所述的水稻品種為C039、C101LAC、AichiAsahi以及Dongnong 363。
8.根據權利要求6所述的瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記的檢測方法，其特征在于 步驟(3沖所述的PCR擴增反應，其中擴增產物A的PCR擴增反應體系如下IO X PCR緩沖液 l、2.5mM dNTP 2. O u IUOyM 引物 SEQ ID NO. Ilu l、10iiM 引物 SEQ ID NO. 21 u I、5U/ u I TaqDNA聚合酶0. I u l、50ng/ u I DNA模板I y I、雙蒸水補至20 u I ；PCR的反應條件如下94°C 3分鐘；94°C 30秒、56°C 30秒、72°C 30秒，35個循環；72°C 5分鐘；10°C保存； 步驟(3沖所述的PCR擴增反應，其中擴增產物B的PCR擴增反應體系如下10 X PCR緩沖液1,2. 5mM dNTP 2. 0 u l、10iiM引物SEQ ID NO. 31 u l、10iiM引物SEQ ID NO. 41 u I、5U/ u I TaqDNA聚合酶0. I u l、50ng/ u I DNA模板I y I、雙蒸水補至20 u I ；PCR的反應條件如下94°C 3分鐘；94°C 30秒、63°C 30秒、72°C 30秒，35個循環；72°C 5分鐘；10°C保存。
9.根據權利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記的檢測方法，其特征在于 步驟(3)中所述的擴增產物A的大小為128bp，Sail酶切后大小仍為128bp，表明為功能性C型；擴增產物A經過SalI酶切后為lllbp，表明為功能性A型； 步驟(3)中所述的擴增產物B的大小為137bp，Pvu II酶切后大小仍為137bp，表明為功能性A型；Pvu II酶切后大小為83bp，表明為功能性C型。
10.權利要求I 4任一項所述的稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記Pia-C-FNP的應用，其特征在于利用所述的稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記Pia-C-FNP在大量的水稻種質資源中篩選、鑒定該功能性抗性基因，以及在分子標記輔助選擇育種、基因聚合育種以及轉基因育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記及其方法與應用。該分子標記由Pia-C-1FNP和Pia-C-2FNP組成。本發明通過對多個水稻稻瘟病抗性基因Pia-C的等位基因序列與SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6序列做比對的方法，分析得到能區別于其他感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因功能特異性的一對單堿基差異。再通過設計，分別得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4引物，對水稻DNA擴增，分別得到Pia-C功能特異性分子標記Pia-C-1FNP和Pia-C-2FNP，二者組合則可準確地檢測功能性的Pia-C。本發明可在大量的水稻種質資源中篩選、鑒定該功能性抗性基因，以及在分子標記輔助選擇育種、基因聚合育種以及轉基因育種中的得到應用。
文檔編號C12N15/11GK102676512SQ20121016452
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月23日 優先權日2012年5月23日
發明者張玉, 林菲, 潘慶華, 潘金媚, 王玲 申請人:華南農業大學