專利名稱：微生物催化制備2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物催化法制備2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺的方法，以及在生產過程中用到的新菌株。
背景技術：
2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺,英文名 2-amino_2, 3_dimethylbutyamide,外觀為白色片狀晶體，熔點為84°C，能溶于水和大多數有機溶劑。是咪唑啉酮類超高效除草劑如咪唑乙煙酸、咪唑喹啉酸和甲氧咪草煙等的通用中間體，市場需求廣闊。其中咪唑乙煙酸和咪唑喹啉酸曾占據美國大豆除草劑市場主導地位達10年之久；而我國自從1990年大批量進口咪唑乙煙酸并在黑龍江省大面積應用以來，用量持續增加。特別是在國內該除草劑產品問世以后，由于其價格低廉，除草效果良好，故而被大范圍使用，成為黑龍江與內蒙古地區大豆田除草劑的主導品種。2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺目前主要通過化學法生產。其生產過程可分為兩個部分3-甲基-2-丁酮通過斯特雷克(Strecker)反應得到氨基腈，后者在酸或堿催化下水解
得到產物(見下式)。
權利要求
1.一種微生物催化法制備2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺的方法，所述方法包括在以2-氨基-2，3-二甲基丁腈為底物，以小球諾卡氏菌(Nocardia globerula) CCTCC No:M209214發酵產生的腈水合酶為催化劑的反應體系中，于pH6. (TlO. 0、2(T40°C下進行催化水合反應，制得所述的2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述反應在水或pH6.(TlO. O的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中進行。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述反應體系中底物初始濃度為O.03、. 3Μ。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述腈水合酶來自小球諾卡氏菌CCTCCNo:Μ209214經發酵獲得的含酶菌體細胞，所述含酶菌體細胞在反應體系中添加量以含酶細胞濕重計為5 50g/L。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述含酶菌體細胞由如下方法制備得到 (1)將經斜面活化的小球諾卡氏菌CCTCCNo M209214接入種子培養基中，于2(T40°C下培養24 48h，獲得種子液；所述種子培養基終濃度組成如下葡萄糖5 20. Og/L，酵母浸出粉 2 8. Og/L，蛋白胨 Γ4. Og/L, KH2PO4O. 5 I. 5g/L, K2HPO4O. 5 I. 5g/L, NaClO. 5 3. 0g/L,己內酰胺 0. 5 2. 0g/L, MgSO4O. 05 0. 2g/L, CoCl2O. θΓθ. 05g/L, FeSO4O. 01 0. 05g/L，溶劑為水，pH 6. 0 8· O ； (2)將種子液以1 10%體積比接入產酶培養基中，于2(T40°C下培養48 96h，培養得到的發酵液經離心或膜分離，得所述含酶菌體細胞；所述產酶培養基終濃度組成如下蔗糖5. (TlO. 0g/L,檸檬酸鈉2. 0 5. 0g/L,牛肉膏2. 0 8. 0g/L,酵母粉2. 0 8. 0g/L,氯化鈉0. 5 2. 0g/L,磷酸二氫鉀 0. 5 2. 5g/L，氯化鈷 0. 005^0. 01g/L,氯化鐵 0. 005^0. 01g/L,氯化錳O. 005 O. 01g/L，誘導劑I. 0 3· 0g/L，溶劑為水，ρΗ6· 0 8· O ;所述誘導劑為下列之一谷氨酸鈉、2，2-二甲基環丙甲酰胺、己內酰胺、丙烯酰胺、乙酰胺或尿素。
6.如權利要求4或5所述的方法，其特征在于所述方法如下將所述含酶菌體細胞用生理鹽水洗滌后，懸浮于水或pH6. (TlO. O的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中，加入底物2-氨基-2，3-二甲基丁腈至底物濃度為0. 03 0. 3Μ，于15 40°C、10(T200rpm下反應l(T60min ;反應結束后，轉化液經分離純化得到所述2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述分離純化方法如下反應結束后，取轉化液12000rpm離心IOmin,收集上清液；加入粉末活性炭，加熱攪拌脫色30min后轉入真空抽濾裝置抽濾，得到脫色清液；脫色清液轉入旋轉蒸發儀，在真空度-0. IMpa，水浴加熱溫度4(T60°C、轉速6(Tl00rpm條件下減壓蒸發除去底物2-氨基-2，3- 二甲基丁腈和水，冷卻得到2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺粗品；將2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺粗品溶于2(T65°C的乙酸乙酯，加入體積為乙酸乙酯體積10%鹽析劑正己燒，于0 4°C保溫結晶；過濾，取濾渣用正己燒洗漆，干燥得到2-氨基_2，3- 二甲基丁酰胺晶體。
8.小球諾卡氏菌(Nocardiagloberula)ZJB_09141，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，430072，保藏編號CCTCCNo :M209214，保藏日期2009年9月27曰。
全文摘要
本發明公開了一種微生物法生產咪唑啉酮類超高效除草劑中間體2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及其過程中所用的菌株。本方法以2-氨基-2,3-二甲基丁腈為原料，以通過發酵培養微生物小球諾卡氏菌(Nocardia globerula)CCTCC NoM209214生產的腈水合酶為催化劑生產2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。本方法反應條件溫和，廢水排放少，環境友好；產率高，轉化時間短，成本低，易于實現工業化生產。
文檔編號C12R1/365GK102776252SQ20121023945
公開日2012年11月14日 申請日期2010年6月21日 優先權日2010年6月21日
發明者林志堅, 沈寅初, 鄭仁朝, 鄭裕國 申請人:浙江工業大學