專利名稱：芽孢桿菌同步高密度發酵工藝方法
技術領域：
本發明涉及一種芽孢桿菌的發酵工藝，尤其是一種操作方法簡單、可降低產品成本，適合大規模工業化生產的芽孢桿菌同步高密度發酵工藝方法。
背景技術：
近年來，在養殖飼料中添加抗生素用于預防腸道疾病已很普遍，雖然取得了一定的效果，但與此同時，不僅造成細菌耐藥性的增強，而且藥物的殘留也威脅畜禽、水產品的食用安全，甚至直接影響人體健康。為此，人們采用了能夠替代抗生素改善養殖環境、減少和預防畜禽腸道疾病、降低藥殘的微生態飼料添加劑。如微生態飼料添加劑中的芽孢桿菌，就可以消耗腸道游離氧形成厭氧環境促進腸道益生菌繁殖，產生多種酶，提高動物免疫力，并能通過飼料高溫制粒，對提高飼料利用率，改善養殖環境和水質等方面起到了明顯的作用。目前，在中國專利申請的公開文獻中，已經公開了兩篇關于高密度發酵芽孢桿菌工藝，其中一篇是在芽孢桿菌發酵過程中不斷流加鐵離子營養液來提高活菌含量；另一篇是通過在發酵過程中添加復合微量元素提高活菌含量，由于需微濾，操作過程繁瑣，不適合大規模工業化生產。也有文獻資料顯示枯草芽孢桿菌經過優化培養基其發酵活菌數最高可達400億/ml，但沒有進行大罐發酵生產，也沒有關于芽孢率的描述。而芽孢率直接影響產品干燥的得率，間接影響芽孢桿菌能否更多通過飼料高溫制粒以及生產成本，是非常關鍵的指標。
發明內容
本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種操作方法簡單、可降低產品成本，適合大規模工業化生產的芽孢桿菌同步高密度發酵工藝方法。本發明的技術解 決方案是:一種芽孢桿菌同步超高密度發酵方法，其特征是按照以下步驟進行:
a.發酵種子制備
在無菌環境下，將芽孢桿菌在培養基中培養，制備活菌數達到1(Γ20億/ml的芽孢桿菌液體種子，培養基為每升水中含有:胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖IOg及K2HPO4 3g ；
b.種子罐發酵
將芽孢桿菌液體種子接種到種子罐中,種子罐培養基計料體積與液體種子體積之比為500L:1000ml，培養基為每升水中含有:胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖IOg及K2HPO4 3g，121°C滅菌30min ;發酵培養工藝參數:溫度30°C，罐壓0.Γθ.15Mpa，PH=6.5 8.0自動調節，轉速60r / min，流量150m3 / h，發酵培養時間5 6h ；
c.發酵罐發酵
將經種子罐發酵培養的芽孢桿菌移種至發酵罐中培養，發酵罐中初始培養基由基為每升水中含有:大豆蛋白胨log、胰蛋白胨10g、酵母粉5g&K2HP042g，121°C滅菌30min，所述糖為每升水中含有麥芽糊精30g、葡萄糖10 g、MgS04l.5g、MnS04 0.8g、Zn SO4 0.2g, 121°C滅菌30min ;移種前調節轉速、流量為發酵罐所設定的最大值，設定時校正DolOO點；
移種后初始轉速、流量為最大值的60%，發酵工藝參數:溫度30°C，罐壓0.12Mpa，PH=7.0自動調節；當Do值降至60%時，按照每次增加轉速最大值的10%及流量最大值的10%調節轉速和流量，使Do值維持在60%以上，直至達到發酵罐所設定的最大值并維持轉速及流量為最大值繼續發酵；當Do降至50%時開始加糖，每半小時加一次糖，共加六次糖，每次加糖量均等，加糖總量與發酵罐中初始培養基中所加入糖的體積比為2:3 ;最后一次加糖后繼續培養；
d.菌體的收集
當芽孢形成90%以上時，降轉速至80r/min，流量200m3/h，將菌液離心分離，取菌泥。本發明通過全自動發酵在線監測溶氧來確定糖(復合碳源和促芽孢生成劑)的流加時間，達到芽孢桿菌的緩釋利用碳源，最終達到發酵液活菌數600億/ml以上，發酵24h芽孢率即可達90%以上，整齊飽滿。產品干燥收率達90%，降低了產品的生產成本。
具體實施例方式實施例1:
a.發酵種子制備
在局部100級的無菌環境下，將從國家菌種庫得到的產淀粉酶和蛋白酶的一株枯草芽孢桿菌(10035)在培養基中培養，制備IOOOml活菌數達到1(Γ20億/ml的芽孢桿菌液體種子，培養基為每升水中含有:胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖IOg及K2HPO4 3g ；
b.種子罐發酵`
將芽孢桿菌液體種子接種到I噸種子罐中，種子罐培養基計料體積為500L，培養基為每升水中含有:胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖IOg及K2HPO4 3g，121°C滅菌30min ;發酵培養工藝參數:溫度30°C，罐壓0.Γ0.15Mpa, PH=6.5 8.0自動調節，轉速60r / min，流量150m3 / h，發酵培養時間5 6h ；
c.發酵罐發酵
將經種子罐發酵培養的芽孢桿菌移種至5噸發酵罐中培養，發酵罐中初始培養基由基本培養基與糖構成，基本培養基計料體積為3000L，基本培養基為每升水中含有:大豆蛋白胨10g、胰蛋白胨10g、酵母粉58及K2HPO4 2g，121°C滅菌30min，所述糖為每升水中含有麥芽糊精 30g、葡萄糖 10、MgS040.5g> MnSO4 0.8g、Zn SO4 0.2g, 121°C滅菌 30min,滅菌后的糖為280L ;移種前調節轉速至220 r / min (發酵罐設定的最大值)，流量260 m3 / h (發酵罐設定的最大值)，設定時校正DolOO點；
移種后初始轉速132r / min,流量156 m3 / h，發酵工藝參數:溫度30°C，罐壓
0.12Mpa，PH=7.0自動調節；當Do值降至60%時，按照每次增加22 r / min調節轉速和增加26 m 3 / h調節流量，使Do值維持在60%以上，直至最大轉速220r / min及最大流量260 m 3 / h，并維持轉速及流量為最大值繼續發酵；此時無法通過調節流量和轉速維持Do在60%以上，當Do降至50%時開始加糖，每半小時加一次糖，共加六次糖，每次加糖量均等，加糖總量為420L，即每次加糖70L，最后一次加糖后繼續培養；
d.菌體的收集當芽孢形成90%以上時，降轉速為80r/min，流量200m3/h，將菌液離心分離，取菌泥，經檢測活菌數達600億/ml以上。菌體的收集干燥
取菌泥按質量比為1:0.5加入載體(普通淀粉)經高速混合后，再經搖擺 制粒，在真空干燥機上干燥，干燥溫度85°C，真空度為0.08 Mpa,時間為2h，
產品干燥收率達90%以上。實施例2:
a.發酵種子制備
在局部100級的無菌環境下，將從國家菌種庫得到的產淀粉酶和蛋白酶的一株枯草芽孢桿菌(10035)在培養基中培養，制備IOOOml活菌數達到1(Γ20億/ml的芽孢桿菌液體種子，培養基為每升水中含有:胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖IOg及K2HPO4 3g ；
b.種子罐發酵
將芽孢桿菌液體種子接種到I噸種子罐中，種子罐培養基計料體積為500L，培養基為每升水中含有:胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖IOg及K2HPO4 3g，121°C滅菌30min ;發酵培養工藝參數:溫度30°C，罐壓0.Γ0.15Mpa, PH=6.5 8.0自動調節，轉速60r / min，流量150m3 / h，發酵培養時間5 6h ；
c.發酵罐發酵
將經種子罐發酵培養的芽孢桿菌移種至10噸發酵罐中培養，發酵罐中初始培養基由基本培養基與糖構成，基本 培養基計料體積為6000L，基本培養基為每升水中含有:大豆蛋白胨10g、胰蛋白胨10g、酵母粉58及K2HPO4 2g，121°C滅菌30min，所述糖為每升水中含有麥芽糊精 30g、葡萄糖 10、MgS040.5g> MnSO4 0.8g、Zn SO4 0.2g, 121°C滅菌 30min,滅菌后的糖為280L ;移種前調節轉速至180 r / min (發酵罐設定的最大值)，流量520 m 3 / h (發酵罐設定的最大值)，設定時校正DolOO點；
移種后初始轉速108r / min，流量208 m3 / h，發酵工藝參數:溫度30°C，罐壓
0.12Mpa，PH=7.0自動調節；當Do值降至60%時，按照每次增加18 r / min調節轉速和增加52 m 3 / h調節流量，使Do值維持在60%以上，直至最大轉速180r / min及最大流量
520m 3 / h，并維持轉速及流量為最大值繼續發酵；此時無法通過調節流量和轉速維持Do在60%以上，當Do降至50%時開始加糖，每半小時加一次糖，共加六次糖，每次加糖量均等，加糖總量為420L，即每次加糖70L，最后一次加糖后繼續培養；
d.菌體的收集
當芽孢形成90%以上時，降轉速為80r/min，流量200m3/h，將菌液離心分離，取菌泥，經檢測活菌數達600億/ml以上。菌體的收集干燥
取菌泥按質量比為1:0.5加入載體(普通淀粉)經高速混合后，再經搖擺制粒，在真空干燥機上干燥，干燥溫度85°C，真空度為0.08 Mpa,時間為2h，產品干燥收率達90%以上。
權利要求
1.一種芽孢桿菌同步超高密度發酵方法，其特征是按照以下步驟進行: a.發酵種子制備 在無菌環境下，將芽孢桿菌在培養基中培養，制備活菌數達到1(Γ20億/ml的芽孢桿菌液體種子，培養基為每升水中含有:胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖IOg及K2HPO4 3g ； b.種子罐發酵 將芽孢桿菌液體種子接種到種子罐中,種子罐培養基計料體積與液體種子體積之比為500L:1000ml，培養基為每升水中含有:胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖IOg及K2HPO4 3g，121°C滅菌30min ;發酵培養工藝參數:溫度30°C，罐壓0.Γθ.15Mpa，PH=6.5 8.0自動調節，轉速60r / min，流量150m3 / h，發酵培養時間5 6h ； c.發酵罐發酵 將經種子罐發酵培養的芽孢桿菌移種至發酵罐中培養，發酵罐中初始培養基由基為每升水中含有:大豆蛋白胨log、胰蛋白胨10g、酵母粉5g&K2HP04 2g，121°C滅菌30min，所述糖為每升水中含有麥芽糊精30g、葡萄糖10、MgSO4L 5g、MnSO4 0.8g、Zn SO4 0.2g，121°C滅菌30min ;移種前調節轉速、流量為發酵罐所設定的最大值，設定時校正DolOO點； 移種后初始轉速、流量為最大值的60%，發酵工藝參數:溫度30°C，罐壓0.12Mpa，PH=7.0自動調節；當Do值降至60%時，按照每次增加轉速最大值的10%及流量最大值的10%調節轉速和流量，使Do值維持在60%以上，直至達到發酵罐所設定的最大值并維持轉速及流量為最大值繼續發酵；當Do降至50%時開始加糖，每半小時加一次糖，共加六次糖，每次加糖量均等，加糖總量與發酵罐中初始培養基中所加入糖的體積比為2:3 ;最后一次加糖后繼續培養； d.菌體的收集 當芽孢形成90%以上時，降轉速至80r/min，流量200m3/h，將菌液離心分離，取菌泥。
全文摘要
本發明公開一種操作方法簡單、可降低產品成本，適合大規模工業化生產的芽孢桿菌同步高密度發酵工藝方法，是經過制備液體種子、種子罐發酵及發酵罐擴大，本發明通過全自動發酵在線監測溶氧來確定糖(復合碳源和促芽孢生成劑)的流加時間，達到芽孢桿菌的緩釋利用碳源，最終達到發酵液活菌數600億/ml以上，發酵24h芽孢率即可達90%以上，整齊飽滿。產品干燥收率達90%以上，降低了產品的生產成本。
文檔編號C12R1/125GK103114060SQ20131003091
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月28日 優先權日2013年1月28日
發明者莊國宏, 王效禹, 張琪, 吳磊, 潘艷妮, 李雙喜 申請人:大連三儀動物藥品有限公司