一個來源于苜蓿的蛋白質及其編碼基因的新用途

一個來源于苜蓿的蛋白質及其編碼基因的新用途
【專利摘要】本發明公開了一個來源于苜蓿的蛋白質及其編碼基因的新用途。本發明所提供的一種新用途是利用MtWRKY76的編碼核酸分子培育結瘤能力高和/或耐逆性高的轉基因結瘤植物的方法。本發明所提供的培育結瘤能力高和/或耐逆性高的轉基因結瘤植物的方法，包括向受體結瘤植物中導入MtWRKY76基因得到結瘤能力和/或耐逆性高于所述受體結瘤植物的轉基因結瘤植物的步驟；所述MtWRKY76是如下a）或b）的蛋白質：a）氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示的蛋白質；b）將SEQ?ID?No.2中的一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與結瘤植物結瘤能力和/或耐逆性相關的由a）衍生的蛋白質。本發明對于培育耐鹽耐旱及增強結瘤能力的轉基因豆科作物具有重要價值。
【專利說明】一個來源于苜蓿的蛋白質及其編碼基因的新用途

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一個來源于苜蓿的蛋白質及其編碼基因的新用途。

【背景技術】
[0002] 豆科植物與根瘤菌共生互作的結果是產生了一個新的植物器官-根瘤。根瘤的形 成不僅涉及共生雙方的分子對話與調控，同時也與環境因素有關，如水分、礦質營養元素、 溫度、重金屬、鈉鹽、C0 2、土壤類型以及pH等。但迄今為止，人們對豆科植物的結瘤固氮過 程的調控機制的分子機理的認識還知之甚少，因此發掘豆科植物結瘤固氮途徑中的關鍵基 因并熟悉其功能，是解決豆科植物結瘤固氮能力的重要手段。
[0003] 截型苜蓿具有基因組小、染色體數為2X8(2n=16)、生長期短、自花授粉、根瘤固 氮、遺傳轉化效率高等特點，并且與豆科主要作物親緣關系較近，所以被選作豆科模式植 物。研究表明，某些非生物脅迫，例如鹽脅迫，會直接影響植物的結瘤固氮，因此截型苜蓿的 一些轉錄因子可能同時參與非生物脅迫和結瘤，這一點與擬南芥存在很大差異。基于以上 特點，截型苜蓿成為研究豆科植物的熱點。苜蓿是很重要的優質牧草，因此研究苜蓿的抗逆 性及結瘤固氮提高苜蓿品質，挖掘出抗逆性及結瘤固氮相關的基因對于培育優質高產苜蓿 新品種，具有重要的生物學意義和經濟價值。


【發明內容】

[0004] 本發明所要解決的技術問題是提供來源于截型苜猜（Medicago truncatula)的一 個蛋白質MtWRKY76及編碼核酸分子的新用途。
[0005] 其中，SEQ ID No. 2由285個氨基酸殘基組成。
[0006] 本發明所提供的一種新用途是利用MtWRKY76的編碼核酸分子培育結瘤能力高和 /或耐逆性高的轉基因結瘤植物的方法。
[0007] 本發明所提供的培育結瘤能力高和/或耐逆性高的轉基因結瘤植物的方法，包括 向受體結瘤植物中導入MtWRKY76基因得到結瘤能力和/或耐逆性高于所述受體結瘤植物 的轉基因結瘤植物的步驟；
[0008] 所述MtWRKY76是如下a)或b)的蛋白質：
[0009] a)氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的蛋白質；
[0010] b)將SEQ ID No. 2中的一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與 結瘤植物結瘤能力和/或耐逆性相關的由a)衍生的蛋白質。
[0011] 所述結瘤植物是指根被固氮微生物(根瘤菌和/或弗蘭克氏菌)感染后能形成根瘤 的植物，包括豆科植物和非豆科植物，其中非豆科植物指木本植物的棺木、木麻黃、楊梅、胡 頹子、沙棘等。
[0012] 所述豆科植物具體可為苜蓿，所述苜蓿可為截型苜蓿，如medicago truncatula A17，medicago truncatula R-108。在本發明的實施例中，所述苜猜為截型苜猜medicago truncatula R-108 或 medicago truncatula A17〇
[0013] 本發明所提供的另一種新用途是利用MtWRKY76的編碼核酸分子培育培育耐逆性 高的轉基因植物的方法。
[0014] 本發明所提供的培育耐逆性高的轉基因植物的方法，包括向受體植物中導入 MtWRKY76基因得到耐逆性高于所述受體植物的轉基因植物的步驟；
[0015] 所述MtWRKY76是如下a)或b)的蛋白質：
[0016] a)氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的蛋白質；
[0017] b)將SEQ ID No. 2中的一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與 植物耐逆性相關的由a)衍生的蛋白質。
[0018] 其中，所述受體植物為可為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物可為擬南 芥或結瘤植物，所述結瘤植物可為豆科植物和非豆科植物，所述豆科植物可為苜蓿，所述苜 猜可為截型苜猜，如medicago truncatula A17，medicago truncatula R-108。在本發明的 實施方式中，所述苜猜為截型苜猜medicago truncatula R-108或medicago truncatula A17,所述擬南芥為Columbia生態型擬南芥。
[0019] 其中所述MtWRKY76基因可先進行如下修飾，再導入受體植物中，以達到更好的表 達效果：
[0020] 1)根據實際需要進行修飾和優化，以使基因高效表達；例如，可根據受體植物所 偏愛的密碼子，在保持本發明所述MtWRKY76基因的氨基酸序列的同時改變其密碼子以符 合植物偏愛性；優化過程中，最好能使優化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地 實現植物中導入基因的高水平表達，其中GC含量可為35%、多于45%、多于50%或多于約 60% ；
[0021] 2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已 知的有效的序列進行修飾；
[0022] 3)與各種植物表達的啟動子連接，以利于其在植物中的表達；所述啟動子可包括 組成型、誘導型、時序調節、發育調節、化學調節、組織優選和組織特異性啟動子；啟動子的 選擇將隨著表達時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性 表達啟動子，根據需要受體在發育的什么時期而定；盡管證明了來源于雙子葉植物的許多 啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于 雙子葉植物中的表達，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達；
[0023] 4)與適合的轉錄終止子連接，也可以提高本發明基因的表達效率；例如來源于 CaMV的tml，來源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發 明基因進行連接；
[0024] 5)引入增強子序列，如內含子序列(例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導序列 (例如來源于TMV, MCMV和AMV)。
[0025] 上文中，所述MtWRKY76基因的編碼序列具體可為SEQ ID No. 1的第74-931位核 苷酸。
[0026] 所述MtWRKY76基因可通過MtWRKY76基因表達盒或含有所述MtWRKY76基因表達 盒的MtWRKY76基因表達載體導入目的植物。
[0027] 本發明中所述MtWRKY76基因表達盒均可含有所述MtWRKY76基因和啟動所述 MtWRKY76基因轉錄的啟動子。本發明中所述MtWRKY76基因表達盒均指能夠在宿主細胞中 表達SEQ ID No. 2所示的MtWRKY76的DNA，該DNA不但可包括啟動所述MtWRKY76基因轉 錄的啟動子，還可包括終止所述MtWRKY76基因轉錄的終止子。進一步，所述MtWRKY76基 因表達盒還可包括增強子序列。可用于本發明的啟動子包括但不限于：組成型啟動子，組 織、器官和發育特異的啟動子，和誘導型啟動子。啟動子的例子包括但不限于：花椰菜花葉 病毒的組成型啟動子35S;來自西紅柿的創傷誘導型啟動子，亮氨酸氨基肽酶（"LAP"，Chao 等人（1999)Plant Physi〇1120:979-992);來自煙草的化學誘導型啟動子，發病機理相關 1 (PR1)(由水楊酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯）誘導）；西紅柿蛋白酶抑制 劑II啟動子（PIN2)或LAP啟動子（均可用茉莉酮酸曱酯誘導）；熱休克啟動子（美國專 利5,187, 267);四環素誘導型啟動子（美國專利5,057, 422);種子特異性啟動子，如谷子 種子特異性啟動子pF128(CN101063139B (中國專利200710099169. 7))，種子貯存蛋白質特 異的啟動子（例如，菜豆球蛋白、napin, oleosin和大豆beta conglycin的啟動子（Beachy 等人（1985)EMB0 J. 4:3047-3053))。此處引用的所有參考文獻均全文引用。合適的轉錄 終止子包括但不限于：農桿菌胭脂堿合成酶終止子（N0S終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S 終止子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例 如：0(1611等人（1985)似1：11代313:810;1?〇86油6找等人（1987)66116,56:125;61161'；[116311等 人（1991)Mol. Gen. Genet, 262:141;Proudfoot(1991)Cell，64:671;Sanfacon 等人 Genes 06￥.，5:141;1\108611等人（1990)?13111:0611，2:1261;]\111111'〇6等人（1990)66116,91:151; Ballad 等人（1989)Nucleic Acids Res. 17:7891 ;Joshi 等人（1987)Nucleic Acid Res.，15:9627)。在本發明的實施例中，所述MtWRKY76基因表達盒中啟動所述MtWRKY76基 因轉錄的啟動子為花椰菜花葉病毒的組成型啟動子35S，終止所述MtWRKY76基因轉錄的終 止子為N0S。
[0028] 可用現有的植物表達載體構建含有所述MtWRKY76基因表達盒的重組表達載體。 所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如PR0KII、 pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa 或pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司）等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3'端非翻 譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚 腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農桿菌冠癭瘤誘導（Ti)質粒基 因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆貯存蛋白基因）3'端轉錄的非翻譯區均具 有類似功能。使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或 轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與 編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的 來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結 構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行 加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因（GUS基因、 螢光素酶基因等)、抗生素的標記基因（如賦予對卡那霉素和相關抗生素抗性的nptll基因， 賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對 methatrexate抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學試劑標記基 因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構酶基因。
[0029] 在本發明的實施例中，所述選擇標記基因為賦予對抗生素潮霉素抗性的潮霉素 B磷酸轉移酶（hph)基因 hyg。在本發明的實施例中，所述MtWRKY76基因通過含有所述 MtWRKY76基因表達盒的MtWRKY76基因表達載體導入目的植物。所述MtWRKY76基因表達載 體是在PCAMBIA1302的多克隆位點插入SEQ ID No. 1的第74-931位核苷酸所示的MtWRKY76 編碼序列得到的重組表達載體。
[0030] 所述MtWRKY76基因表達載體可通過使用Ti質粒，植物病毒栽體，直接DNA轉 化，微注射，電穿孔等常規生物技術方法導入植物細胞（Weissbach, 1998, Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp. 411-463;Geiserson and Corey,1998, Plant Molecular Biology (2nd Edition)。
[0031] 當所述受體植物為結瘤植物時，所述轉基因植物具有如下1) -3)中的特性：1)結 瘤能力和耐逆性均高于受體結瘤植物；2)結瘤能力高于受體結瘤植物；3)耐逆性高于受體 結瘤植物。
[0032] 當所述受體植物為非結瘤植物時，所述轉基因植物的耐逆性高于受體植物。
[0033] 上文中，所述轉基因植物理解為不僅包含將所述基因轉化目的植物得到的第一代 轉基因植物，也包括其子代。對于轉基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規育 種技術將該基因轉移進入相同物種的其它品種，特別包括商業品種中。所述轉基因植物包 括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。
[0034] 本發明所提供的另一種新用途是MtWRKY76或與其相關的生物材料在調控結瘤植 物的結瘤能力和/或調控植物的耐逆性中的應用。
[0035] 該新用途具體可為Bl) -B4):
[0036] Bl) MtWRKY76在調控結瘤植物的結瘤能力和/或調控植物的耐逆性中的應用；
[0037] 所述MtWRKY76是如下a)或b)的蛋白質：
[0038] a)氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的蛋白質；
[0039] b)將SEQ ID No. 2中的一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與 結瘤植物結瘤能力和/或植物耐逆性相關的由a)衍生的蛋白質；
[0040] B2)編碼所述MtWRKY76的核酸分子在調控結瘤植物的結瘤能力和/或調控植物的 耐逆性中的應用；
[0041] B3)含有編碼所述MtWRKY76的核酸分子的表達盒在調控結瘤植物的結瘤能力和/ 或調控植物的耐逆性中的應用；
[0042] B4)含有編碼所述MtWRKY76的核酸分子的載體在調控結瘤植物的結瘤能力和/或 調控植物的耐逆性中的應用。
[0043] 該新用途中所有術語的定義同上文。
[0044] 上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子 也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。所述編碼MtWRKY76的核酸分子具體可為編碼MtWRKY76 的基因，所述編碼MtWRKY76的基因的編碼序列具體可為SEQ ID No. 1的第74-931位核苷 酸。
[0045] 其中，SEQ ID No. 1由938個核苷酸組成，編碼區為序列1的自5'末端的第74-931 位核苷酸，自5'末端的第1-7位核苷酸是Bgl II酶切位點和保護堿基，第8-73位核苷酸是 3*f lag標簽序列，第932-938位核苷酸是BstE II的酶切位點。
[0046] 上述應用中，B3)所述的表達盒具體可為上述MtWRKY76基因表達盒，B4)所述的載 體具體可為上述MtWRKY76基因表達載體。
[0047] 上述方法和上述應用中提到的所述MtWRKY76基因表達盒或所述MtWRKY76基因表 達載體也屬于本發明的保護范圍。
[0048] 導入上文所述MtWRKY76基因表達盒的重組微生物或導入上文所述MtWRKY76基因 表達載體的重組微生物也屬于本發明的保護范圍。
[0049] 其中，所述重組微生物具體可為細菌，酵母，藻和真菌。其中，細菌可來自埃希 氏菌屬（Escherichia),歐文氏菌（Erwinia),根癌農桿菌屬（Agrobacterium)、黃桿菌屬 (Flavobacterium),產喊菌屬（Alcaligenes),假單胞菌屬（Pseudomonas),芽胞桿菌屬 (Bacillus)等。
[0050] 上文中，所述根長可為主根長。
[0051] 所述生物量是指整個植株（由地上部分和地下部分組成）的生物量；所述生物量以 鮮重或干重表示。
[0052] 實驗證明，導入本發明MtWRKY76基因的轉基因苜蓿的結瘤能力高于受體苜蓿，轉 基因苜蓿的根瘤數目是受體苜蓿的1.7-1. 9倍，轉基因苜蓿的根瘤的重量是受體苜蓿的 1. 65-1. 82倍。而且導入本發明MtWRKY76基因的轉基因苜蓿的耐鹽性和耐旱性明顯高于 受體苜蓿，在鹽脅迫下，導入本發明MtWRKY76基因的轉基因苜蓿的主根長度是受體苜蓿的 1. 7倍，植株干重是受體苜蓿的1. 3倍；在干旱脅迫下，導入本發明MtWRKY76基因的轉基因 苜蓿的存活率是受體苜蓿的2. 7-3. 3倍。另外導入本發明MtWRKY76基因的轉基因擬南芥 耐鹽性高于受體擬南芥。本發明對于培育耐鹽耐旱及增強結瘤能力的轉基因豆科作物具有 重要價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0053] 圖1為載體pCAMBIA1302-MtWRKY76的結構示意圖。
[0054] 圖2為T2代轉基因擬南芥的分子水平檢測。
[0055] 1，17 :lkb DNA ladder，由下到上分別為 250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp， 2000bp ;2 :陰性對照，H20 ;3 :陽性對照；4 :陰性對照；5-9、11、12、14-16、18、19和21-28: PCR鑒定陽性植株；10、13和20 :PCR鑒定陰性植株。
[0056] 圖3為了3代批1服￥3轉基因擬南芥〇^2，1^5，1^8，1^10和1^13)與野生型擬南芥在 150mM，180mM，190mM，200mM，210mM，220mM NaCl 脅迫下的萌發率統計圖。
[0057] 圖4為農桿菌轉化截型苜蓿R-108葉片再生植株的獲得。
[0058] a :誘導的愈傷組織；b :抗性苗的形成；c :再生苗的形成；d :轉基因苗種植在花 盆。
[0059] 圖5為轉基因截型苜蓿R-108的PCR鑒定。
[0060] 1，19 :lkb DNA ladder，由下到上分別為 250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp， 2000bp ;2 :陰性對照，H20 ;3 :陽性對照；4 :陰性對照；5、7、10-18、21、23-27、29-34、35、37 和39 :PCR鑒定陽性植株；6、8、9、20、22、28、36和38 :PCR鑒定陰性植株。
[0061] 圖6為轉基因截型苜蓿L2和L4與對照（WT，未轉基因苜蓿)在不含有與含有100mM NaCl上根長差異的圖片。
[0062] 左圖為不含NaCl，右圖為含有lOOmM。
[0063] 圖7為轉基因截型苜蓿L2和L4與對照（WT，未轉基因苜蓿）在與含有lOOmMNaCl 上根長的差異。
[0064] 左圖：轉基因截型苜蓿L2和L4與對照（WT，未轉基因苜蓿)在FN培養基上根長統 計圖，右圖：轉基因截型苜蓿與對照（WT，未轉基因苜蓿)在100mM NaCl的FN培養基上根長 統計圖。
[0065] 圖8為轉基因截型苜蓿L2和L4與對照（WT，未轉基因苜蓿）在lOOmM NaCl上單 株干重的差異。
[0066] 左圖：轉基因玉截型苜蓿育期L2和L4與對照（WT，未轉基因苜蓿)在FN培養基上 單株干重統計圖；右圖：轉基因截型苜蓿L2和L4與對照在含有lOOmM NaCl的FN培養基上 單株干重統計圖。
[0067] 圖9為轉基因截型苜蓿L2和L4與對照（WT，未轉基因苜蓿）干旱處理的圖片。
[0068] 上圖為正常澆水管理對照組；下圖為干旱處理組。
[0069] 圖10為轉基因截型苜蓿L2和L4與對照（WT，未轉基因苜蓿）干旱處理后存活率 的統計圖。
[0070] 圖11為轉基因截型苜蓿株系L2和L4與對照（WT，未轉基因苜蓿）在接種根瘤菌 培養30天后的圖片。
[0071] 圖12為轉基因截型苜蓿株系L2和L4與對照（WT，未轉基因苜蓿）在接種根瘤菌 30天后結瘤數目的差異。
[0072] 圖13為轉基因截型苜蓿株系L2和L4與對照（WT，未轉基因苜蓿）在接種根瘤菌 30天后地下部分鮮重的差異。

【具體實施方式】
[0073] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。以下實施例中的定量實驗，均設置重復實驗，結果取平 均值。
[0074] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0075] 下述實施例中的生物材料如下：
[0076] 截型苜猜 A17 (Medicago truncatula A17)和 R-108 (Medicago truncatula R-108):由自法國 INRA BRC-MTR (Biological Resource Centre for the model species Medicago truncatula L.)贈予。該生物材料記載在下述文獻中：de Lorenzo L,Merchan F,Blanchet S.Differential expression of the TFIIIA regulatory pathway in response to salt stress between Medicago truncatula genotypes. Plant Physiol. 2007Dec; 145(4) : 1521-32。Columbia生態型擬南芥(哥倫比亞生態型擬南芥 (Columbia stain of Arabidopsis thaliana as genetic background):購自 salk 公司。
[0077] 根癌農桿菌EHA105記載在下述文獻中：抗生素抑制農桿菌的效果及對條斑紫菜 生長發育的影響，王萍等，水產科學，2009, 28 (7)，公眾可從中國農業大學獲得，以重復本申 請實驗。。
[0078] 根瘤菌 Sinorhizobium melilotil021 :由法國 CNRS-INRA_Universit6de Nice Sophia Antipolis贈予。該生物材料記載在下述文獻中：Frendo P, Harrison J, Norman C.Glutathione and homoglutathione play a critical role in the nodulation process of Medicago truncatula. Mol Plant Microbe Interact. 2005Mar;18(3):254-9〇
[0079] 實施例1、MtWRKY76基因的克隆
[0080] 1、設計特異性引物對（MtWRKY76 _ 5' 和 MtWRKY76 _ 3'），由 Invitrogen 公司合 成。
[0081] P1F ：5,-
[0082] AGATCTAGATTACAAAGATCATGATGGTGACTATAAGGACCACGACATCGATTAC AAAGATGATGATG ATAAAATGGAATCAACATGCGTGGAT-3,；
[0083] P1R : 5，-GGTGACCTCACCATTTGTCCTTATTAG-3，。
[0084] 2、提取截型苜猜A17 (Medicago truncatula)整株植物的RNA，反轉錄為cDNA ;
[0085] 3、以步驟2的cDNA為模板，用步驟1的特異性引物對P1F和P1R進行PCR擴增， 回收PCR擴增產物。
[0086] 4、將步驟3的PCR擴增產物進行測序。
[0087] 測序結果為，該PCR產物的基因的序列為序列表中的序列1，序列1由938個核苷 酸組成，編碼區為序列1的自5'末端的第74-931位核苷酸，自5'末端的第1-7位核苷酸 是Bgl II酶切位點和保護堿基，第8-73位核苷酸是3*f lag標簽序列，第932-938位核苷酸 是BstE II的酶切位點。將該基因命名為MtWRKY76,該基因編碼的蛋白命名為MtWRKY76,該 蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2所示，序列2由285個氨基酸殘基組成。
[0088] 5、將上述PCR產物插入pMD18T-simple載體(購自TaKaRa生物工程公司），得到載 體 pMD18T-simple-MtWRKY76,測序結果表明 pMD18T-simple-MtWRKY76 含有 MtWRKY76 (序 列表中的序列1)。
[0089] 實施例2、轉基因擬南芥的獲得和功能研究
[0090] 一、轉基因擬南芥的獲得
[0091] 1、重組載體（pCAMBIA1302-MtWRKY76)的構建
[0092] (1)用限制性內切酶Bgl II和BstE II雙酶切載體pMD18T-simple-MtWRKY76,回收 小片段。
[0093] (2)用限制性內切酶BglII和BstEII雙酶切pCAMBIA1302(購自Centerforthe Application of Molecular Biology to International Agriclture, www. cambia. org), 回收載體骨架。
[0094] (3)將步驟（1)的小片段與步驟（2)的載體骨架連接，得到連接產物，將該連接 產物轉化大腸桿菌DH5 α，得到轉化子，提取該轉化子的質粒，測序，將測序結果表明在 PCAMBIA1302的Bgl II和BstE II酶切位點之間插入序列表中的序列1得到的重組載體命名 為 pCAMBIA1302-MtWRKY76 (圖 1)。
[0095] 2、轉基因擬南芥的獲得
[0096] ( 1)根癌農桿菌感受態細胞的制備
[0097] 挑取根癌農桿菌EHA105單菌落接種于lOOmlYEB液體培養基中，220rpm、28°C振蕩 培養至〇D6(i(i=0. 5 ;轉入無菌離心管，5000rpm離心5min，去上清，加入10ml預冷的0. 15M的 CaCl2水溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置20min ;4°C、5000rpm離心5min，去上清，加入4ml預 冷的含10%甘油(體積百分含量)和0. 15M CaCl2的水溶液，輕輕懸浮；得到根癌農桿菌懸浮 液（EHA105感受態細胞)，分裝于無菌eppendorf管中，每管200μ 1，于液氮中速凍lmin，凍 存于-70°C。
[0098] (2) pCAMBIA1302-MtWRKY76 轉化根癌農桿菌 EHA105
[0099] 取1 μ g上述得到的pCAMBIA1302-MtWRKY76質粒加入200 μ 1根癌農桿菌EHA105 感受態細胞中，混勻，靜止5min ;液氮中速凍lmin，37°C水浴5min，加入lml ΥΕΒ液體培養 基，28°C、150rpm振蕩培養4h ;5000rpm離心3min，棄上清，加入0. lml YEB液體培養基，重 新懸浮細胞；涂布于含50 μ g/ml卡那霉素和50 μ g/ml利福平的YEB固體平板上，28°C培養 約48h，得到轉化子。將該轉化子進行菌液PCR鑒定，鑒定所用引物如下：
[0100] P2F :5, -ATGGAATCAACATGCGTGGAT-3,；
[0101] P1R :5' -GGTGACCTCACCATTTGTCCTTATTAG-3'。
[0102] 結果顯示得到約860bp的片段，證明pCAMBIA1302-MtWRKY76已經成功轉入根癌農 桿菌EHA105中。再將PCR鑒定陽性的轉化子提取質粒，測序，結果表明
[0103] pCAMBIA1302-MtWRKY76 中含有 SEQ ID No. 1 的第 74-938 位核苷酸序 列。將含有pCAMBIA1302-MtWRKY76的農桿菌轉化子命名為重組農桿菌EHA105/ pCAMBIA1302-MtWRKY76。
[0104] (3)轉化擬南芥
[0105] ①將重組農桿菌 EHA105/pCAMBIA1302-MtWRKY76 接種于 10ml 含 50 μ g/ml 卡那霉 素和50 μ g/ml利福平的YEB液體培養基中，28°C、200rpm振蕩培養過夜；
[0106] ②轉化前一天以1:50比例(體積比)接種于200ml含相同抗生素的YEB培養基中， 擴大培養至0D600為1. 2-1. 6, 5, OOOrpm、15min離心集菌，重懸于滲入緩沖液（由蔗糖、表面 活性劑L-77和水組成；蔗糖的質量百分含量為5%，L-77的體積百分含量為0. 05%)，稀釋至 0D600 約為 0. 8,即為重組農桿菌 EHA105/pCAMBIA1302-MtWRKY76 菌液；
[0107] ③采用Foral dip法將農桿菌轉化花蕾期的擬南芥：在Columbia生態型擬南芥 (Columbia stain of Arabidopsis thaliana as genetic background)抽苔 4_5cm 時剪 去頂端花序，使腋生花序生長，剪時傷口應位于最高的莖生葉上方，約4-5天后進行轉化， 轉化前要使土壤充分濕透且將已開花的花蕾去掉，只保留未開放的小花蕾；轉化時將擬南 芥整株與花盆一起倒扣在盛有200ml重組農桿菌EHA105/pCAMBIA1302-MtWRKY76菌液的 容器中浸泡2-3min，浸泡完畢后，取出花盆，側放于托盤中，蓋上黑色塑料布，24hr后揭開 塑料布，直立放置花盆，進行正常的光照培養，收獲?\代轉MtWRKY76擬南芥種子（?\代轉 pCAMBIA1302-MtWRKY76 擬南芥種子)。
[0108] (4)轉基因擬南芥的篩選和分子鑒定
[0109] ①轉基因擬南芥的篩選
[0110] ?\代轉MtWRKY76擬南芥種子播種于含80mg/L潮霉素的MS固體平板上，4°C春化 3天，置22°C光照培養箱中培養7天，轉化體表現為真葉呈深綠色，根深長至培養基中，將轉 化體移至不含抗生素的MS培養基中，6天后將綠色的幼苗轉到土壤中繁種，收獲的種子即 為T 2代轉MtWRKY76擬南芥種子。
[0111] ②DNA水平檢測
[0112] 將T2代轉MtWRKY76擬南芥種子培育成植株，提取的T2代轉MtWRKY76擬南芥株系 的基因組DNA為模板，以質粒pCAMBIA1302-MtWRKY76為陽性對照，Columbia生態型擬南芥 (野生型）的基因組DNA為陰性對照，用如下引物進行PCR擴增：
[0113] P2F : 5，-ATGGAATCAACATGCGTGGAT-3，；
[0114] P1R : 5 ' -GGTGACCTCACCATTTGTCCTTATTAG-3 '。
[0115] PCR 體系（25. 0μ l):10XEx Taq PCR Buffer2. 5μ l，dNTP (25mM)2. 0μ 1，5,引物 (5pmol/ μ 1) 1·0μ 1，3，引物（5pmol/ μ 1) 1· 0 μ 1，ExTaq 酶（5U/ μ 1) 1· 0 μ 1，模板（1 μ g/ μ 1) 1· Ομ 1，ddH2016. 5μ 1。
[0116] PCR 程序為：第一輪：94°C變性 5min ;第二輪：94°C變性 30sec，50°C 復性 30sec， 72°C延伸lmin，30個循環；第三輪：72°C延伸lOmin。
[0117] 反應結束后，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，結果見圖2所示，圖2為PCR 擴增產物電泳圖，1，17為lkb DNA ladder，由下到上分別為250bp、500bp、750bp、1000bp、 1500bp、2000bp，3 為陽性對照，2,4 為陰性對照，5-9、11、12、14-1618、19 和 21-28 為 PCR 陽性植株，1〇、13和20為PCR陰性植株；可以看出，能擴增出MtWRKY76基因特異條帶(約 860bp)的植株為PCR鑒定陽性T 2代轉MtWRKY76擬南芥植株，得到20個PCR鑒定陽性T2代 轉MtWRKY76擬南芥植株，其中五個株系命名為L2, L5, L8, L10和L13株系（Τ2代轉MtWRKY76 擬南芥)。
[0118] 將L2, L5, L8, L10和L13株系進行自交，得到T3代種子，將其培育為T3代轉 MtWRKY76 擬南芥植株 L2, L5, L8, L10 和 L13。
[0119] 二、轉基因擬南芥的耐逆性鑒定
[0120] 分別將L2, L5, L8, L10和L13株系擬南芥（T3代轉MtWRKY76擬南芥種子）和 Columbia生態型擬南芥(野生型）種子進行鹽脅迫實驗，實驗設三次重復，每次重復每個株 系60粒種子。具體方法如下：
[0121] 將各個株系的擬南芥種子分別種于含有150mM, 180mM, 190mM，200mM，210mM，220mM NaCl的MS培養基上，4°C春化72hr，光照培養7天，每天光照時間為16小時，光照強度為 ΙΟΟμπιοΙ πΓΥ1，進行萌發率計算（以根長1mm為萌發標準)。統計結果表明隨著鹽濃度的增 力口，轉MtWRKY76擬南芥和Columbia生態型擬南芥的萌發率都降低，但是在相同的鹽濃度下 轉MtWRKY76擬南芥比空載體對照和野生型的萌發率要高。例如在210mM NaCl的MS培養 基上，Columbia生態型擬南芥（wt)種子的萌發率是33. 3%，L2種子的萌發率為63. 3%，L5 種子的萌發率為61. 1%，L8種子的萌發率為71. 1%，L10種子的萌發率為75. 6%，L13種子的 萌發率為83. 4% (圖3)。轉MtWRKY76擬南芥各個株系的種子的萌發率顯著高于Columbia 生態型擬南芥，表明過表達MtWRKY76增強了擬南芥的抗鹽能力。
[0122] 實施例3、轉基因截型苜蓿的獲得和功能研究
[0123] 一、轉基因截型苜蓿的獲得
[0124] ( 1)真空葉盤轉化法轉化截型苜蓿
[0125] 采用實施例2的重組農桿菌EHA105/pCAMBIA1302-MtWRKY76侵染截型苜蓿R-108 的葉片，通過體細胞胚胎再生的途徑，采用抽真空葉盤轉化法轉化截型苜蓿R-108。
[0126] ①截型苜蓿材料的準備
[0127] 選取飽滿種子的截型苜蓿R-108在濃硫酸中浸泡約25min(每隔5min，輕輕搖晃)， 至種子表面出現小斑點，用大量蒸餾水清洗7次，保證種子表面覆蓋一層水膜，放至4°C春 化2d。在大培養皿中放上一層濾紙，用蒸餾水潤濕，將春化后的種子轉移到濾紙上，室溫培 養l-2d，至根長2cm，轉移至營養土 (營養土 ：蛭石=1 :3)培養。
[0128] 截型苜蓿R-108生長條件：每天16hr光照/8hr黑暗，60%相對濕度，22°C白天 /16°C夜間，200μΕ/πι2Λ，生長4-6w eeks，用消毒的剪刀剪下葉片，自來水清洗表面雜質， 5%NaC10表面消毒40min，用滅菌蒸餾水清洗2-3次，除去NaCIO,切掉葉柄，將葉片切成 5mm X 5mm小塊，用于轉化實驗。
[0129] ②葉片的準備與侵染
[0130] 將切好的葉片進入侵染液中，充分混合，抽真空，-0. lpka (> 0. 09pka)，30min ; 28°C，50rpm，共培養 2h。
[0131] ③共培養
[0132] 將切片取出，在滅菌的濾紙上盡可能除去切片表面的農桿菌，然后轉移到含 100 μ Μ 乙醜丁香酮的 SH3a 固體培養基（Medicago truncatula handbook, Transformation and regeneration of R108-1(c3)via somatic embryogenesis(Cosson et a 1. , 2007) 上，保證葉片正面朝上，暗培養3天。
[0133] ④愈傷組織的形成
[0134] 將共培養后的葉片轉移到含有10mg/L潮霉素和400mg/L羧芐青霉素的SH3a固體 培養基(保證葉片正面朝上)，暗培養5-6周，每2周轉接一次。轉板時羧卞青霉素300mg/ L-200mg/L，逐漸降低。
[0135] ⑤胚的形成
[0136] 待愈傷組織成熟，轉移到不含激素的SH9培養基（Medicago truncatula handbook, Transformation and regeneration of R108-1(c3)via somatic embryogenesis (Cosson et a 1.，2007)上，并轉移到光照條件下，進行培養，每3周轉一次 板，至形成前期胚胎；大約20-30天，前期胚胎發育成真正的胚胎。
[0137] ⑥植株的發育
[0138] 2-3周后，胚胎開始發育成小植株；將小植株轉移到1/2MS培養基上，進行生根。
[0139] ⑦轉移到溫室中
[0140] 將植株轉移到溫室中，進行培養，收獲?；代(轉pCAMBIA1302-MtWRKY76當代，也即 轉MtWRKY76當代）植株（圖4)所結的種子（?\代種子)。
[0141] (2)轉基因截型苜蓿的的分子鑒定
[0142] 將?\代轉pCAMBIA1302-MtWRKY76截型苜蓿種子培育成植株，提取?\代轉 pCAMBIA1302-MtWRKY76截型苜蓿株系的基因組DNA為模板，以質粒pCAMBIA1302-MtWRKY76 為陽性對照，截型苜蓿R-108 (野生型）的基因組DNA為陰性對照，利用上游引物(在35S啟 動子ATG上游150bp位置處)和下游引物(在WRKY76的3-末端)，PCR擴增特異的一段約為 1000bp的目的基因片段。用如下引物進行PCR擴增：
[0143] 5,引物：5, -GACGCACAATCCCACTATCC-3,；
[0144] 3 ' 弓丨物：5 ' -GGTGACCTCACCATTTGTCCTTATTAG-3 '。
[0145] PCR 體系（25. 0μ l):10XEx Taq PCR Buffer2. 5μ l，dNTP (25mM)2. 0μ 1，5,引物 (5pmol/ μ 1) 1·0μ 1，3，引物（5pmol/ μ 1) 1· 0 μ 1，ExTaq 酶（5U/ μ 1) 1· 0 μ 1，模板（1 μ g/ μ 1) 1· 0μ 1，ddH2016. 5μ 1。
[0146] PCR 程序為：第一輪：94°C變性 5min ;第二輪：94°C變性 30sec，50°C 復性 30sec， 72°C延伸lmin，30個循環；第三輪：72°C延伸lOmin。
[0147] 反應結束后，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，結果見圖5所示，1，19為 lkb DNA ladder，由下到上分別為 250bp、500bp、750bp、lOOObp、1500bp、2000bp，3 為陽性對 照，2,4 為陰性對照，5、7、10-13、14-18、21、23-27、29-34、35、37 和 39 為 PCR 陽性植株，6、 8、9、20、22、28、36和38為PCR陰性植株；可以看出，能擴增出MtWRKY76基因特異條帶(約 lOOObp)的植株為PCR鑒定陽性?\代轉MtWRKY76截型苜蓿植株，得到25個PCR鑒定陽性 ?\代轉MtWRKY76即截型苜蓿植株，隨機挑選2個PCR鑒定陽性株系命名為L2和L4株系（T2 代轉MtWRKY76截型苜蓿）進行下述步驟二和步驟三的實驗。
[0148] 二、轉基因截型苜蓿的耐逆性鑒定
[0149] 1、分別將截型苜蓿R-108 (即野生型截型苜蓿代轉MtWRKY76截型苜 蓿（L2和L4)進行鹽脅迫實驗：
[0150] ①根長實驗：
[0151] 將野生型截型苜蓿的種子與?\代轉MtWRKY76截型苜蓿的L2和L4株系?\代種子 先0. 1%的水瓊脂（10mg/L潮霉素）上萌發，4°C春化2天轉到25°C黑暗培養20h，之后轉到 不含與含有 lOOmMNaCl FN 培養基(溶質及濃度為 MgS04. 7H200. 5mM, KH2P040. 7mM, Na2HP04. 2 H200. 8mM, FeEDTAO. 5 μ M, NH4N030. 5mM, CaCl2lmM, MnS040. lmg/L, CuS040. lmg/L, ZnS040. lmg/ L，H3B030. lmg/L，Na2M〇040. lmg/L，溶劑為水）上培養7天，記錄下初始主根長及培養7天后 主根長，計算其在不含與含有lOOmMNaCl篩選壓下主根的生長長度（圖6)。經過4次重復實 驗，每次實驗每個株系20粒種子，初步統計出其數據如圖7所示，結果表明在正常生長條件 下，野生型截型苜蓿與轉基因截型沒有差別，但是在l〇〇mM NaCl條件下，?\代轉MtWRKY76 截型苜蓿的L2和L4株系明顯比野生型根的生長量要長，主根長度是野生型截型苜蓿的1.7 倍，其數據如下：野生型截型苜蓿的主根長為1. 365cm，L2的主根長為2. 365cm，L4的主根 長為2. 275cm。此結果表明過表達MtWRKY76基因增加了截型苜蓿R-108的抗鹽能力。
[0152] ②干重實驗：
[0153] 將野生型截型苜蓿的種子與?\代轉MtWRKY76截型苜蓿的L2和L4株系?\代種子 先在0. 1%的水瓊脂（10mg/L潮霉素）上萌發，4°C春化2天后轉到25°C黑暗培養20h，這時 萌發的種子會長出約1厘米的根，轉到不含與含有l〇〇mM NaCl FN培養基上培養15天后， 單株采樣60°C烘干48h稱取干重。經過3次重復實驗，每次實驗每個株系20粒種子，統計 出其數據如圖8。結果表明在正常生長條件下，野生型與轉基因截型苜蓿的干重沒有差別； 但在lOOmM NaCl條件下，?\代轉MtWRKY76截型苜蓿的L2和L4株系明顯比野生型的生物 量要多，植株干重是野生型截型苜蓿的1. 3倍，數據如下：野生型為4. 15mg，L2為5. 52mg， L4為5. 30mg。此結果表明MtWRKY76基因增強了截型苜蓿R-108的抗鹽能力。
[0154] 2、分別對截型苜蓿R-108 (即野生型截型苜蓿代轉MtWRKY76截型苜 蓿（L2和L4)進行干旱脅迫實驗：
[0155] 將野生型截型苜蓿的種子與?\代轉MtWRKY76截型苜蓿的L2和L4株系?\代種子 先0. 1%的水瓊脂（10mg/L潮霉素）上萌發，4°C春化2天轉到25°C黑暗培養20h，轉移到培 養土中（營養土 ：蛭石（v/v)=l :3)，正常生長兩周后，干旱處理14天后，定量澆水300mL，再 干旱14天，反復三次，最后一次復水3天后拍照（圖9)。同時設置正常澆水管理的對照組。 并計算存活率(干旱處理組的存活株數/對照組的存活株數)。同時設置正常澆水管理的對 照組。實驗設三次重復，每次重復每個株系24粒種子。統計出其數據如圖10所示，野生 型截型苜蓿的存活率為26. 7% ;而轉MtWRKY76截型苜蓿L2為88. 9%，L4為73. 3%。導入本 發明MtWRKY76基因的轉基因苜蓿的存活率是野生型截型苜蓿的2. 7-3. 3倍。說明過表達 MtWRKY76提高了截型苜蓿抗旱的能力。
[0156] 三、轉基因截型苜蓿的結瘤實驗鑒定
[0157] 1、根瘤菌 Sinorhizobium melilotil021 的活化及準備
[0158] 將在-80°C保存的根瘤菌 Sinorhizobium melilotil021 菌種在含 100 μ g/ml 硫 酸鏈霉素 TY固體培養基（胰蛋白胨5g，酵母粉3g，CaCl20. 6g，，瓊脂粉15g，用水定容至 1000ml，調pH至7. 0)上劃線，在28°C培養箱里生長兩天后，挑取單菌落到含100 μ g/ml硫 酸鏈霉素 TY液體培養基，28°C，240rpm震蕩培養三天，按照1 :100轉接到新的含100 μ g/ml 硫酸鏈霉素 TY培養基（50mL)直至菌液的0D_為0. 8,用生理鹽水稀釋至0D_為0. 5,備 用。
[0159] 2、蛭石管的準備
[0160] 將蛭石用低氮培養基攪拌直均勻，裝入大試管，約為管長的2/3,封口膜包好， 121°C高壓滅菌2小時，降至室溫后每個蛭石管加入滅菌的蒸餾水30mL。
[0161] 3、截型苜蓿的結瘤實驗
[0162] 將截型苜蓿R-108 (即野生型截型苜蓿（WT))的種子與?\代轉MtWRKY76截型苜蓿 的L2和L4株系?\代種子在0. 1%的水瓊脂（10mg/L潮霉素）上萌發，4°C春化2天后轉到 25°C黑暗培養20h，萌發的種子長出約1厘米的根時種到準備好的蛭石管里，每個蛭石管里 接種步驟1稀釋好的根瘤菌Sinorhizobium melilotil021 (0D6Q(i為0. 5)500 μ L，光照培養 30天，每天光照時間為16小時，光照強度為200 μ mol πΓΥ1，進行結瘤數目計算（圖11)。實 驗設三次重復，每次重復每個株系15粒種子。統計結果如圖12所示，可以看出，接種根瘤 菌Sinorhizobium melilotil021的轉MtWRKY76截型苜猜比野生型的結瘤數目增多。統計 出其數據是野生型截型苜蓿為7. 5個；而轉MtWRKY76的兩個株系L2和L4分別為13. 9個， 12. 4個，轉基因苜蓿的根瘤數目是受體苜蓿的1. 7-1. 9倍。地下部分鮮重為野生型51. 8mg， 而轉MtWRKY76的兩個株系L2和L4分別為85. 7mg，94. 5mg (圖13)，轉基因苜蓿的根瘤的 重量是受體苜蓿的1. 65-1. 82倍。表明MtWRKY76參與了截型苜蓿結瘤過程，并且增強結瘤 固氮能力。
[0001] I'"!"*- T~| 1 1 序列我 <110>中國農業大學 <120〉 -個來源于苜蓿的蛋白質及其編碼基因的新用途 <130> CGGNAR132242 <160> 2 <170> PaLentln version 3. 5 <210> 1 <211> 938 <212〉 DNA <213〉截型苜猜（/IfeoVcago irw?caiy/a ) <220> <221〉 CDS <222〉 (74).. (931) <?00> 1 agatetagat tacaaagatc atgatggtga ctataaggac cacgacatcg attacaaaga 60 tgatgatgat aaaatggaat caacatgcgt ggataettea ctcaatctta acgttaatgc 120 ttettetata ctcaaggacg aagttttggt tgaagagtta catcgtctta gttctgaaaa 180
[0002] 序列表 caagaggcta aatgaaacat tgaccaacat gtgtgagaac tatgacacta tgcaaaagca 240 attgaatcaa ttgatgaatc aaaattttga aaaccaaaca caacaatcaa ggaaaagaaa 300 agctgagagt gagagttgca tcaatatgtt tggtactgtt agaggcatta atattattaa 360 taataataat gagtgcagca ctgttactga tgaagaalca ttaatcaaaa ggccatgtag 420 ggatatttca tcacctaagg cttataaggt tcttgtgaag acagaagcat ctagtaatag 480 cttatatgtg atggatggat atcaatggag gaaatatggt cagaaggtta ctagagataa 540 cccctctcct agagcttatt ttaggtgctc atatgctcca agctgcccag ttaaaaagaa 600 ggtgcaaaaa agtglagaag accctactat actagttgca acatatgaag gagagcacaa 660 ccatggtcat gagaaagctg aaatatcaat gatatcaagc caaagtgaag aagctccttt 720 aggttcagtt catgttactt cacctcaaca aattattcaa agaacatgtt caaccatgaa 780 gcttgataat gttccaaaat catctatcca gcaatttttg gttcaacaaa tggctacttc 840 tttgacaaat gatcctaatt tcactgcagc acttgccact gctatttctg gaagaatttt 900 ggaccatact tctaataagg acaaatggtg aggtcacc 938 <210> 2 <211> 285 <212> PRT <2Yi> 藏轅 iMedicago truncatula } <400〉 2 Met Glu Ser Thr Cys Val Asp Thr Ser Leu Asn Leu Asn Val Asn Ala 15 10 15
[0003] 序列表 Ser Ser lie Leu Lys Asp Glu Val Leu Val Glu Glu Leu His Arg Leu 20 25 30 Ser Ser Glu Asn Lys Arg Leu Asn Glu Thr Leu Thr Asn Mel Cys Glu 35 40 45 Asn Tyr Asp 丁hr Met Gin Lys Gin Leu Asn Gin Leu Met Asn Gin Asrt 50 55 60 Phe Glu Asn Gin Thr Gin Gin Ser Arg \,ys Arg Lys A1a Glu Ser Glu 65 70 75 80 Ser Cys He Asn Met Phe Gly Thr ￥al Arg Gly lie Asn lie lie Asn 85 90 95 Asn Asn Asn Glu Cys Ser Thr Val Thr Asp Glu Glu Ser Leu lie Lys 1UU 105 110
[0004] 序列表 Arg Pro Cys Arg Asp lie Ser Ser Pro Lys Ala Tyr Lys Val Leu ￥al 115 120 125 Lys Thr Glu Ala Ser Ser Asn Ser Leu Tyr Val Met Asp Gly Tyr Gin 130 185 140 Trp Arg Lys Tyr Gly Gin Lys Val Thr Arg Asp Asn Pro Ser Pro Arg 145 150 155 160 Ala Tyr Phe Arg Cys Ser Tyr Ala Pro Ser Cys Pro Val Lys Lys Lys 165 170 175 Val Gin Lys Ser Val Glu Asp Pro Thr lie Leu Val Ala Thr Tyr Glu 180 185 190 Gly Glu His Asn His Gly His Glu Lys Ala Glu lie Ser Met lie Ser
[0005] Ι"-- "K|i -4- Ιψ f1}衣 195 200 205 Ser Gin Ser Glu Glu Ala Pro Leu Gly Ser Val His Val Thr Ser Pro 210 215 220 Gin Gin lie lie Gin Arg Thr Cys Ser Thr Met Lys Leu Asp Asn Val 225 230 235 240 Pro Lys Scr Scr lie Gin Gin Phc Leu Val Gin Gin Met Ala Thr Ser 245 250 255 Leu Thr Asn Asp Pro Asn Phe Thr Ala Ala Leu Ala Thr Ala lie Ser 260 265 270 Gly Arg lie Leu Asp His Thr Ser Asn Lys Asp Lys Trp 275 280 285
【權利要求】
1. 培育結瘤能力高和/或耐逆性高的轉基因結瘤植物的方法，包括向受體結瘤植物中 導入MtWRKY76基因得到結瘤能力和/或耐逆性高于所述受體結瘤植物的轉基因結瘤植物 的步驟； 所述MtWRKY76是如下a)或b)的蛋白質： a) 氣基酸序列如SEQ ID No. 2所不的蛋白質； b) 將SEQ ID No. 2中的一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與結瘤 植物結瘤能力和/或耐逆性相關的由a)衍生的蛋白質。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述轉基因結瘤植物為轉基因豆科植物， 所述受體結瘤植物為豆科植物。
3. 培育耐逆性高的轉基因植物的方法，包括向受體植物中導入MtWRKY76基因得到耐 逆性高于所述受體植物的轉基因植物的步驟； 所述MtWRKY76是如下a)或b)的蛋白質： a) 氣基酸序列如SEQ ID No. 2所不的蛋白質； b) 將SEQ ID No. 2中的一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物 耐逆性相關的由a)衍生的蛋白質。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述受體植物為雙子葉植物或單子葉植 物。
5. 根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述耐逆性為耐鹽性和/或耐 旱性。
6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于：所述耐鹽性體現為下述Al)、A2)和A3) 中的全部或部分： A1)鹽脅迫下，植物種子的萌發率高于所述受體結瘤植物或所述受體植物； A2)所述耐逆性體現為鹽脅迫下，根的長度高于所述受體結瘤植物或所述受體植物； A3)所述耐逆性體現為鹽脅迫下；生物量高于所述受體結瘤植物或所述受體植物。
7. 根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述MtWRKY76基因的編碼序列 是SEQ ID No. 1的第74-931位核苷酸。
8. 下述Bl)-B4)中的應用； Bl) MtWRKY76在調控結瘤植物的結瘤能力和/或調控植物的耐逆性中的應用； 所述MtWRKY76是如下a)或b)的蛋白質： a) 氣基酸序列如SEQ ID No. 2所不的蛋白質； b) 將SEQ ID No. 2中的一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與結瘤 植物結瘤能力和/或植物耐逆性相關的由a)衍生的蛋白質； B2)編碼所述MtWRKY76的核酸分子在調控結瘤植物的結瘤能力和/或調控植物的耐逆 性中的應用； B3)含有編碼所述MtWRKY76的核酸分子的表達盒在調控結瘤植物的結瘤能力和/或調 控植物的耐逆性中的應用； B4)含有編碼所述MtWRKY76的核酸分子的載體在調控結瘤植物的結瘤能力和/或調控 植物的耐逆性中的應用。
9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于：所述耐逆性為耐鹽性和/或耐旱性。 10. C1-C4中的至少一種生物材料： C1、含有編碼MtWRKY76的核酸分子的表達盒，所述MtWRKY76是如下a)或b)的蛋白 質： a) 氣基酸序列如SEQ ID No. 2所不的蛋白質； b) 將SEQ ID No. 2中的一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與結瘤 植物結瘤能力和/或植物耐逆性的由a)衍生的蛋白質； C2含有編碼所述MtWRKY76的核酸分子的載體； C3、含有C1所述表達盒的MtWRKY76基因表達載體或導入所述MtWRKY76基因表達載體 的重組微生物。
【文檔編號】C12N1/15GK104059937SQ201310085151
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月18日 優先權日:2013年3月18日
【發明者】王濤, 劉麗平, 董江麗 申請人:中國農業大學