一種hhdA基因缺失的無抗性標記的副豬嗜血桿菌工程菌株及其構建方法

一種hhdA基因缺失的無抗性標記的副豬嗜血桿菌工程菌株及其構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種hhdA基因缺失的無抗性標記的副豬嗜血桿菌菌株及其構建方法。利用重疊PCR技術將HPS野生型菌株hhdA基因上下游序列進行連接，構建到自殺性質粒載體（PEMOC2ΔhhdA）并轉入到E.β2155菌株中，通過結合轉移的方法將PEMOC2ΔhhdA轉入到HPS野生型菌株中篩選出發生單交換的陽性結合子菌株，經有限稀釋連續培養，篩選hhdA基因缺失的無抗性標記的HPS菌株HPSΔhhdA。本發明構建的HPSΔhhdA菌株生長特性和免疫保護原性與親本菌株相似，并且免疫HPSΔhhdA菌株后動物不產生抗hhdA蛋白抗體，可用其作為疫苗用菌株在副豬嗜血桿菌病防控和檢測中區別野生型菌株。
【專利說明】—種hhdA基因缺失的無抗性標記的副豬嗜血桿菌工程菌株及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于動物細菌基因工程【技術領域】，涉及一種hhdA基因缺失的無抗性標記的副豬嗜血桿菌菌株的構建方法。
【背景技術】
[0002]副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPS)是一種多形態、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依賴型、不運動的革蘭氏陰性細小桿菌，屬于巴斯德桿菌科嗜血桿菌屬。該病原能引起豬的多發性漿膜炎、關節炎以及腦膜炎為主要特征的豬革拉澤氏病(Glkser’ sDisease)。目前，該病在多個國家和地區廣泛存在和流行，是造成2周齡到4月齡斷奶仔豬發病和死亡的首要原因；臨床上該病原菌還常常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒和豬瘟病毒等具有免疫抑制作用的病原微生物混合感染，造成了豬病的多樣化和復雜化，嚴重危害了養豬業的發展。
[0003]目前對副豬嗜血桿菌的致病機理及毒力因子的研究尚無定論。早期研究中，主要從菌體結構和組成成分出發，研究了神經氨酸酶、外膜蛋白、轉鐵結合蛋白、生物被膜、莢膜多糖等與毒力的關系。隨著分子生物學技術的發展，更多的新方法用到副豬嗜血桿菌的研究中，如Differential Display RT-PCR技術、基因芯片技術、表達差異捕獲(SCOTS)技術、抑制消減雜交技術等企圖從基因水平上挖掘更多的毒力因子。但上述所發掘的這些毒力相關因子都是處在推測和假定的階段，缺少相關的遺傳操作技術進一步證明這些相關因子與毒力的確切關系以及其分子機制。
[0004]利用同源重組技術構建基因缺失菌株已在其它病原菌中揭示了大多數可疑基因的功能，但該技術在副豬嗜血桿菌方面的應用還存在爭議和難度。Anna等研究發現副豬嗜血桿菌具有一個cAMP依賴性自然轉化系統，能夠攝取含有ACCGAACTC序列信號肽(USS)的DNA，在改進諸如cAMP濃度 、DNA濃度和外源DNA的曝光時間等參數后，構建了一個含有卡那霉素抗性基因標記的thy (編碼胸營酸合成酶)基因缺失突變菌株(Anna B, MElena Garridoj Ignacio B， et al.Colonization capacity and serum bactericidalactivity of Haemophilus parasuis thy mutants.1nternational Microbiology，2006，9: 297-301)。Zhang等利用上述cAMP依賴性自然轉化系統構建HPS基因缺失菌株并沒有成功，反而利用ACCGCTTGT序列信號肽在不依賴cAMP的情況下，用慶大霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因作為篩選標記，構建了 HPS血清4型SC096菌株一系列基因缺失突變菌株(Zhang B，Feng S，et al.Serum resistance in Haemophilus parasuis SC096strain requiresouter membrane protein P2 expression.FEMS Microbiol Lett, 2012，326: 109 - 115。Zhang B，He Y，et al.Cytolethal distending toxin (CDT) of theHaemophilus parasuis SC096 strain contributes to serum resistance and adherenceto and invasion of PK-15 and PUVEC cells.Vet Microbiol, 2012，157: 237-242)。張念章等利用構建的自殺質粒pDS-HPhhdA-Kan電轉化到HPS中涂于卡那霉素的TSA平板上，將卡那霉素的TSA平板上生長的菌落轉印到含5%蔗糖的TSA平板上，仔細觀察在卡那霉素性平板上生長而在蔗糖平板上不生長的菌落，將其命名為HPSAhhdA (張念章.副豬嗜血桿菌hhdA基因缺失菌株的構建及胞外絲氨酸蛋白酶免疫原性的研究[D].中國農業科學院預防獸醫學，2011)。利用上述自然轉化法和電轉化方法雖構建了相應基因缺失突變菌株，但所構建的基因缺失突變菌株都是利用抗性基因來替代目的基因。從而根據突變菌株表型的變化來驗證某種基因的功能不太確切，因為細菌的自身機能代謝調控是相互作用相互依賴的，這種突變菌株表型的變化有可能是抗性基因的插入所引起的調控，而非目的基因的缺失引起。另外用抗性基因作為篩選標記獲得的弱毒免疫保護菌株，由于抗性基因的存在，從生物安全的角度考慮，阻礙了該基因缺失突變菌株作為疫苗用菌株的應用。馬艷平等通過結合轉移的方法，利用自殺性質粒載體PDM4攜帶缺失基因的同源臂序列，在15%的蔗糖培養基上獲得了無抗性標記的密度感應信號相關基因IuxS和鞭毛基因pilA的基因缺失株(馬艷平.副豬嗜血桿菌生物被膜形成相關基因IuxS和pilA的克隆和功能鑒定[D].中國農業科學院預防獸醫學，2010)。但本科室在利用相應技術構建基因缺失菌株時，發現本研究室分離鑒定的HPS血清5型野生型菌株在含有15%蔗糖的培養基上不生長，無法用蔗糖的負篩選標記獲得相應的基因缺失菌株，利用蔗糖的負篩選標記來獲得HPS相應菌株的基因缺失存在一定的局限性。
[0005]相關研究表明hhdA基因存在于大多數有毒菌株中而無毒菌株為陰性，將副嗜血桿菌進行模擬體內培養時，用基因芯片技術鑒定到了 hhdA基因的相對表達量發生了上調。推測該基因可能與HPS的毒力相關，但該基因在副豬嗜血桿菌中所發揮的生物學功能還不清楚。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于提供一種hhdA基因缺失的無抗性標記的副豬嗜血桿菌菌株的構建方法，以及由此得到的菌株及其應用。
[0007]本發明所采取的技術 方案是:
一種hhdA基因缺失的無抗性標記的副豬嗜血桿菌工程菌株的構建方法，包括如下步
驟:
(1)擴增副豬嗜血桿菌hhdA基因上游序列A和下游序列B，利用重疊PCR方法將上游序列A和下游序列B拼接在一起，得到融合基因序列C ；
(2)將步驟(1)得到的融合基因序列C連接到自殺性質粒載體PEM0C2中，得到自殺性質粒載體PEM0C2 Δ hhdA ；
(3)通過結合轉移法將自殺性質粒載體PEM0C2Δ hhdA轉入副豬嗜血桿菌野生型菌株中，篩選陽性單交換結合子菌株；
(4)挑選陽性單交換結合子菌株在含NAD的培養基中進行有限稀釋連續培養，PCR法篩選hhdA基因缺失的無抗性標記的副豬嗜血桿菌工程菌株HPS Δ hhdA。
[0008]優選的，步驟(1)和步驟(3)所述的副豬嗜血桿菌為同一血清型的副豬嗜血桿菌。
[0009]優選的，步驟(1)和步驟(3)所述的副豬嗜血桿菌為HPS血清5型野生型菌株。
[0010]優選的，步驟(3)所述副豬嗜血桿菌為HPS 5型Hll株(副豬嗜血桿菌HPS-H11，Haemophilus parasuis HPS-H11)，已于2013年7月6日保藏于中國典型培養物保藏中心(CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION，CCTCC)，地址:中國，武漢，武漢大學，保藏編號為 CCTCC NO: M 2013316。
[0011]優選的，步驟(1)所述hhdA基因上游序列A如SEQ ID NO:1所示，所述hhdA基因下游序列B如SEQ ID NO:2所示,所述融合基因序列C如SEQ ID N0:3所示。
[0012]所述hhdA基因缺失的無抗性標記的副豬嗜血桿菌工程菌株的構建方法中，步驟
(3)的具體操作為:
O將自殺性質粒載體PEM0C2 AhhdA熱應激轉入到E.感受態中，得到含有
PEM0C2AhhdA 質粒的 Ε.盧之7紐菌株厶 β2155 (PEM0C2 Δ hhdA)；
2)將萬.β2155 (PEM0C2 Λ hhdA)和副豬嗜血桿菌菌株在含二氨基庚二酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的TSA培養基上培養，然后沖洗菌體涂于含有氯霉素和NAD的TSA培養基上培養過夜，挑取單菌落接種于含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的TSB培養基中增菌，設計特異性引物hhdA-up-F和hhdA-down-R對菌液進行PCR擴增，能同時擴增出自殺性質粒載體PEM0C2 Δ hhdA上的融合基因序列C和副豬嗜血桿菌野生型菌株上的(上游序列A+hhdA基因+下游序列B)片段的為陽性單交換結合子菌株。
[0013]步驟(4)的具體操作為:將篩選到的陽性單交換結合子菌株接種到含有NAD的培養基中進行有限稀釋連續培養，設計特異性引物對菌液進行PCR鑒定，用引物hhdA-up-F和hhdA-down-R若擴增出特異的一條1136bp的條帶,而用引物hhdA_F和hhdA-R沒有擴增出hhdA基因的菌株即為目的菌株HPS Δ hhdA。
[0014]由上述方法構建得到的hhdA基因缺失的無抗性標記的副豬嗜血桿菌菌株HPS Δ \i\idk(.Haemophi`lus parasuis HPSAhhdA),已于 2013 年 7 月 6 日保藏于中國典型培養物保藏中心(CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION, CCTCC)，地址:中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:M 2013317。
[0015]由以上方法構建得到的hhdA基因缺失的無抗性標記的副豬嗜血桿菌菌株HPS Δ hhdA在制備副豬嗜血桿菌基因工程缺失疫苗上的應用。
[0016]下面以HPS血清5型野生型Hll菌株為基礎構建hhdA基因缺失的無抗性標記的副豬嗜血桿菌菌株為例，進一步說明本發明的方案:
(I) HPS-hhdA基因上下游序列的擴增:根據GenBank中登錄的HPS-SH0165菌株全基因序列，序列號為CP-001321，設計HPS-hhdA基因上游序列引物hhdA-up-F和hhdA_up-R，下游序列引物hhdA-down-F和hhdA-down-R，以HPS 5型野生型菌株為模板進行PCR擴增HPS-hhdA基因上游序列560bp (SEQ ID NO:1)和下游序列576bp (SEQ ID N0:2)，各條引物序列如下所示:
hhdA-up-F: 5，-aaagcggccgcgtgaccgctagcacccactgtc-3，(SEQ ID NO:4),含有Not I酶切位點；
hhdA-up-R: 5，- acttgcagaaacgctcacgctaattgtaattcacttgccac_3， (SEQ ID NO:5)；hhdA-down-F: 5’- gtggcaagtgaattacaattagcgtgagcgtttctgcaagt-3> (SEQ IDN0:6)；
hhdA-down-R: 5’ -cgcgtcgacttgcccagttatcttcccagcct_3’ (SEQ ID NO:7),含有Sal I酶切位點。
[0017](2) HPS-hhdA基因上游序列和下游序列的拼接:采用hhdA-up-F引物和hhdA-down-R引物對純化的hhdA基因上游序列和下游序列片段進行重疊PCR拼接，得到長為1136bp的hhdA基因上下游連接融合基因序列片段(SEQ ID N0:3)。
[0018](3) HPS-hhdA基因的融合基因序列片段(SEQ ID NO: 3)插入自殺性質粒載體PEM0C2中:將回收的融合基因序列片段(SEQ ID N0:3)用Not I和Sal I雙酶切，同時用Not I和Sal I雙酶切自殺性質粒載體PEM0C2，用T4 DNA連接酶將SEQ ID NO: 3序列片段連接到自殺性質粒載體PEM0C2上，得到PEM0C2 Δ hhdA質粒；將PEM0C2 Δ hhdA質粒熱應激轉入到E.β2155感受態中，經氯霉素抗性篩選和雙酶切鑒定得到含有PEM0C2 Δ hhdA質粒的 E.β2155 菌株 Ε.β2155 (PEM0C2 Δ hhdA)。
[0019](4) PEM0C2 Λ hhdA轉入HPS野生型菌株中獲得陽性單交換結合子菌株:利用結合轉移的方法將PEM0C2 Δ hhdA轉入HPS野生型菌株中，首先將Ε.β2155 (PEM0C2 Δ hhdA)和HPS血清5型野生型菌株在含二氨基庚二酸(DAP)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的TSA(胰蛋白胨大豆瓊脂)培養基上培養8小時，然后沖洗菌體涂于含有氯霉素和NAD的TSA (胰蛋白胨大豆肉湯)培養基上培養過夜，挑取單菌落接種于含NAD的TSB培養基中增菌,而后用hhdA-up-F和hhdA-down-R引物對菌液進行PCR擴增，鑒定獲得陽性單交換結合子菌株，陽性單交換子菌株可同時擴增出兩條基因片段，即長1136bp的PEM0C2AhhdA質粒上的融合基因片段SEQ ID NO: 3和長3068bp的HPS野生型菌株基因片段(上游序列A+hhdA基因+下游序列B)。
[0020](5) HPS-hhdA基因無抗性標記缺失菌株的篩選和獲得:利用有限稀釋連續培養法和特異性基因片段的擴增，篩選獲得hhdA基因缺失菌株。首先將獲得的陽性單交換結合子菌液以1:1000的比例接種到新的TSB培養基(含NAD)中進行增菌，過夜培養后用hhdA-up-F和hhdA-down-R引物進行PCR鑒定，若擴增產物出現兩條帶1136bp和3068bp，從新增菌液中吸取I μ L菌液稀釋到100 μ L的培養基中涂于TSA (含NAD)平板上，過夜培養后挑取單菌落接種于TSB (含NAD)培養基中進行增菌，并用hhdA-up-F和hhdA-down-R引物進行PCR擴增，若擴增出特異的一條1136bp的條帶，而用hhdA-F和hhdA-R引物進行PCR擴增產物為陰性，即成功獲得副豬嗜血桿菌hhdA基因無標記缺失菌株(HPS Δ hhdA)。
[0021]hhdA-F:5’ _taaaaa ccttagcgtaggtggc_3’ (SEQ ID NO:8)，
hhdA-R:5，-tgtttcgctgactttattcac-3，(SEQ ID N0:9)。
[0022](6)通過大量生物學實驗數據證明HPS Λ hhdA菌株基因缺失遺傳穩定，其生長特性和免疫保護原性同親本菌株相似，并且該菌株缺失了 hhdA蛋白，免疫動物后不產生相應的hhdA蛋白抗體，將為副豬嗜血桿菌基因工程缺失疫苗的制備及鑒別診斷方法的建立奠定重要基礎。
[0023]本發明的有益效果是:
(I)本發明針對副豬嗜血桿菌的hhdA基因，設計相應的引物，利用PCR技術，獲得hhdA基因上下游序列，通過重疊PCR技術將hhdA基因上下游序列進行拼接，最終克隆入自殺性質粒載體PEM0C2，成功構建了 hhdA基因敲除質粒，即PEM0C2 Δ hhdA。通過結合轉移的方法將PEM0C2 Δ hhdA質粒轉入HPS野生型菌株中，經同源重組以及特異性序列片段PCR擴增等方法，成功篩選獲得hhdA基因缺失的無抗性標記的副豬嗜血桿菌菌株，即HPS Δ hhdA菌株。
[0024](2)本發明對HPS Δ hhdA菌株的遺傳穩定性、生長特性和免疫保護性進行了分析，與親本菌株相似。且該菌株缺失了 hhdA蛋白，免疫動物后不產生相應的hhdA蛋白抗體。可作為研制副豬嗜血桿菌基因工程缺失疫苗的候選菌株之一，并且該基因缺失菌株不含抗性標記，完全符合疫苗生物安全性要求。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1:副豬嗜血桿菌hhdA基因無抗性標記缺失菌株構建圖譜；
圖2:副豬嗜血桿菌hhdA基因上、下游序列擴增及重疊PCR連接產物電泳圖(M: DL2000DNA Mark, 1: hhdA上游序列，2: hhdA下游序列，3: hhdA上、下游序列的融合基因)；
圖3:酶切鑒定構建的自殺性質粒PEM0C2AhhdA(M: DL 5000 DNA Mark, 1:構建的自殺性質粒 PEM0C2 Δ hhdA, 2:空質粒 PEM0C2 )；
圖4:PCR鑒定HPS Λ hhdA缺失菌株單交換接合子(M:DL 5000 DNA Mark, S1、S2、S3、S4:篩選的HPS Λ hhdA缺失株單交換接合子；Ρ1:Ε.β 2155 (PEM0C2 Δ hhdA), Hl:野生型副豬嗜血桿菌)；
圖5屮0?鑒定冊5八汕(^菌株(]?:01^ 5000 DNA Mark，4:篩選的HPS Λ hhdA菌株；1、2、
3、5、6、7、8、9、10、11、12:回復野生型副豬嗜血桿菌基因特征)；
圖6 =HPS野生型菌株和HPS Δ hhdA菌株特異性序列的擴增(I:hhdA-F和hhdA-R引物擴增HPS Δ hhdA菌株hhdA基因序列，2:hhdA-F和hhdA-R引物擴增HPS野性型菌株hhdA基因序列，3:hhdA-up-F和hhdA-down-R引物擴增HPS野性型菌株基因序列，4:hhdA-up-F和hhdA-down-R 引物擴增 HPSAhhdA 菌株基因序列，M:DL 5000 DNA Mark)；
圖7:HPS Λ hhdA菌株遺傳穩定性的鑒定(M: DL 5000 DNA Mark, H1:野生型副豬嗜血桿菌，D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7:為HPS Λ hhdA基因缺失菌株傳3代、6代、9代、12代、15代、18 代、21 代)；
圖8 =HPS野生型菌株與HPS Δ hhdA菌株生長特性的比較；
圖9: HPS Λ hhdA菌株免疫豚鼠后hhdA蛋白抗體水平檢測。
[0026]圖10:HPS hhdA基因ORF區序列表達載體的構建、蛋白表達純化及免疫反應原性的鑒定(Al: hhdA基因表達載體的構建鑒定，Ml: DL2000 mark ;A2: SDS-PAGE鑒定hhdA蛋白；M2:蛋白質marker ;A3:Western-blot鑒定hhdA蛋白的免疫反應原性,M3:預染蛋白質marker)。
【具體實施方式】
[0027]下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0028]實施例1
實施例以本科室分離鑒定的副豬嗜血桿菌血清5型野生型Hll HQbemophilusparasuis HPS-HlI) ChhdA+)(已于2013年7月6日保藏于中國典型培養物保藏中心(CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION，CCTCC)，地址:中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO: M 2013316)為親本菌株，針對hhdA基因上下游序列分別設計特異性引物，擴增上下游同源臂，利用重疊PCR的方法將上下游序列進行連接，構建自殺性質粒載體PEM0C2 Δ hhdA,結合轉移的方法將PEM0C2 Δ hhdA轉入親本菌株中，經相應方法的篩選和鑒定最終獲得hhdA基因無抗性標記缺失菌株(HPS Δ hhdA)。具體步驟如下:
1、HPS-hhdA基因上、下游序列的擴增根據GenBank中登錄的HPS-SH0165菌株全基因序列，序列號為CP-001321，設計擴增HPS-hhdA基因上游序列的一對引物hhdA-up-F和hhdA-up-R，其中引物hhdA-up-F加有Not I限制性酶切位點(下劃線標出)以及保護性堿基。擴增HPS-hhdA基因下游序列的一對引物hhdA-down-F和hhdA-down-R,其中引物hhdA-down-R加有Sal I限制性酶切位點(下劃線標出)以及保護性堿基。以HPS血清5型野生型菌株為模板進行PCR擴增hhdA基因上游序列560bp (如SEQ ID NO:1所示)和下游序列576bp (如SEQ ID N0:2所示)。引物序列如下所示:
hhdA-up-F:5，-aaagcggccgcgtgaccgctagcacccactgtc-3，(SEQ ID NO:4)；hhdA-up-R:5，- acttgcagaaacgctcacgctaattgtaattcacttgccac -3， (SEQ ID NO:5)；hhdA-down-F:- gtggcaagtgaattacaattagcgtgagcgtttctgcaagt -3’ (SEQ IDNO:6)；
hhdA-down-R:5? -cgcgtcgacttgcccagttatcttcccagcct_3， (SEQ ID NO:7)。
[0029]HPS-hhdA基因上游序列的PCR擴增體系為50 μ L:菌液模板2 μ L, 5XPrimeSTARBuffer 10 μ L, 100 μ mol/L hhdA-up-F/R 引物各 I μ L, 2.5 mmol/L dNTP Mixture 4 μ L,
2.5U/μ L PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μ L, ddH20 31.5 μ L。PCR 反應條件為:95°C變性5 min后進入循環，循環參數為94°C 45s, 60°C 20s, 72°C 50s，30個循環后，72°C延伸10 min。結束后用濃度為1%的瓊脂糖凝膠進行鑒定，并純化回收HPS-hhdA基因上游序列560bp的特異性目的片段(見圖2)，如SEQ ID NO:1所示。
[0030]HPS-hhdA基因下游序列的PCR擴增體系為50 μ L:菌液模板2 μ L, 5XPrimeSTARBuffer 10 μ L, 100 μ mol/L hhdA-up-F/R 引物各 I μ L, 2.5 mmol/L dNTP Mixture 4 μ L,
2.5U/μ L PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μ L, ddH20 31.5 μ L。PCR 反應條件為:95°C變性5 min后進入循環，循環`參數為94°C 45s, 60°C 20s, 72°C 50s，30個循環后，72°C延伸10 min。結束后用濃度為1%的瓊脂糖凝膠進行鑒定，并純化回收HPS-hhdA基因下游序列576bp的特異性目的片段(見圖2) JBSEQ ID NO: 2所示。
[0031 ] 、HPS-hhdA基因上游序列和下游序列的拼接
采用重疊PCR的方法將上述(I)中擴增純化回收的hhdA基因上游序列(SEQ和IDNO:1)下游序列(SEQ ID NO: 2)進行拼接。
[0032]重疊 PCR 反應第一步:5 XPrimeSTAR Buffer 10μ L,2.5 mmol/L dNTP Mixture4 μ L, hhdA 基因上游序列 / 下游序列各 2 μ L, 2.5 U/ μ L PrimeSTAR HS DNA Polymerase
0.5 μ L，ddH20 31.5 μ L，總體積50 μ L，然后平分到兩個PCR管中，按每管25 μ L的體系進行第一步PCR擴增。PCR反應條件為:95°C變性5 min后進入循環，循環參數為94°C 45s，50 °C 20s，72 °C 50s，5個循環后，72 °C延伸10 min。擴增結束后進行第二步PCR反應，首先配制 50 μ L 擴增體系:5 XPrimeSTAR Buffer 10 μ L，2.5 mmol/L dNTP Mixture4 μ L, 100 μ mol/L hhdA-up-F 弓 I 物 2 μ L，100 μ mol/L hhdA-down-R 引物 2 μ L, 2.5 U/ μ LPrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μ L, ddH20 31.5 μ L，然后按每管 25 μ L 體系平分到第一步PCR反應結束的兩個管中混勻，每管現為50 μ L體系進行第二步PCR擴增。PCR反應條件為:95°C變性5 min后進入循環，循環參數為94°C 45s, 60°C 20s, 72°C 70 s，20個循環后，72°C延伸10 min。結束后用濃度為1%的瓊脂糖凝膠進行鑒定，并純化回收HPS-hhdA基因上下游拼接的融合基因序列片段，大小1136bp (見圖2) ^SEQ ID N0:3所示。[0033]、重組自殺性質粒載體PEM0C2Δ hhdA的構建
將回收的hhdA基因上下游拼接的融合基因序列片段(SEQ ID N0:3)用Not I和Sal I雙酶切，同時用Not I和Sal I雙酶切自殺性質粒載體PEM0C2，然后將SEQ ID NO: 3序列片段同自殺性質粒載體PEM0C2進行連接。體系如下:SEQ ID NO: 3序列(Not 1-Sal I酶切)4 μ L，PEM0C2 (Not 1-Sal I 酶切)4 μ L，10 X 連接緩沖液 I μ L，T4 DNA 連接酶 I μ L，4°C連接16小時，然后熱應激轉化到E.紐感受態中，涂布添加有終濃度50μ g/mL氯霉素和DAP的LB平板上，37°C培養16小時，挑取單菌落接種至含有50 μ g/mL氯霉素和DAP的LB液體培養基中，提取質粒進行鑒定。獲得的質粒用Not I和Sal I雙酶切，1%的瓊脂糖凝膠觀察1136bp的目的片段(見圖3)，然后將重組質粒插入的序列進行測序，以驗證構建的正確性，篩選得到轉化了質粒PEM0C2AhhdA的E.盧之7紐菌株E.盧i75^(pEM0C2 Λ hhdA)。
[0034]、PEM0C2 Δ hhdA轉入HPS野生型菌株中獲得陽性單交換結合子菌株
以轉化了質粒PEM0C2 Δ hhdA的Ε.β2155菌株為供體菌，HPS血清5型野生型Hll菌株為受體菌，利用結合轉移的方法將PEM0C2 Δ hhdA轉入HPS血清5型野生型菌株中。
[0035]供體菌在含有50 μ g/mL氯霉素和DAP的LB液體培養基中37 °C培養過夜，受體菌在含有10 μ g/mL NAD和10%胎牛血清的TSB液體培養基中37°C培養過夜。然后將培養的兩種菌體分別用TSB洗兩遍，調整菌液濃度至0D600為0.8，將供體菌和受體菌按1:2的體積比進行混合，涂布于TSA培養基(50 μ g/mL氯霉素、50 μ g/DAP、10 μ g/mL NAD、10%胎牛血清)上培養8小時；用TSB進行沖洗收集菌體涂于含有50 μ g/mL氯霉素和10 μ g/mL NAD的TSA培養基上37°C培養過夜，挑取單菌落接種于含有10 μ g/mL NAD和10%胎牛血清TSB培養基中進行增菌。用hhdA-up-F和hhdA-down-R引物對菌液進行PCR擴增鑒定，擴增體系為25 μ L:菌液模板 I μ L，10 X PCR 緩沖液 2.5 μ L，25 mmol/L MgCl2 I μ L，2.5 mmol/L dNTPs2 μ L，100 μ mol/L hhdA-up-F 引物 0.5 μ L，100 μ mol/L hhdA-down-R 引物 0.5 μ L，2.5 U/μ L rTaq 0.25 μ L，dd H2O 17.25 μ L。PCR反應條件為:95°C變性5 min后進入循環，循環參數為94°C 45s, 60°C 40s, 72°C lmin40s，30個循環后，72°C延伸10 min。結束后用濃度為1%的瓊脂糖凝膠進行鑒定，發生同源重組的陽性單交換子菌液可同時擴增出兩條基因片段一條為1136 bp目的片段(即PEM0C2 Λ hhdA質粒上的融合基因片段SEQ ID N0:3)，另一條為3068bp的目的片段(即上游序列A+hhdA基因+下游序列B)，見圖4。
[0036]、HPS-hhdA基因無抗性標記缺失菌株HPS Δ hhdA的篩選和獲得
在獲得陽性單交換接合子的基礎上，利用有限稀釋連續培養法和特異性基因片段的擴增，篩選獲得HPS-hhdA基因缺失菌株。
[0037]首先將獲得的陽性單交換結合子菌液以1:1000的比例接種到新的TSB培養基(10 μ g/mL NAD、10%胎牛血清)中進行增菌，37°C過夜培養后用hhdA-up-F和hhdA-down-R引物進行PCR鑒定，擴增體系為25 μ L:菌液模板I μ L，10XPCR緩沖液2.5 μ L，25 mmol/L MgCl2 IyL, 2.5 mmol/L dNTPs 2 μ L, 100 μ mol/L hhdA-up-F 引物 0.5 μ L, 100 μ mol/LhhdA-down-R 引物 0.5 μ L，2.5 U/μ L rTaq 0.25 μ L, dd H2O 17.25 μ L。PCR 反應條件為:95°C變性5 min后進入循環，循環參數為94°C 45s, 60°C 40s, 72°C lmin，30個循環后，72°C延伸10 min。結束后用濃度為1%的瓊脂糖凝膠進行鑒定，若擴增產物中有1136bp條帶出現。再從相應的新增菌液中吸取I μ L菌液稀釋到100 μ L的TSB中涂于TSA( 10 μ g/mL NAD、10%胎牛血清)平板上，37°C過夜培養后挑取單菌落接種于TSB (10 μ g/mL NAD、10%胎牛血清)培養基中進行增菌。37°C過夜培養后用hhdA-up-F和hhdA-down-R引物進行PCR擴增鑒定，擴增體系為25 μ L:菌液模板I μ L，10 X PCR緩沖液2.5 μ L，25 mmol/L MgCl2 I μ L，
2.5 mmol/L dNTPs 2 μ L, 100 μ mol/L hhdA-up-F 引物 0.5 μ L, 100 μ mol/L hhdA-down-R 引物 0.5 μ L，2.5 U/μ L rTaq 0.25 μ L, dd H2O 17.25 μ L。PCR 反應條件為:95°C 變性 5 min后進入循環，循環參數為94°C 45s，60°C 40s，72°C lmin，30個循環后，72°C延伸10 min。結束后用濃度為1%的瓊脂糖凝膠進行鑒定，若擴增產物出現特異性的一條1136bp的目的條帶，即篩選獲得HPS-hhdA基因缺失的無抗性標記菌株(HPS Δ hhdA)(見圖5)。
[0038]用hhdA-F和hhdA-R引物對獲得的hhdA基因缺失菌株進一步PCR擴增鑒定，同時設立HPS野生型菌株對照，擴增體系為25 μ L:菌液模板I μ L，10XPCR緩沖液2.5 μ L，25mmol/L MgCl2 I μ L, 2.5 mmol/L dNTPs 2 μ L, 100 μ mol/L hhdA-F 引物 0.5 μ L, 100 μ mol/LhhdA-R 引物 0.5 μ L，2.5 U/μ L rTaq 0.25μ L，dd H2O 17.25 μ L。PCR 反應條件為:95°C變性5 min后進入循環，循環參數為94°C 45s, 53°C 40s, 72°C 1.5min，30個循環后，72°C延伸10 min。結束后用濃度為1%的瓊脂糖凝膠進行鑒定，HPS-hhdA基因缺失菌株擴增的基因片段為陰性，從HPS野生型菌株可擴增出hhdA基因1932bp的目的片段(見圖6)。hhdA-F和hhdA-R引物對的序列如下所示:
hhdA-F: 5’ -taaaaaccttagcgtaggtggc-3’ (SEQ ID NO:8)；
hhdA-R: 5’ -tgtttcgctgactttattcac-3’ (SEQ ID N0:9)。
[0039]實施例2
HPS Δ hhdA菌株基因缺失遺傳穩定性鑒定
將實施例1制備的hhdA基因缺失菌株HPS Δ hhdA在TSA (10 μ g/mL NAD、10%胎牛血清)平板上進行劃線培養，挑取單菌落接種到TSB (10 μ g/mL NAD、10%胎牛血清)培養基中，72°C、200 r/min培養16 h，增殖的菌液為一代。然后將一代菌液再進行TSA平板上劃線培養，挑取單菌落接種到TSB培養 基中72°C振蕩培養過夜，增殖的菌液為二代，這樣反復在TSA和TSB培養基中進行傳代，連續培養21代，每隔3代對增殖的菌液用hhdA-up-F和hhdA-down-R引物進行PCR擴增鑒定，擴增體系為25 μ L:菌液模板I μ L，10XPCR緩沖液 2.5 μ L，25 mmol/L MgCl2 I μ L,2.5 mmol/L dNTPs 2 μ L, 100 μ mol/L hhdA-up-F引物 0.5 μ L，100 μ mol/L hhdA-down-R 引物 0.5 μ L，2.5 U/μ L rTaq 0.25 μ L，dd H2O17.25 μ L0 PCR反應條件為:95°C變性5 min后進入循環，循環參數為94°C 45s, 60°C 40s，72°C lmin，30個循環后，72°C延伸10 min。結束后用濃度為1%的瓊脂糖凝膠進行鑒定。如圖7所示HPSAhhdA菌株3代、6代、9代、12代、15代、18代、21代菌液模版所擴增的結果均無差別，表明本發明制備的基因缺失菌株HPSAhhdA能夠穩定遺傳。
[0040]挑選菌株HPS AhhdA (.HaemophiIus parasuis HPS Δ hhdA)的單菌落擴大培養后于2013年7月6日保藏于中國典型培養物保藏中心(CHINA CENTER FOR TYPE CULTURECOLLECTION, CCTCC)，地址:中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:M 2013317。
[0041]實施例3
HPS Δ hhdA菌株生長特性的鑒定
將實施例1制備的hhdA基因缺失菌株HPS Λ hhdA和野生型菌株復壯后，分別接種于TSB培養基中，37 °C振蕩培養12 h左右并進行平板菌落計數作為種子液。根據計數結果分別將缺失菌株和野性型菌株I X IO7菌落接種到5mL的TSB液體培養基中，37 ° C 200r/min振蕩培養，其間每隔2 h取樣進行平板菌落計數，將實驗結果繪制成曲線，分析鑒定基因缺失菌株的生長特性。如圖8所不HPS Δ hhdA菌株與野生型菌株的生長特性相似。
[0042]實施例4
HPS Δ hhdA菌株對豚鼠免疫保護性的鑒定
將實施例1制備的hhdA基因缺失菌株HPS Δ hhdA在TSA平板上劃線復蘇后，分別挑取單菌落接種到TSB液體培養基中，37 ° C 200 r/min振蕩培養10 h，將其做為種子液按照1%的體積比接種到TSB培養基擴大培養，37 ° C 200 r/min振蕩培養10 h后進行平板菌落計數，然后加入甲醛溶液使其終濃度為0.3%, 150 r/min振蕩滅活24 h以上。使用離心機8000 r/min離心10 min，除去上清收集菌體，將收集的菌體使用PBS洗3次，根據菌落計數結果用PBS配制成4 X 109CFU/mL的菌液，用白油作為佐劑與配制的菌液按1:1比例混合制成滅活油疫苗。
[0043]將體重20(T250g健康普通級白化豚鼠進行分組，每組8只，分別使用上述制備的HPSAhhdA菌株滅活疫苗和野生型菌株(Wild-HPS)滅活疫苗通過皮下多點注射進行免疫，并設立未免疫對照組。免疫程序為一免后第15天進行二免,二免后第15天從豚鼠的后肢靜脈采血分離血清。用ELISA方法檢測hhdA蛋白抗體水平，將hhdA蛋白用包被液稀釋成5 μ g/mLUOOyL/孔包被過夜，0.0I g/mL的牛血清白蛋白進行封閉，采集的豚鼠血清1:200稀釋、100 μ L/孔作用30min,山羊抗豚鼠的酶標二抗1:5000稀釋、100 μ L/孔作用30min，加TMB進行顯色后并終止反應，酶標儀讀取0D450nm的吸光值。如圖9所示用野生型菌株滅活疫苗免疫豚鼠后血清中可檢測到hhdA蛋白抗體，而HPS Δ hhdA菌株滅活疫苗免疫豚鼠后血清中hhdA蛋白抗體同對照組相似。采完血清后用HPS野生型菌株對每只豚鼠進行腹腔注射攻毒(2.0X IO9CFU/只)，攻毒后觀察豚鼠的保護率。如表1所示，用HPSAhhdA菌株滅活疫苗免疫豚鼠后同野生型菌株滅活疫苗免疫豚鼠后對豚鼠的攻毒保護相似。
[0044]ELISA檢測中所用到的hhdA蛋白由以下方法制備得到:
根據GenBank中登錄的HPS hhdA基因序列(CP001321)設計引物hhdA-ORF-F:5’ -CGGGATCCATGAAAGAAGAAGCTGGATT-3’ (SEQ ID NO: 10)(下劃線部分為 Bam H 酶切位點)和hhdA-ORF-R:5’ -CCCAAGCTTTGTTTCGCTGACTTTATTC -3’ (SEQ ID NO: 11)(下劃線部分為Hind III酶切位點)擴增hhdA基因ORF區序列(1689bp)。序列鑒定酶切后連接pET_32a (+)載體，轉化BL21(DE3)宿主菌加入IPTG進行大量誘導表達，利用鎳離子樹脂柱進行目的蛋白的純化，SDS-PAGE和Western-blot鑒定表達純化的蛋白(見圖10)。
[0045]表1:HPS Λ hhdA菌株免疫豚鼠的保護性鑒定
_德脾
__12345675__
HPSMhdA _存活死亡存話存活存活存活_存話_存活__
Wild-HPS存活存活存活存活存活死亡存活存話8..5°β
對擺組死亡死亡死亡存活死亡死亡存活死亡——
以上實驗表明，HPS Λ hhdA菌株滅活疫苗免疫動物后不產生相應的hhdA蛋白抗體。可作為研制副豬嗜血桿菌基因工程缺失疫苗的候選菌株之一，并且該基因缺失菌株不含抗性標記，完全符合疫苗生物安全性要求。HPS Δ hhdA菌株將為副豬嗜血桿菌基因工程缺失疫苗的研制及鑒別診斷方法的建立奠定基礎。
[0046]以上實施例僅為介紹本發明的優選案例，對于本領域技術人員來說，在不背離本發明精神的范圍內所進行的任`何顯而易見的變化和改進，都應被視為本發明的一部分。
【權利要求】
1.一種hhdA基因缺失的無抗性標記的副豬嗜血桿菌工程菌株的構建方法，包括如下步驟: (1)擴增副豬嗜血桿菌hhdA基因上游序列A和下游序列B，利用重疊PCR方法將上游序列A和下游序列B拼接在一起，得到融合基因序列C ； (2)將步驟(1)得到的融合基因序列C連接到自殺性質粒載體PEM0C2中，得到自殺性質粒載體PEM0C2 Δ hhdA ； (3)通過結合轉移法將自殺性質粒載體PEM0C2Δ hhdA轉入副豬嗜血桿菌野生型菌株中，篩選陽性單交換結合子菌株； (4)挑選陽性單交換結合子菌株在含NAD的培養基中進行有限稀釋連續培養，PCR法篩選hhdA基因缺失的無抗性標記副豬嗜血桿菌工程菌株HPS Δ hhdA。
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟(1)和步驟(3)所述的副豬嗜血桿菌為同一血清型的副豬嗜血桿菌。
3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟(1)和步驟(3)所述的副豬嗜血桿菌為HPS血清5型野生型菌株。
4.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟(3)所述副豬嗜血桿菌為HPS5型Hll株，已于2013年7月6日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址為中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:M 2013316。
5.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟(1)所述hhdA基因上游序列A如SEQ ID NO:1所示，所述hhdA基因下游序列B如SEQ ID NO: 2所示，所述融合基因序列C 如 SEQ ID NO:3 所示。
6.根據權利要求1、3或5所述的構建方法，其特征在于，步驟(3)的具體操作為: O將自殺性質粒載體PEMOC2 AhhdA熱應激轉入到E.感受態中，得到含有PEMOC2AhhdA 質粒的 Ε.盧之7紐菌株厶 β2155 (PEMOC2 Δ hhdA)； 2)將萬.β2155 (PEMOC2 Λ hhdA)和副豬嗜血桿菌菌株在含二氨基庚二酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的TSA培養基上培養，然后沖洗菌體涂于含有氯霉素和NAD的TSA培養基上培養過夜，挑取單菌落接種于含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的TSB培養基中增菌，設計特異性引物hhdA-up-F和hhdA-down-R對菌液進行PCR擴增，能同時擴增出自殺性質粒載體PEM0C2 Δ hhdA上的融合基因序列C和副豬嗜血桿菌野生型菌株上的(上游序列A+hhdA基因+下游序列B)片段即為陽性單交換結合子菌株。
7.根據權利要求1、3、5或6所述的構建方法，其特征在于，步驟(4)的具體操作為:將篩選到的陽性單交換結合子菌株接種到含有NAD的培養基中進行有限稀釋連續培養，用引物hhdA-up-F和hhdA-down-R對挑取的單菌落培養液進行PCR擴增，若擴增出特異的一條1136bp的條帶，而用hhdA-F和hhdA-R引物沒有擴增出hhdA基因的菌株即為目的菌株HPS ΛhhdA。
8.權利要求1~7任一項所述的構建方法構建得到的hhdA基因缺失無抗性標記的副豬嗜血桿菌菌株HPS Δ hhdA。
9.根據權利要求8所述的hhdA基因缺失的無抗性標記的副豬嗜血桿菌菌株HPSAhhdA,已于2013年7月6日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址為中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:M 2013317。
10.權利要求1~9任一項所述的hhdA基因缺失的無抗性標記的副豬嗜血桿菌菌株HPS Δ hhdA在制備副豬嗜血桿菌基因工程缺失疫苗上的應用 。
【文檔編號】C12N1/20GK103484397SQ201310365372
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年8月20日 優先權日:2013年8月20日
【發明者】宋帥, 李春玲, 楊冬霞, 李淼, 岳磊 申請人:廣東省農業科學院動物衛生研究所