一種生物轉化植物甾醇制備甾體藥物中間體的方法

一種生物轉化植物甾醇制備甾體藥物中間體的方法
【專利摘要】本發明提供一種生物轉化植物甾醇制備甾體藥物中間體的方法，包括以下步驟：1）提供植物甾醇的懸濁液；2）提供一種將植物甾醇轉化為甾體藥物中間體的微生物菌種的靜息細胞；3）將所述植物甾醇的懸濁液以及所述靜息細胞混合，并加入β-環糊精或化學修飾后的β-環糊精充分混勻，培養完成轉化；4）將步驟3）所得轉化液離心，分離上清和菌體，經溶劑提取從上清中分離得到所述甾體藥物中間體。本發明提供的方法在提高了甾醇投料濃度、增加目的產物量、縮短轉化持續時間的同時，還同時實現了菌體、助溶劑以及產物的簡易分離，并實現了菌體與助溶劑的多次重復使用，大大節省了生產成本，適合工業化生產。
【專利說明】一種生物轉化植物留醇制備留體藥物中間體的方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及留醇生物轉化【技術領域】，更具體地涉及一種生物轉化植物留醇制備甾體藥物中間體的方法。
【背景技術】
[0002]留體化合物是一類以環戊烷多氫菲為母核，結構相似的化合物，廣泛存在于動植物組織和某些微生物細胞中，比較常見的有植物留醇、膽固醇、雄酮以及薯蕷皂素等。甾體化合物是生產留體藥物的重要原料。留體藥物對機體起著非常重要的調節作用，是僅次于抗生素的第二大類藥物。在醫藥上占有重要地位的激素類藥物的主要成分如氫化可的松，睪酮、雄酮、孕酮和雌二酮等，都是具有留體結構的藥物。雄-4-烯-3，17-二酮(AD)，雄-1，4- 二烯-3，17- 二酮(ADD)和 9-羥基-雄-4-烯-3，17- 二酮(9-0H-AD)是留體藥物不可替代的中間體。留體藥物中間體、留體化合物和各種留體藥物都含有相同的環戊烷多氫菲的母核結構。已經發現有很多種微生物可以利用植物留醇轉化成這幾種留體藥物中間體。這些微生物包括節細菌、桿菌、分枝桿菌、諾卡氏菌以及短桿菌等。
[0003]長期以來，AD和ADD —直都被用作合成雄性激素和同化類藥物的前體物質。而9-0H-AD在合成制備如皮質類固醇等藥物中是一類重要的前體化合物。9-0H-AD的開發利用已成為近年的研究熱點，因為該中間體可用于合成糖皮質激素、抗炎藥和含有F、Cl等鹵元素的高效皮質激素，因其化學結構上9-0H的存在，借助常規的化學合成手段形成C9, 11-雙鍵體系，從而順利的在C9-位引入一個鹵原子，Cll β -位形成必不可少的功能羥基。這就可解決國內現有薯蕷皂素工藝路線的瓶頸問題一霉菌轉化環氧黃體酮的CU-羥基化的低效性問題，可對國內已有的9-鹵(F、Cl)皮質激素生產，如地塞米松、倍他米松以及Cll-酮結構，如可的松、強的松合成工藝整合進行皮質激素生產產生巨大的影響。早在1979年美國普強制藥公司報道利用偶發分枝桿菌突變株發酵谷留醇斷側鏈，有效積累有用中間體9-0H-AD，以此中間體經7步化學合成，制得乙酸氫化可的松，總收率達36.7%。
[0004]然而植物留醇是一類疏水性化合物，水中的溶解度非常低，限制了其生物利用度；且植物留醇(底物)、AD、ADD和9-0H-AD(產物)可能抑制和毒害微生物，限制了底物投料量和產物的積累量。留醇的低溶解性會引起傳質障礙，并且留醇對菌體有一定的毒性是植物甾醇轉化的瓶頸問題，所以留醇轉化效率往往很低。研究者們采取過很多措施來促進甾醇轉化。在水相轉化體系中，通過添加表面活性劑、環糊精和有機溶劑等助溶劑來增加甾醇轉化率。除此以外，兩相體系和乳化體系同樣也用來提高植物留醇的生物轉化效率。現有技術中，也報道了一些通過添加乙醇、甘油等有機溶劑的單相發酵體系，能夠提高留醇類物質的溶解性，提高微生物的生物轉化率。W09949075A1公開了一種植物甾醇向AD和ADD的微生物轉化方法，并具體公開以下技術特征:利用一種培養基增殖分枝桿菌屬的分枝桿菌MB3683菌種；利用一種或多種增溶劑將植物留醇組合物溶解成溶液；將分枝桿菌MB3683培養物和植物留醇組合物溶液置于生物反應器中，并保持足夠的時間，將植物留醇組合物轉化為 AD、ADD。[0005]此外還有一種利用與水不相容的有機溶劑如辛醇等，與發酵液形成不相容的雙液相系統，該系統的優點是留醇物質的溶解度和生物轉化率都有比較明顯的提高，而且AD和ADD幾乎全部集中在有機相，分離比較容易，但缺點是溶劑對微生物的毒害作用、以及由于溶劑揮發所產生的安全問題，均不利于工業推廣。
[0006]現在工業生產方法大多是含油發酵，并且是生長細胞培養轉化方法，即是在微生物細胞培養前或培養一段時間后，將底物直接加到微生物轉化培養基中，微生物在自身繁殖生長的同時對底物進行生物轉化。這是生物轉化法最簡單和最常用的一種方法。該法的優點是微生物轉化生物轉化容易，缺點是產品的發酵時間長，易產生多種產物，處理分離純化困難。如CN03804973中說明，按照1%的投料濃度時，植物甾醇轉化為AD/ADD的時間在87-91h。如果降低底物的投料濃度，反應時間可以縮短，但相應工業成本會大大提高。經過大約120-168h的生物轉化生產AD和ADD，然后用適當的有機溶劑將AD和ADD進行萃取、分離、結晶并精制，即可得到白色的結晶粉末狀的AD和ADD。中國專利CN101525651A公開了一種雙液相系統中生物降解植物留醇制備雄烯二酮的方法，該專利通過添加葵花油作為有機相，與水相發酵液形成油水雙液相培養系統，并利用分枝桿菌Mycobacterium sp_UV_8在此系統中繁殖并有效轉化植物留醇生產AD，整體轉化率在80%左右，但是該系統中葵花油優良至少達到20%V/V，而投料量卻只有0.6%，雖然其轉化率可以達到80%，但是單次生產量仍然很低，遠遠達不到要求。
[0007]名為“一種采用靜息細胞在濁點系統中進行生物轉化”(CN200310108967)的中國專利中提到，利用分枝桿菌Mycobacterium NRRL B-3683靜息細胞在池點系統發酵膽固醇得到雄-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)。但是由于該濁點系統需要使用非離子表面活性劑triton XlOO或114，這類表面活性劑一般對菌體有害，并且從生態學角度看，它們接觸地下水，水道或者污水系統，即使少量產品滲入地下水就會對水體造成危害，若無政府許可，勿將材料排入周圍環境，實現工業化困難。同時該專利發明人在《中國工程科學》2005年7卷5期73-78頁《兩相分配生物反應器一濁點系統在生物轉化中的應用》中提到“有關大規模表面活性劑回收工藝的報道不多，進一步研究產物與濁點系統中表面活性劑的分離工藝對完善濁點系統在生物過程`中的應用具有實際意義。”說明濁點系統中表面活性劑的回收問題尚未解決。
[0008]中國專利CN101760494A公開了一種采用靜息細胞的雄烯二酮的生物發酵方法，該專利所述的發酵方法將具有降解植物留醇得到AD和ADD的微生物菌種的靜息細胞，加入到植物留醇轉化液中進行第一次靜息細胞轉化反應，使轉化液中植物留醇轉化得到AD和ADD結束后，去除菌體細胞，并將轉化液經溶劑提取得到AD和ADD。該方法的實質為兩步培養法，首先獲得菌體然后進行生物轉化。該專利敘述中，菌體濃度有限，留醇投料較低，菌體重復使用次數有限，不適合工業化生產。且未有效添加菌體保護物質(或抗留醇毒性或抗雜菌污染)，菌種容易退化并有染菌甚至是感染濕噬菌體的風險。
[0009]綜上所述，現有技術的缺陷主要集中于以下幾點:
[0010]I)常規生長細胞發酵法發酵時間長，菌體濃度有限，留醇投料量有限；如果降低底物的投料濃度，雖然反應時間可以縮短，但相應工業成本會大大提高。
[0011]2)現有技術中使用到的助溶劑有非離子表面活性劑triton XlOO或114，這類表面活性劑一般回收問題尚未解決，不能有效的重復使用，且會使產品分離純化困難。并且一般表面活性劑一是對水體有害，屬于環境不友好物質；二是對菌體有害，若加的少不足以起到助溶作用，若加量大會限制留醇底物投料量。
[0012]3)現有技術中會用到的作為助溶劑使用的表面活性劑或有機溶劑，其中，表面活性劑引起發酵過程泡沫問題嚴重，染菌風險大；有機溶劑對微生物的毒害作用、以及由于溶劑揮發所產生的安全問題，均不利于工業推廣。
[0013]4)普通的靜息細胞轉化方法，菌體與留體化合物難分離，菌體易退化，菌體重復使用率低，且存在染菌風險。

【發明內容】

[0014]本發明的目的是提供一種生物轉化植物留醇制備留體藥物中間體的方法，從而克服現有技術中底物投料量低，菌體濃度有限，反應時間長，助溶劑回收困難，且對菌體以及環境有害的缺陷。
[0015]為了解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案:
[0016]提供一種生物轉化植物留醇制備留體藥物中間體的方法，包括以下步驟:1)提供植物留醇的懸濁液；2)提供一種將植物留醇轉化為留體藥物中間體的微生物菌種的靜息細胞；3)將所述植物留醇的懸濁液以及所述靜息細胞混合，并加入β -環糊精或化學修飾后的β -環糊精充分混勻，培養完成轉化；4)將步驟3)所得轉化液離心，分離上清和菌體，經溶劑提取從上清中分離得到所述留體藥物中間體。
[0017]通過將β -環糊精或化學修飾后的β -環糊精加入反應溶液作為助溶劑使用，使得菌體的靜息細胞呈現較好的分散狀態，不僅有利于轉化反應的進行，而且有利于菌體的分離；其次，由于環糊精或化學修飾后的環糊精的自身高溶解度以及對植物留醇的高助溶作用，在分離上清和菌體的過程中，這種助溶劑絕大部分處于水相中，且在轉化過程中，這種助溶劑的無毒性質使菌體的活性得以較好的保持。
[0018]所述步驟4)中分離獲得的菌體和/或上清經溶劑提取后獲得的水相中的β -環糊精或化學修飾后的β_環糊精直接重復使用。
[0019]所述微生物菌種是缺失了 1，2_脫氫酶(KstD)的分枝桿菌，或強化了 1，2_脫氫酶(KstD)的分枝桿菌，或先缺失了 1，2_脫氫酶(KstD)，后強化了 9-羥基化酶(KsH)的分枝桿菌。
[0020]所述化學修飾后的β -環糊精選自:甲基-環糊精、羥基-環糊精、磺酰基-β -環糊精或羥丙基-β -環糊精，優選為羥丙基-β -環糊精或甲基-β -環糊精。其中，羥丙基-β -環糊精在水中溶解度高達600-800g/L，而且不溶于有機溶劑，通過有機溶劑的萃取，方便其與產物的分離。
[0021]所述植物留醇選自:谷留醇，豆留醇，菜油留醇，菜籽留醇中的至少一種或者任意混合物。
[0022]所述甾體藥物中間體包括:雄-4-烯-3，17-二酮(AD)，雄-1,4-二烯-3，17-二酮(ADD)或 9-羥基-雄-4-烯-3，17- 二酮(9-0H-AD)。
[0023]所述靜息細胞通過采用兩級種子培養法培養所述微生物菌種獲得。通過兩級種子擴大培養增強了菌體的生長能力。
[0024]所述微生 物菌種經過兩級種子培養法培養之后，還包括轉入生長培養基中繼續培養，從而更有利于轉化。
[0025]所述生長培養基的配方如下:葡萄糖20g/L，檸檬酸2g/L，(NH4) 2HP043.5g/L，檸檬酸鐵銨 0.05g/L, K2HPO4.3Η200.5g/L，MgSO4.7Η200.5g/L，可溶性淀粉 2g/L，玉米漿 lg/L。該培養基的配方是發明人通過實驗摸索優化而來，經過實驗證明菌體經過該生長培養基的培養之后生長能力得到最大程度的提高。
[0026]所述步驟3 )中β -環糊精與植物甾醇的摩爾比為2:1到1:2之間，優選為1:1。當β-環糊精與植物甾醇的摩爾比1:1時為最好，既不會因過多的環糊精的加入使得體系粘稠性增加，也不會因環糊精量不夠而不能起到助溶包結作用。
[0027]所述步驟4)中所使用的溶劑優選為乙酸乙酯。
[0028]本發明的方法還包括在靜息細胞轉化過程中添加抗生素，目的是防止雜菌的生長，減少染菌風險。
[0029]靜息細胞轉化與生長細胞相比，轉化時間縮短，染菌風險降低；菌體量可以調節，同時可以增大底物投料濃度，縮短轉化反應時間；靜息細胞轉化需要的環糊精和菌體可以重復多次的利用，且與產物及環糊精之間分離方便。
[0030]本發明提供了一種高效的生物轉化植物留醇制備留體藥物中間體的方法，在提高了甾醇投料濃度、增加目的產物量、縮短轉化持續時間的同時，還同時實現了菌體、助溶劑以及產物的簡易分離，并實現了菌體與助溶劑的多次重復使用。本發明所提供的方法所獲得的植物留醇的轉化率接近100%，留體藥物中間體的產量高，菌體和助溶劑甚至可以重復使用高達8次，生產成本大大降低，適合工業化生產。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1是根據本發明的多個優選實施例的流程示意圖。
[0032]圖2是植物甾醇的代謝脈絡圖。
【具體實施方式】
[0033]以下結合具體實施例，對本發明做進一步說明。應當理解，以下實施例僅用于說明本發明而非用于限制本發明的范圍。
[0034]1.材料與方法
[0035]1.1 材料
[0036]1.1.1 菌種
[0037]本發明的實施例主要采用了三支菌株，分別是通過分子改造構建的分枝桿菌菌株Mycobacterium neoaurum NwIB—02、Mycobacterium neoaurum NwIB—04、Mycobacteriumneoaurum NwIB- V 0
[0038]其中，Mycobacteriumneoaurum NwIB-02 是以 Mycobacterium neoaurumNwIBOl 為出發菌株(保藏號為 CCTCCM209094，參見文獻 l[Wei Wei，Shuyue Fan, FengqingWang,Dong zhi Wei (2010)A New Steroid-Transforming Strain of Mycobacteriumneoaurum and Cloning of3-Ketosteroid9 a -Hydroxylase in NwIB-01.Appl BiochemBiotechnol.162:1446 - 1456])，缺失了 1，2-脫氫酶(KstD)的分枝桿菌(參見文獻 2 [WeiWeij Feng-qing Wang, Shu-yue Fan, Dong-zhi Wei (2010)Inactivation and Augmentationof the Primary3-Ketosteroid-Δ1-Dehydrogenase in Mycobacterium neoaurumNwIB-Ol:Biotransformation of Soybean Phytosterols to4-Androstene_3，17—Dioneorl, 4-Androstadiene-3, 17-Dione.App1.Environ.Microbiol.76(13):134578-4582]。
[0039]Mycobacterium neoaurum NwIB-04是以Mycobacterium neoaurum NwIBOl 為出發菌株，強化了 1，2-脫氫酶(KstD)的分枝桿菌(同樣參見文獻2)。
[0040]Mycobacterium neoaurum NwIB- V是以 Mycobacterium neoaurum ATCC25795 為出發菌株，先缺失了 1，2_脫氫酶(KstD)，后強化了 9-羥基化酶(KsH)的分枝桿菌。根據本領域的公知常識以及上述信息可知，該菌株的構建方法均為本領域的常規技術手段，同時可參考上述 Mycobacterium neoaurum NwIB-02 和 Mycobacterium neoaurum NwIB-04 的構建，具體參見上述文獻I和文獻2。
[0041 ] 其中，如圖2所示，植物留醇(谷留醇、豆留醇、菜油留醇和菜籽留醇)在分枝桿菌的作用下可轉化為雄-4-烯-3，17-二酮(AD)，雄-4-烯-3，17-二酮(AD)則可以在1，2-脫氫酶(KstD)作用下生成雄-1,4-二烯-3，17-二酮(ADD)，或者在9-羥基化酶(KsH)作用下生成9-羥基-雄-4-烯-3，17- 二酮(9-0H-AD)。
[0042]1.1.2儀器與分析條件
[0043]搖瓶轉化、種子培養、菌體培養在常規旋轉振蕩式搖床上進行。
[0044]發酵罐轉化、菌體準備:保興發酵罐5L。
[0045]TLC分析:每隔一定時間取出的樣品，用4倍體積的乙酸乙酯連續萃取3次，將3次萃取的乙酸乙酯合并，取IOyL點樣于薄層層析硅膠板HSGF254。展層劑為石油醚(60-900C )/乙酸乙酯(6:4，v/v)，展層結束后將20%濃硫酸噴灑于硅膠板，并置110°C烘烤10-15min顯色，定性觀察留醇 轉化情況。
[0046]HPLC:AD、ADD、9_0H_AD可以通過HPLC檢測。安捷倫1100液相色譜系統，色譜柱為:Hypersil 0DS2,填料粒度:5 μ m,尺寸:4.6mmX 250mm,檢測波長254nm,檢測溫度40°C,流動相為甲醇:水(70:30，v/v)。
[0047]1.2實施方法
[0048]1.2.1 培養基
[0049]種子培養基MYC/01 (g/L):甘油20，檸檬酸2，NH4N032,檸檬酸鐵銨0.05，K2HPO4.3Η200.5，MgSO4.7Η200.5。初始 pH8,121°C，20min，滅菌備用。
[0050]生長培養基MYC/03 (g/L):葡萄糖20，檸檬酸2，(NH4) 2HP043.5，檸檬酸鐵銨0.05，K2HPO4.3Η200.5，MgSO4.7Η200.5，可溶性淀粉 2，玉米漿 I。初始 pH8,115°C，20min，滅菌備用。
[0051]1.2.2培養條件:
[0052]種子培養:100mL種子培養基MYC/01( 1000mL搖瓶)，30°C,200rpm,培養周期2_3d。
[0053]菌體培養:搖瓶培養，IOOmL生長培養基MYC/03 (1000mL搖瓶)，30°C，200rpm，培養周期2-3d。
[0054]甾醇轉化:搖瓶轉化IOOmL靜息細胞轉化體系(1000mL搖瓶)，30°C，200rpm,培養周期3d。發酵罐轉化3L靜息細胞轉化體系(5L發酵罐)，30°C，通氣量0.5vvm。
[0055]1.2.3種子培養:種子培養采取兩級種子培養。將甘油凍存的分枝桿菌接種到一級種子培養基MYC/01中，待生長達到對數中期時，以5%接種量接種到二級種子培養基中培養至對數中期。其中，二級種子培養基與一級種子培養基是一樣的，一級種子作為活化菌株用，二級種子作為擴大培養增強菌體生長能力用。
[0056]1.2.4菌體培養過程:將準備好的二級種子以10%接種量接種到生長培養基MYC/03中，培養3d，收集菌體。
[0057]1.2.5菌體收集處理過程:將培養好的菌體6000rpm, IOmin離心，以去離子水(pH8)洗兩遍,離心稱重菌體。
[0058]1.2.6植物留醇母液配制:因為植物留醇是微水溶性化合物，要提前將之配成均勻的懸濁液。植物留醇懸濁液配置的過程(每L):準確稱量200g植物留醇粉末，加入少量水，置于電爐上攪拌邊加熱至留醇處于懸濁狀態，繼續加熱攪拌一段時間至留醇處于較均勻狀態后，移至磁力攪拌器中持續攪拌至室溫，備用。
[0059]1.2.7植物留醇轉化過程:轉化體系中，將β -環糊精或化學修飾后的β -環糊精及配好的植物留醇懸濁母液及備好的菌體，快速混合均勻，定容至體系額定體積。定期補充水量至額定體積。整個體系為去離子水(ρΗ8)。
[0060]1.2.8菌體的重復使用:β -環糊精或化學修飾后的β -環糊精的加入使得菌體與產物易于分離。此外，由于環糊精或化學修飾后的環糊精的加入，菌體還呈現非常好的分散狀態，易于反應的進行及菌體的分離。由于環糊精或化學修飾后的環糊精的高溶解度及對類固醇化合物的高助溶作用，經離心沉淀菌體時，β -環糊精或化學修飾后的β_環糊精及體系中的類固醇絕大多數處于水相中，且在轉化過程中，β_環糊精或化學修飾后的環糊精的無毒性質使菌體的活性可以較好的保持。離心后的菌體經水或緩沖液洗滌后可以重復使用于第二次轉化，如此重復，菌體可以重復使用多次。[0061]1.2.9 β -環糊精的重復使用:雖然β -環糊精或化學修飾后的β -環糊精這種材料在價格上不是很有優勢，但是本發明通過增加β_環糊精或化學修飾后的β_環糊精的使用次數進而減少成本的投入。而β_環糊精或化學修飾后的β_環糊精本身屬于易溶于水，不溶于有機溶劑的。在產物萃取時會使得產物與環糊精或化學修飾后的環糊精相分離，去除有機相后，水相中溶有的極少部分的產物，不妨礙環糊精或化學修飾后的環糊精的下一次使用，如此重復，環糊精或化學修飾后的環糊精可以重復使用多次。
[0062]1.2.10產物的分離:各轉化組所取樣品，以乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取液，先TLC初步觀察轉化情況后以HPLC測定具體含量。
[0063]如圖1所示，即為根據本發明的多個優選實施例的流程示意圖。其中，植物甾醇并不限于圖中所列出的谷留醇，豆留醇，菜油留醇，菜籽留醇，還可以是其他植物留醇的混合物，而最終產物的種類則僅與菌株有關，與具體的留醇種類無關。
[0064]實施例1:
[0065]1.種子準備與菌體培養:將甘油凍存的分枝桿菌Mycobacterium neoaurumNwIB- V接種到一級種子培養基MYC/01中，待生長達到對數中期時(3d)，以5%接種量接種到二級種子培養基中培養至對數中期(2d)，再以10%接種量接種到生長培養基MYC/03，培養3d時收集菌體。
[0066]2.菌體收集處理過程:3d時收集菌體,6000rpm, IOmin離心，以去離子水(pH8)洗兩遍，離心稱重菌體得濕菌體重量為35g。[0067]3.靜息細胞轉化過程:1L搖瓶中設定額定轉化裝液量IOOmL,準確量取植物甾醇母液50mL，稱量羥丙基-β-環糊精400g (與植物甾醇摩爾比為1:1)，稱量濕菌重10_15g，三者立刻充分混勻，定容至IOOmL,調節初始pH為8，培養4_5d。
[0068]4.轉化結束后，將轉化液1000Orpm離心分離上清和菌體，將菌體以pH為8的去離子水洗一遍，離心分離上清和水。將兩次上清合并，以4倍體積的乙酸乙酯連續萃取3次，將3次所得乙酸乙酯合并，TLC、HPLC檢測。
[0069]5.菌體重復步驟3，做菌體重復使用次數實驗；步驟4中獲得的乙酸乙酯萃余相，充分揮發掉殘留乙酸乙酯后，重復步驟3代替稱量的羥丙基環糊精，做環糊精重復使用實驗。
[0070]6.第一次靜息細胞轉化實驗，經HPLC測得植物留醇的轉化率接近100%，9_0H_AD產量50g/L，摩爾得率可以達到72%。
[0071]7.經步驟5反復實驗8次，菌體及環糊精可以重復使用8次，第8次，9_0H_AD產量可以有45g/L。
[0072]實施例2:菌株及培養方法同實施例1，所不同為在5L發酵罐上做靜息細胞轉化實驗。實驗證明，在5L發酵罐上進行的轉化實驗基本獲得與搖瓶相似的實驗效果。
[0073]實施例3,4:同實施例1, 2,區別在于菌株為分枝桿菌Mycobacterium neoaurumNwIB-02 ο無論是1000mL搖瓶還是5L發酵罐，經HPLC測得植物留醇的轉化率接近100%，AD產量37g/L。菌體及環糊精可以重復使用8次。
[0074]實施例5,6:同實施例1, 2,區別在于菌株為分枝桿菌Mycobacterium neoaurumNwIB-04 ο無論是1000mL搖瓶還是5L發酵罐，經HPLC測得植物留醇的轉化率接近100%，ADD產量38g/L。菌體及環糊`精可以重復使用8次。
[0075]實施例7，8:同實施例1，2，區別僅在于助溶劑為甲基-β-環糊精。無論是1000mL搖瓶還是5L發酵罐，經HPLC測得植物留醇的轉化率接近100%，9-0H-AD產量55g/L。菌體及環糊精可以重復使用8次。
[0076]根據上述實施例，本發明所提供的方法不僅適用于小規模的實驗室需求，而且適用于大規模的工業化生產。
[0077]以上所述的，僅為本發明的較佳實施例，并非用以限定本發明的范圍，本發明的上述實施例還可以做出各種變化。即凡是依據本發明申請的權利要求書及說明書內容所作的簡單、等效變化與修飾，皆落入本發明專利的權利要求保護范圍。本發明未詳盡描述的均為常規技術內容。
【權利要求】
1.一種生物轉化植物留醇制備留體藥物中間體的方法，其特征在于，包括以下步驟: . 1)提供植物留醇的懸濁液； . 2)提供一種將植物留醇轉化為留體藥物中間體的微生物菌種的靜息細胞； . 3)將所述植物留醇的懸濁液以及所述靜息細胞混合，并加入β-環糊精或化學修飾后的β -環糊精充分混勻，培養完成轉化； . 4)將步驟3)所得轉化液離心，分離上清和菌體，經溶劑提取從上清中分離得到所述甾體藥物中間體。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟4)中分離獲得的菌體和/或上清經溶劑提取后獲得的水相中的β_環糊精或化學修飾后的β_環糊精直接重復使用。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物菌種是缺失了1，2_脫氫酶的分枝桿菌，或強化了 1，2-脫氫酶的分枝桿菌，或先缺失了 1，2_脫氫酶，后強化了 9-羥基化酶的分枝桿菌。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述化學修飾后的環糊精選自:甲基-β -環糊精、羥基-β -環糊精、磺酰基-β -環糊精或羥丙基-β -環糊精。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物留醇選自:谷留醇，豆留醇，菜油甾醇，菜籽留醇中的至少一種或者任意混合物。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述甾體藥物中間體包括:雄-4-烯-3，17- 二酮，雄-1，4- 二烯-3，17- 二酮或 9-羥基-雄-4-烯-3，17- 二酮。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述靜息細胞通過采用兩級種子培養法培養所述微生物菌種獲得。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述微生物菌種經過兩級種子培養法培養之后，還包括轉入生長培養基中繼續培養。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述生長培養基的配方如下:葡萄糖 20g/L,檸檬酸 2g/L，(NH4) 2ΗΡ043.5g/L，檸檬酸鐵銨 0.05g/L, K2HPO4.3Η200.5g/L，MgSO4.7H200.5g/L，可溶性淀粉 2g/L，玉米漿 lg/L。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中β-環糊精與植物留醇的摩爾比為2:1到1:2之間。
【文檔編號】C12P33/02GK103740799SQ201410027059
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月21日 優先權日:2014年1月21日
【發明者】王學東, 高興強, 馮建勛, 徐辛未, 何偉, 魏東芝 申請人:華東理工大學