專利名稱：仙人掌多糖硫酸酯及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物活性仙人掌多糖硫酸酯及用途。該仙人掌多糖硫酸酯不僅具有較高的取代度，而且具有較強的抗人艾滋病病毒和單純皰疹病毒的活性，毒性低，在制備預防或治療人艾滋病病毒和單純皰疹病毒感染的制劑方面有很好的應用前景。
背景技術：
艾滋病即獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)，是由人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的致死性傳染病。自1981年首例病例發現以來，AIDS在全球范圍迅速漫延，嚴重威脅人類的生命。截至2004年底，全球約有4000多萬人感染了艾滋病毒，僅2004年一年就新增HIV感染者約500萬，艾滋病患者死亡約300萬。我國自1985年首次報告艾滋病病例以來，艾滋病的流行呈快速上升趨勢。2004年衛生部會同有關國際組織進行了全國范圍的艾滋病流行病學調查，初步分析結果表明，中國現有艾滋病病毒感染者和病人65萬人，其中艾滋病病人約7.5萬例。
不少學者注意到硫酸酯化多糖對多種囊膜病毒包括艾滋病病毒(HIV)和單純皰疹病毒(HSV)等有廣譜抗病毒作用。已有文獻報道了不少有關動物、植物和微生物以及化學合成的硫酸酯化多糖物質具有抗艾滋病病毒和單純皰疹病毒的作用。
硫酸酯化反應是多糖中引入硫酸酯基的常用方法。然而，由于多糖結構的復雜性，某一確定多糖的硫酸酯化修飾物的抗HIV活性高低不同。迄今還未有從植物仙人掌多糖經磺化劑酯化而得的仙人掌多糖硫酸酯及其具有較強的抗艾滋病病毒和單純皰疹病毒感染作用的報道，仙人掌多糖硫酸酯的應用也尚未見報道。
發明內容
本發明的目的是以仙人掌多糖為原料，研制一種抗HIV特異活性較高的化合物——仙人掌多糖硫酸酯。其制備方法為將仙人掌(Opuntia dillenii Haw.)多糖加入磺化劑中，控溫攪拌反應，反應結束后取出燒瓶冷至室溫，用NaOH溶液中和，醇沉洗滌數次，然后于蒸餾水中透析，透析內液減壓蒸餾濃縮，接著用無水乙醇沉淀，沉淀真空干燥即得本發明的仙人掌多糖硫酸酯。所述的磺化劑由氯磺酸與甲酰胺或吡啶組成，前者與后者的體積比為1∶2-8。其特征是它的單糖組成為葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖組成，糖苷鍵連接方式有1→6(或非還原末端)、1→4及1→3糖苷鍵。硫酸酯化度在0.5-2.5之間。
本發明對所得仙人掌多糖硫酸酯抗人艾滋病病毒作用進行了實驗檢測。藥效學試驗證明該多糖硫酸酯具有較高的抗人艾滋病病毒和單純皰疹病毒感染的作用，對人體細胞毒性低，抗病毒的活性穩定，可制備成預防或治療人艾滋病病毒和單純皰疹病毒感染的制劑。
具體實施例方式
通過以下實施例可進一步說明本發明的實質內容，但本發明的內容并不局限于此。
實施例一本發明化合物的一種制備方法取磺化劑80mL置于250mL三口瓶中，控制溫度75℃，加入仙人掌(Opuntia dillenii Haw.)多糖8克，攪拌反應3h，反應結束后取出燒瓶冷至室溫，用6M NaOH溶液中和，乙醇沉淀，離心，沉淀用蒸餾水溶解后于蒸餾水中透析，透析內液減壓蒸餾濃縮，乙醇沉淀，離心，干燥即得本發明的仙人掌多糖硫酸酯。經HPLC分析表明，仙人掌多糖硫酸酯由葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖組成。硫酸酯化度在1.7。根據多糖高碘酸消耗的規律，推知由1→6(或非還原末端)、1→4(2)及1→3糖苷鍵連接。通過Smith降解分析表明仙人掌多糖硫酸酯中沒有1→2糖苷鍵。紅外光譜分析表明在905cm-1和847cm-1左右有吸收峰，分別為α-D-葡萄吡喃糖和β-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰。修飾產物紅外吸收光譜中除有母體多糖的特征吸收外，還有較強的S＝O伸縮振動的特征吸收(～1240cm-1)和C-O-S伸縮振動的特征吸收(820cm-1)。
實施例二 本發明仙人掌多糖硫酸酯的藥理作用1、仙人掌多糖硫酸酯體外抗HIV-1IIIB(X4病毒)的活性在96孔培養板上，將仙人掌多糖硫酸酯待測樣品的貯存液作5倍稀釋，共8個梯度，每個梯度設4孔，每孔100μl，同時設置AZT陽性對照組和空白對照組。接著每孔加入C8166細胞(為T淋巴細胞系，由英國Medical Research Council(MRC)，AIDS Reagent Project惠贈)50μl(2×104/孔)，HIV-1IIIB(H9/HIV-1IIIB，由英國MRC惠贈)病毒20μl(MOI值為0.2)，補加完全培養基使每孔終體積為200μl。37℃，5％CO2培養。第三天補加新鮮完全培養基(RPMI-1640)100μl，第七天在倒置顯微鏡下觀察每孔中病毒誘導的細胞致病變效應(Cytopathic effect，CPE)，計數每孔內形成的合胞體數；按Reed &Muench方法計算仙人掌多糖硫酸酯的EC50(50％ effective concentration，即抑制合胞體形成達50％時的樣品的濃度)，見表1。
2、仙人掌多糖硫酸酯體外對C8166細胞的毒性在96孔平底培養板上，將待測樣品用培養基進行5倍稀釋，共8個稀釋度，每孔100μl，設2個重復孔，取4×105/ml C8166細胞懸液100μl與不同濃度的樣品溶液混合，同時設置正常細胞對照，置37℃，5％CO2培養箱中培養三天或五天。然后將96孔細胞培養板低速離心后，小心吸去150μl上清，每孔加5mg/ml MTT溶液20μl，37℃，5％CO2細胞培養箱中孵育4小時，每孔加100μl 20％ SDS-50％ DMF，37℃孵育過夜，用ELISA儀(測定波長595nm；參考波長655nm)檢測。測定其細胞毒性IC50(50％ inhibition concentration)，結果見表1。
表I合胞體形成法測樣品的對HIV-1IIIB的抑制作用和MTT法測對C8166細胞的毒性作用
由表1可見，本發明的仙人掌多糖硫酸酯對HIV-1IIIB的抑制作用強，對C8166細胞毒性作用很低，因而是安全高效的抗人艾滋病毒感染的化合物。
3、仙人掌多糖硫酸酯體外對HIV-1Ada-M病毒的抑制作用以SCH-C作為陽性對照，在PBMC細胞上用HIV-1p24的定量ELISA法測定了仙人掌多糖硫酸酯的抗HIV-1Ada-M的活性。在酶標儀上讀取各孔的OD值。根據試劑盒說明書所述步驟，測試結果見表2。
表2陽性對照和仙人掌多糖硫酸酯對HIV-1Ada-M的抑制作用和對細胞的毒性作用
由表2可知仙人掌多糖硫酸酯的EC50為0.46μg/ml，CC50為232μg/ml，治療指數(TI)為504，表明仙人掌多糖硫酸酯對HIV-1Ada-M也有較強的抑制作用。
3、仙人掌多糖硫酸酯體外對單純皰疹病毒的抑制作用以阿昔洛韋(acyclovir，ACV)為陽性對照，在Vero細胞上通過空斑形成實驗測定樣品對單純皰疹病毒(II型)的抑制作用，結果(表3)顯示仙人掌多糖硫酸酯對HSV-II的EC50值為84.5μg/ml，治療指數(TI)為28。提示對II型單純皰疹病毒有一定的抑制作用。
表3仙人掌多糖硫酸酯對II型單純皰疹病毒的抑制作用
權利要求
1.仙人掌多糖硫酸酯，其特征是取植物仙人掌(Opuntia dillenii Haw.)的水提取物，經磺化劑處理而得，由葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖組成，通過1→6(或非還原末端)、1→4及1→3糖苷鍵連接。硫酸酯化度在0.5-2.5之間。
2.權利要求1所述仙人掌多糖硫酸酯的制備方法，其特征是取植物仙人掌(Opuntia dillenii Haw.)多糖，經磺化劑處理，10％NaOH溶液中和，無水乙醇沉淀，蒸餾水溶解。然后用蒸餾水透析、減壓蒸餾濃縮、無水乙醇沉淀、真空干燥等公知方法處理即得本發明的仙人掌多糖硫酸酯。
3.權利要求1所述仙人掌多糖硫酸酯在治療或預防人艾滋病病毒(HIV)和單純皰疹病毒感染的制劑中的應用。
4.權利要求1所述仙人掌多糖硫酸酯的用途，其特征是制備藥物的制劑形式可選擇口服制劑、注射制劑、外用制劑以及陰道和直腸用制劑。
全文摘要
本發明涉及一種具有生物活性的仙人掌多糖硫酸酯及用途，其特征是糖鏈中含有由葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖組成，通過1→6(或非還原末端)、1→4及1→3糖苷鍵連接。本發明提供的仙人掌多糖硫酸酯是以植物仙人掌(Opuntia dillenii Haw.)多糖，經磺化劑處理而得，硫酸酯化度0.5－2.5，所述的磺化劑由氯磺酸與吡啶組成，前者與后者的體積比為1∶2－8。本發明所得的仙人掌多糖硫酸酯不僅具有較高的取代度，而且具有較強的抗人艾滋病毒和單純皰疹病毒活性，對人體細胞的毒性低，可用于制備預防或治療人艾滋病病毒和單純皰疹病毒感染的制劑。
文檔編號A61P31/12GK101045753SQ200610048670
公開日2007年10月3日 申請日期2006年9月11日 優先權日2006年9月11日
發明者陳朝銀, 趙聲蘭, 賁昆龍, 曹筱梅 申請人:昆明理工大學