一種氯喹與長春新堿的藥物組合的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及藥物技術領域，尤其是涉及一種氯喹與長春新堿的藥物組合。
【背景技術】
[0002] 目前兒童腫瘤比較多發，通常采用手術或化療治療，比如兒童視網膜母細胞瘤的 治療方式主要是手術摘除眼球和局部化療，其中摘除眼球的方法雖然可根治腫瘤，但由于 付出代價高昂，已逐漸被淘汰，化療成為主要的方法，細胞毒性的藥物是目前各類兒童實體 腫瘤的主流化療方法；化療方案局限于傳統細胞毒性藥物長春新堿、卡鉑、環磷酰胺，長春 新堿（vincristine，VCR)最為常用，微管抑制劑長春新堿具有廣譜抗腫瘤作用，但毒副作 用較高；溶酶體抑制劑氯喹（chloroquine，CQ)是一種弱堿，作用于溶酶體，可抑制溶酶體 酸性環境對細胞內各類蛋白和細胞器的降解，在臨床上用于治療瘧疾，由于發現氯喹可以 抑制自噬，一種細胞自我降解的生理機制和代謝途徑，而自噬對腫瘤細胞存活通常具有促 進作用，故氯喹被用于各類惡性腫瘤的實驗性治療和臨床實驗，包括乳腺癌，黑色素瘤，肝 癌，胰腺癌等多種成人高度惡性腫瘤。
【發明內容】
[0003] 本發明是為了降低化療用藥量和毒性，增加化療效果，提供一種用量少，毒性低， 效果顯著的氯喹與長春新堿的藥物組合。
[0004] 為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：一種氯喹與長春新堿的藥物組合， 包括氯喹、長春新堿，二者化學式分別為：
[0005] 本方案通過細胞系體外培養和細胞活力實驗，發現溶酶體抑制劑氯喹（CQ)與化 療藥物微管抑制劑長春新堿（VCR)可協同殺傷、抑制多種兒童實體腫瘤，包括視網膜母細 胞瘤和腎母細胞瘤；其中，微管抑制劑長春新堿造成腫瘤細胞有絲分裂障礙，而溶酶體抑制 劑氯喹造成腫瘤細胞細胞代謝障礙，二者合力致腫瘤細胞凋亡。
[0006] 作為優選，所述的藥物組合中，氯喹含量為2-40yM，長春新堿含量為10nM。氯喹 與長春新堿單用可以抑制HX0-Rb44細胞，兩種藥物效果強于單用，并可以促進細胞凋亡； 低劑量的藥物對細胞自噬無抑制作用，但仍可以抑制腫瘤細胞生長和促凋亡。
[0007] 作為優選，所述的藥物組合中，氯喹含量為5-50yM，長春新堿含量為20nM。單獨 使用氯喹可抑制腎母細胞瘤細胞G401增殖并誘導凋亡，而5yM以上的氯喹聯用長春新堿 可顯著提高抑制腎母細胞瘤細胞G401增殖并誘導凋亡的效果。
[0008] 因此，本發明具有如下有益效果：（1)與常規用藥量相比，本方案用量少，毒性低； (2)殺傷、抑制視網膜母細胞瘤和腎母細胞瘤的效果顯著。
【附圖說明】
[0009] 圖1是本發明針對視網膜母細胞瘤效果示意圖一。
[0010] 圖2是本發明針對視網膜母細胞瘤效果示意圖二。
[0011] 圖3是本發明針對腎母細胞瘤效果示意圖。
[0012] 圖4是本發明針對視網膜母細胞瘤機制圖片，包括HRP化學發光法顯影自噬相關 蛋白條帶圖片。
[0013] 圖5是本發明不同含量組合針對視網膜母細胞瘤的HRP化學發光法顯影蛋白條帶 示意圖。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合附圖對本發明做進一步的描述。
[0015] 實施例1，一種氯喹與長春新堿的藥物組合，包括氯喹、長春新堿，其中氯喹含量為 2-40yM，長春新堿含量為10nM。
[0016] 具體實施過程是，
[0017] 視網膜母細胞瘤HX0-Rb44細胞培養于1640培養基（含10 %胎牛血清），生長狀 態良好時接種于96孔板，加入藥物培養24小時，通過CCK-8法檢測細胞相對數目，計算細 藥物對細胞的抑制率；
[0018] 細胞系和培養方法：視網膜母細胞瘤細胞系HX0-Rb44,此細胞為懸浮細胞，用含 10%胎牛血清的1640培養基培養于37°C孵箱，含5%二氧化碳和飽和水蒸氣；
[0019]主要試劑：氯喹（CQ)，長春新堿（VCR) ;40%丙烯酰胺凝膠貯存液，Tris堿，TEMED， SDS，蛋白酶抑制劑，蛋白上樣標準品，CCK8試劑盒，BCA試劑盒和HRP化學放光檢測試劑 盒；
[0020] 抗體：一抗包括LC3,GAPDH，p62,caspase3;抗鼠與抗兔HRP偶聯二抗；
[0021] 細胞活力實驗：將視網膜母細胞瘤細胞HX0_Rb44以IX10A4個/孔的密度接 種于96孔板，加入藥物后繼續培養24小時，然后加入CCK8試劑，用酶標儀讀取405nm吸光 度，根據讀數做出細胞抑制曲線；
[0022] 統計分析：每種藥物劑量重復5次，每次4個復孔，結果以平均值土標準誤表示， 在2-40yM區間，氯喹可以協同長春新堿（IOnM)對腫瘤細胞的抑制效果，藥物聯用對腫瘤 細胞抑制率顯著提高，如圖1、圖2所示，同時，通過等輻射分析，證明兩個藥物對腫瘤細胞 的抑制確為協同作用；
[0023] 免疫雜交（Westernblotting)實驗：細胞用藥物處理后離心、PBS洗滌后，用預冷 的RIPA緩沖液（加入蛋白酶和磷酸化酶抑制劑）消化，BCA法進行蛋白定量后，用SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，每孔上樣20yg的蛋白，用適當的抗體進行免疫雜交后，HRP化學發光 法顯影蛋白條帶，如圖4所不，兩種藥物聯用（CQ5yM，VCR10_20nM)可顯著提尚調亡標記 蛋白caspase3片段的水平，而對自噬相關蛋白LC3與p62的水平影響不大。
[0024] 實施例2, 一種氯喹與長春新堿的藥物組合，包括氯喹、長春新堿，其中氯喹含量為 5-50yM，長春新堿含量為20nM;
[0025] 具體實施過程是，
[0026] 腎母細胞瘤6401細胞培養于此&^54培養基（含10%胎牛血清），生長狀態良好 時，接種于96孔板。加入長春新堿、氯喹共同培養24小時，然后通過CCK-8法檢測細胞相 對數目，計算藥物對細胞的抑制率；
[0027] 細胞系和培養方法：腎母細胞瘤G401，此細胞為貼壁細胞，用含10%胎牛血清的 McCoy5A培養基培養于37°C孵箱，含5%二氧化碳和飽和水蒸氣；
[0028] 主要試劑：氯喹（CQ)，長春新堿（VCR) ;40%丙烯酰胺凝膠貯存液，Tris堿，TEMED， SDS，蛋白酶抑制劑，蛋白上樣標準品，CCK8試劑盒，BCA試劑盒和HRP化學放光檢測試劑 盒；
[0029] 抗體：一抗包括LC3,GAPDH，p62,caspase3 ;抗鼠與抗兔HRP偶聯二抗；
[0030] 細胞活力實驗：將腎母細胞瘤G401細胞以IX10八4個/孔的密度接種于96孔 板，加入藥物后繼續培養24小時，然后加入CCK8試劑，用酶標儀讀取405nm吸光度。根據 讀數計算細胞相對數目，做出藥物對細胞的抑制曲線；
[0031] 統計分析：每種藥物劑量重復5次，每次4個復孔，結果以平均值土標準誤表示， 5-50yM氯喹可以抑制腎母細胞瘤G401，但效果很快達到飽和，20nM長春新堿可抑制G401 細胞，加入5-50yM氯喹后，抑瘤作用產生協同和疊加，聯用的抑瘤率顯著高于單用，如圖3 所示，其中X軸為氯喹作用濃度（yM)，Y軸為抑瘤率（％)，曲線一為氯喹單獨作用效果，曲 線二為氯喹添加長春新堿組合作用效果；
[0032] 免疫雜交（Westernblotting)實驗：細胞用藥物處理后離心、PBS洗滌后，用預冷 的RIPA緩沖液（加入蛋白酶和磷酸化酶抑制劑）消化，BCA法進行蛋白定量后，用SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，每孔上樣20yg的蛋白，用適當的抗體進行免疫雜交后，HRP化學發光 法顯影蛋白條帶，如圖5所示；有效抑制G401細胞的藥物單用與聯用條件下（VCR20nM，CQ 5yM)，凋亡相關蛋白caspase3片段均明顯升高，20nMVCR誘導細胞凋亡能力強于5yM CQ;而兩種藥物聯用后，caspase3片段水平比藥物單用組進一步顯著上升，提示細胞凋亡 水平增加；同時，20nMVCR與5yMCQ對細胞自噬也產生一定影響，自噬受到抑制，體現為 自噬底物LC3-II和p62水平增加，藥物組合使用組更加明顯；與HX0-Rb44細胞中觀察到的 現象相比，兩種藥物對兩種腫瘤細胞均有誘導凋亡的作用，而對自噬調節的作用不同，藥物 作用后腎母細胞瘤G401細胞中自噬水平發生改變，而視網膜母細胞瘤HX0-Rb44細胞自噬 水平未發生改變。
【主權項】
1. 一種氯喹與長春新堿的藥物組合，其特征在于，包括氯喹、長春新堿，氯喹化學式為，長春新堿化學式為，2. 根據權利要求1所述的一種氯喹與長春新堿的藥物組合，其特征是，所述的藥物組 合中，氯喹含量為2-40yM，長春新堿含量為10-100nM。3. 根據權利要求1所述的一種氯喹與長春新堿的藥物組合，其特征是，所述的藥物組 合中，氯喹含量為5-50yM，長春新堿含量為10nM。
【專利摘要】本發明公開了一種氯喹與長春新堿的藥物組合，包括氯喹、長春新堿，其中氯喹含量為2-40μM，長春新堿含量為10nM，或者氯喹含量為5-50μM，長春新堿含量為20nM；兩種劑量的氯喹與長春新堿可協同殺傷、抑制包括視網膜母細胞瘤和腎母細胞瘤在內的多種兒童實體腫瘤，可作為化療藥物使用。本發明與常規用藥量相比，用量少，毒性低；殺傷、抑制視網膜母細胞瘤和腎母細胞瘤的效果顯著。
【IPC分類】A61P35/00, A61K31/475, A61K31/4706
【公開號】CN104906099
【申請號】CN201510378133
【發明人】陳希
【申請人】杭州泛普生物科技有限公司
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2015年6月29日