專利名稱：一種重組人干擾素α2b-CTP融合蛋白的純化方法
技術領域：
本發明屬于蛋白質純化領域。本發明適用于重組人干擾素a 2b_CTP融合蛋白的少量制備及大規模生產純化。
背景技術：
重組人干擾素a 2b被廣泛應用于臨床疾病的治療中。作為一種廣譜的細胞因子類抗病毒藥物，它對如乙型肝炎、尖銳濕疣等有很好的療效，同時重組人干擾素a 2b還具有抗增殖的作用，它對多種腫瘤也有較好治療效果。但重組人干擾素a 2b的副作用較多，半衰期短，給病人增加了疾病之外的痛苦的同時，也影響了其療效的發揮。重組人干擾素a 2b-CTP融合蛋白是為使干擾素在體內獲得較長半衰期而開發的新型干擾素。CTP為人絨毛膜促性腺激素β亞基羧基末端肽，該肽鏈可以增加重組人干擾素a2b_CTP融合蛋白唾液酸含量并提高蛋白質糖基化程度，增加分子量，因此可以獲得更長的藥物體內半衰期。延長半衰期減少注射頻率，可以很大程度上減少病人的額外痛苦，進而更好的發揮了治療能力。重組人干擾素a 2b_CTP融合蛋白采用真核表達體系，因為其主要部分為干擾素，所以主要表現為干擾素的理化性質，同時又因為真核表達體系的翻譯修飾功能而具有了糖基化修飾。200710099325.X公開了一種由人血清白蛋白和干擾素組成的融合蛋白，該融合蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質:(a)由序列表中序列I的氣基酸殘基序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列I的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有干擾素a 2b活性的由(a)衍生的蛋白質。與已公開的同類融合蛋白(如美國HGS公司的Albuferon)不同，該融合蛋白中干擾素部分處于融合蛋白的N末端而人血清白蛋白部分處于融合蛋白的C末端。由于以上改進使得該融合蛋白比Albuferon具有更好的均一性，更高的穩定性和更高的回收率。該融合蛋白也具有長效性，可用于治療多種腫瘤及病毒性疾病， 但這種蛋白分子量較大，不利于到達靶位發揮作用。200480039723.7公開了純化β -干擾素的方法，該方法包括進行親和層析和陽離子交換層析，其中親和層析包括:將含有干擾素的培養物吸附到平衡的親和層析柱上，接著用平衡緩沖液洗滌；用洗滌緩沖液A和洗滌緩沖液B洗滌柱子，所述洗滌緩沖液A的pH為6.5-7.5，包含30-60重量％的丙二醇，所述洗滌緩沖液B的pH為6.5-7.5，包含10-30重量％的丙二醇和1-2M NaCl ;用pH為6.5-7.5的包含40-60重量％的丙二醇和1-2M NaCl的緩沖液洗脫包含人β_干擾素的級分。這種用于純化干擾素的方法步驟較多，比較繁瑣，不利于大規模工業生產的經濟要求。2002108974.4公開了一種酵母表達重組人干擾素a 2b的純化方法，該重組人干擾素a 2b采用酵母分泌表達系統取代大腸桿菌包涵體表達系統，目標蛋白重組人干擾素a 2b不需要復性，其生物比活性可達到1.0 X IO9單位/毫克蛋白，低毒副作用；在純化過程中，不需要價值昂貴的單抗柱，即可從發酵液中提取獲得純度達95%以上的目標蛋白重組人干擾素a 2b，降低了生產成本。我們采用的哺乳動物細胞培養表達干擾素從理論上要優于酵母表達，而哺乳動物細胞有大量的水解酶，在酸性條件下，這些酶極容易被激活，進而破壞目的蛋白，所以要在第一步層析時將這些酶盡可能除去，而專利2002108974.4所采用的層析方法做不到這一點。綜上，本發明在經濟與技術角度上都顯著優于已有專利，尤其對真核細胞培養的不同糖基化程度的蛋白有很好的分離效果。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種適合于大規模純化真核細胞表達的重組人干擾素a 2b-CTP融合蛋白的純化方法，同時這種方法用于分離不同糖基化程度的重組人干擾素ci2b-CTP融合蛋白。可通過以下步驟實現:
含有重組人干擾素a 2b-CTP融合蛋白的豐收液，離心去沉淀后，對上清進行超濾濃縮，濃縮后的上清經
(a)藍膠染料親和層析；
(b)陽離子層析；
(C)陰離子層析。本發明的方法步驟(a)藍膠染料親和層析可允許豐收液上清不需稀釋直接上樣，這一優點因可有效減少上樣液總體積進而擁有更低成本。本發明的一個目的是去除蛋白水解酶。步驟(b)陽離子層析，是主要的去除雜蛋白的步驟，其主要的層析操作PH在酸性范圍內，但由于哺乳動物細胞有死亡后會釋放大量的水解酶，而這些酶在酸性條件下會被激活，進而破壞目的蛋白，所以為防止這一情況的發生，先采用步驟(a)藍膠染料親和層析，首先將一些水解酶先行去除。
藍膠染料親和層析常被用來純化干擾素,其所使用的介質舉例有Blue Sepharose6 Fast Flow、Blue Sepharose CL_6B、HiTrap Blue HP等幾種類型的填料。干擾素可以結合到Cibacron Blue F3G-A,這是一種合成的多環染料,其作用類似于芳香族的陰離子配基，通過靜電力和/或疏水相互作用結合干擾素。利用藍膠染料親和層析，這一過程很容易放大生產。豐收液經澄清處理后，經截留分子量為I萬的超濾膜包超濾濃縮，不需稀釋直接經藍膠染料親和層析。藍膠染料親和層析說明書推薦上樣液中有約0.15 M NaCl，這有助于排除部分非特異性吸附蛋白，而豐收液的電導相當于0.12 M NaCl,所以不需要額外加鹽。藍膠染料親和層析純化白蛋白推薦的pH為7.0。重組人干擾素a2b-CTP融合蛋白要求在pH5.5-8.5，優選 ρΗ7.0-8.0。步驟(a)藍膠染料親和層析的凈化可通過用3-4倍體積的70%的乙醇或者30%異丙醇沖洗柱子，去除結合很強的疏水性蛋白、脂蛋白和脂質等物質。另外也可以選擇兩倍柱體積的堿性或者酸性去污劑溶液，例如0.1%的非離子去污劑在IM乙酸溶液中，以較低的流速流過柱子，接下來用5倍柱體積的70%的乙醇出去殘留的去污劑。立即用結合緩沖液再次平衡柱子。步驟(a)藍膠染料親和層析不同pH層析效果不同，隨pH升高染料配基與重組人干擾素a2b_CTP融合蛋白結合力減弱，但洗脫回收率提高，步驟(a)洗脫鹽濃度為0.5-211他(:1，優選1.0-1.5 M NaCl。由于洗脫液中含有較高濃度的鹽，會影響蛋白的穩定性，并且含高濃度鹽的蛋白溶液不能直接進行步驟(b)陽離子層析，所以經步驟(a)藍膠染料親和層析后的洗脫液要經過脫鹽處理。經步驟(a)藍膠染料親和層析的脫鹽處理的方法是采用超濾置換法，其中超濾膜包的截留分子量為I萬，超濾過程中控制進口端壓力小于1.5bar。超濾的置換溶液為50mMpH7.1的PB緩沖液。等體積置換5_8次。步驟(b)陽離子層析，包括使用強陽離子、弱陽離子型介質和復合型陽離子層析介質。強陽離子如SP及性質相似的任何一種介質，弱陽離子如CM及性質相似的任何一種介質，復合型陽離子如MMC及性質相似的任何一種介質。步驟(a)藍膠染料親和層析洗脫液超濾脫鹽后，用醋酸調pH3.5-5.0，此時會出現大量沉淀，離心除去沉淀，上清經步驟(b)陽離子層析進一步純化。許多資料表明大腸桿菌的蛋白在PH3.5-5.0間會發生沉淀現象，本發明展現這一現象也同樣存在于真核的哺乳動物細胞蛋白中，強陽離子層析作為一個重要的去除雜蛋白的步驟，很大程度上也是利用了這一酸沉淀現象。酸沉淀過程要求pH變化要緩慢，因為酸沉時有可能使目的蛋白共沉。酸沉淀后蛋白溶液要快速離心去除沉淀后經步驟(b)陽離子層析進一步純化。本發明的另一目的是進一步降低終產品的細胞色素含量。以便進一步提高終產品的蛋白純度，這一目的可由前述方法的弱陽離子交換介質來實現。步驟(b)陽離子層析，陽離子層析可以使用強陽離子、弱陽離子型介質和復合型陽離子層析介質。所有類型都要求在PH3.5-5.0之間進行層析過程，因為重組人干擾素a 2b-CTP融合蛋白 的等電點在這一區間內，如果超出等電點范圍，如大于pH5.0,則載量會很快下降，不利于大規模操作。對比層析過程，強陽離子層析的效果要好于弱陽離子層析，因為強陽離子交換劑填料的帶電性質不隨PH的改變而變化，而且由于電荷相互作用沒有任何中間形式，因而相互作用機制簡單，在高或低PH條件下，樣品結合能力仍然保持。步驟(b)陽離子層析，層析pH要求在3.5-5.0，優選pH4.2-4.7。因為雖然重組人干擾素a 2b-CTP融合蛋白的等電點在pH3.5-5.0之間，但在這一 pH范圍內陽離子層析介質仍有較高的載量，可以滿足大規模生產的要求，而且在這一 PH范圍內，可以在通過酸沉淀的方法去除大量的雜蛋白后，直接進行陽離子層析。上述步驟(b)陽離子層析，層析pH優選4.2-4.7。因為在這段通過酸沉淀的方法所沉淀的雜蛋白最多，最有利于蛋白純化，而且在PH4.2-4.7，蛋白比較穩定。步驟(b)陽離子層析，先通過梯度洗脫確定目的蛋白的洗脫鹽濃度范圍，這一實驗利用了 GE公司的AKTApurifier系統，設定的鹽濃度范圍為0-0.5 MNaCl，結果當洗脫鹽濃度升到0.1MNaCl時，目的蛋白開始被洗脫，當鹽濃度升到0.2MNaCl時，目的蛋白洗脫完畢。在梯度洗脫的結果之上進行階段洗脫實驗，最終確定最佳層析預洗鹽濃度為0.06 M NaCl,最佳層析洗脫鹽濃度為0.12-0.16 M NaCl
步驟(b)陽離子層析的凈化可通過IMNaOH處理1_2小時，用純水沖洗去NaOH，再用IMnaCl沖洗，使分離柱處于良好狀態，再用純水沖洗分離柱直至電導為O ms/cm。
步驟(b)陽離子層析洗脫液在用Tris調pH大于6.0后可以較長時間存放于4°C或-30。。。步驟(b)陽離子層析洗脫液在進行步驟(C)陰離子層析之前要將其置換為陰離子層析所使用的平衡液。這是因為如果步驟(C)直接上樣則在平衡時，層析柱里的pH會大幅度降低，進而導致已經結合的目的蛋白解離，被沖出層析柱。置換可以采用凝膠層析介質，如G25等。步驟(C)陰離子層析的目的主要是去除重組人干擾素a2b_CTP融合蛋白的同源雜蛋白，同時去除聚體和痕量雜質，尤其是如小分子片段類雜質。使用的介質為粒徑小于40 μ m 的陰離子型介質。舉例如 Q Sepharose High Performance> SOURCE 15Q 等。步驟(C)陰離子層析中柱效對層析效果影響顯著。柱效也稱為理論塔板數，在任何情況下，完美填充的分離柱對于分辨率十分重要。如果分離柱填充的不均勻，壓得太松或太緊，或含有氣泡，則會導致分離柱中不正常通道的產生及峰變寬現象，從而降低分辨率。重組人干擾素a 2b-CTP融合蛋白的同源雜蛋白的理化性質十分相近，差別十分微小，如果沒有好的分辨率，就無法進行分離。因此裝柱效果的好壞直接決定了這一步分離同源雜蛋白的效果。進而決定最終的純化結果。步驟(C)陰離子層析的層析pH要求在5.0-8.0,優選pH5.5-6.5。當pH太低時，蛋白與填料的結合能力減弱，載量下降，同時分離效果降低，當PH較高時，雖然載量較高，但分離效果也同樣降低，所以優選PH6.0。步驟( C)陰離子層析，先通過梯度洗脫確定目的蛋白的洗脫鹽濃度范圍，這一實驗利用了 GE公司的AKTApurifier系統，層析pH選擇在5.0-8.0,設定的鹽濃度范圍為0-0.4M NaCl，結果當洗脫鹽濃度升到0.12MNaCl時，目的蛋白開始被洗脫，出現幾個連續的峰，當鹽濃度升到0.28 M NaCl時，目的蛋白洗脫完畢。在梯度洗脫的層析圖譜和電泳結果之上進行階段洗脫實驗，最終確定最佳層析鹽濃度范圍為0.14-0.28 MNaCl，最優為0.14-0.17M NaCl 預洗，0.17-0.25 M NaCl 洗脫。步驟(C)陰離子層析，強陰離子層析的效果要好于弱陰離子層析，因為強陰離子交換劑填料的帶電性質不隨PH的改變而變化，而且由于電荷相互作用沒有任何中間形式，因而相互作用機制簡單，在高或低PH條件下，樣品結合能力仍然保持。步驟(C)要求填料要有非常好的選擇性，好的選擇性(樣品峰之間的分離的程度)對于決定分辨率而言是一個比柱效更加重要的因素，它不僅取決于填料的性質，而且還與所帶功能團的數目有關。這也是Q-HP有較高分離度的原因。步驟(c)陰離子層析的凈化可通過I M NaOH處理1_2小時,用純水沖洗去NaOH，再用I M NaCl沖洗，使分離柱處于良好狀態，再用純水沖洗分離柱直至電導為Oms/cm。本發明包括使用與上訴相似的介質，即建立在一般結構基礎上的介質，不限于提及的例子，如Q-HP、SOURCE 15Q可被理解為性質相似的任意介質。
圖1藍膠染料親和層析的結果，IB組分含有重組人干擾素a 2b_CTP融合蛋白，圖中峰IB包含著重組人干擾素a 2b-CTP融合蛋白，可以與代表著雜質部分的峰IA明顯分離開。
圖2組分IB在陽離子層析的結果，具體為圖1中組分IB通過CM-FF層析柱由離子作用進行分離，圖2中2B為目標峰。圖3組分2B在陰離子層析的結果，具體為圖2中組分2B通過Q-HP層析柱由離子作用進行分離，圖3中3B為目標峰。圖4本發明經前兩步純化所得主要組分的電泳分析，即SDS-PAGE (12%)電泳分析結果。點樣量為IOyg蛋白，考馬斯亮藍染色。樣品順序為I發酵上清2藍膠染料未結合部分3藍膠染料洗脫部分4陽離子上樣液(調酸上清)5調酸沉淀6陽離子洗脫部分箭頭所指為目的蛋白。圖5本發明第三步純化所得主要組分的電泳分析，即SDS-PAGE (12%)電泳分析結果。點樣量為IOyg蛋白，考馬斯亮藍染色。樣品順序為I陰離子預洗部分2陰離子洗脫部分，箭頭所指為目的蛋白。
實施例下面結合具體實施 例，進一步闡述本發明，應理解為實施例僅用來說明本發明，并不用于限制本發明的應用范圍。材料和方法
含重組人干擾素a 2b-CTP融合蛋白的豐收液由CHO細胞培養兩周左右收獲。各種樣品的蛋白濃度用Bradford法測定。超濾系統應用MilliPore Retentate，膜包截留分子量為I萬；離心機為S0RVALLRC12BP
電泳分析應用BIO-RAD的Miniprotean Terra cell電泳系統，采用SDS-PAGE方法，所制膠為12%,點樣量為10 μ g蛋白，考馬斯亮藍染色。介質和層析系統:層析分離實驗應用AKTA Purifier系統，在室溫下約22°C下進行。步驟(a)藍膠染料親和層析采用GE公司的Blue Sepharose 6 Fast Flow,步驟(b)陽離子層析采用GE公司的CM-FF，步驟(c)陰離子層析采用GE公司的Q-HP。步驟(b)與步驟(c)之間的置換采用GE公司的G25。新購介質搖成懸液后裝入XK26/20層析柱中，柱床體積為40ml，用純化水以300ml/min的線性流速沖洗填料原有溶液，直至完全替換填料原有溶液。然后在上樣前用合適的緩沖液平衡。每步層析所需緩沖液的總量隨介質不同而變化，詳見表I。緩沖液:
緩沖液 A:50 mM Tris-Hcl, 70 mM Nacl pH=7.5
配制:500 ml 0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液與300 ml 0.1 mol/L鹽酸混勻后，加入4.095 g Nacl，再水稀釋至1000 ml。緩沖液B:50 mM Tris-Hcl，1.1Μ Nacl pH=7.5
配制:500 ml 0.1 mol/L三輕甲基氨基甲燒(Tris)溶液與300 ml 0.1 mol/L鹽酸混勻后，加入64.35g Nacl，再水稀釋至1000 ml。緩沖液C:50 mM Tris-Hcl pH=7.1
配制:500 ml 0.1 mol/L三輕甲基氨基甲燒(Tris)溶液與457 ml 0.1 mol/L鹽酸混勻后，再水稀釋至1000 ml ο
緩沖液D:25 mM HAC-NaAC, ρΗ=4.8
配制:28 ml的I M的NaAC與40 ml的I M的HAC混合，用注射用水稀釋至1.0 L。緩沖液E:25 mM HAC-NaAC, 60 mM Nacl ρΗ=4.8
配制:28 ml的I M的NaAC與40ml的IM的HAC混合，加入3.51 g Nacl，用注射用水稀釋至1.0 L0緩沖液F:28 mM HAC-NaAC, 120 mM Nacl pH=4.8
配制:28 ml的I M的NaAC與40ml的IM的HAC混合，加入7.02 g Nacl，用注射用水稀釋至1.0 L0緩沖液G:50 mM Na2HPO4 - NaH2PO4 pH=5.5
配制:200 ml 0.2 M Na2HPO4和45 ml 0.2 M NaH2PO4混合，用注射用水定容至L O L。緩沖液H:50mM Na2HPO4 - NaH2PO4，140 mM Nacl pH=5.5
配制:200 ml 0.2 M Na2HPO4 和 45 ml 0.2 M NaH2PO4 混合，加入 8.19 g Nacl，用注射用水定容至1.0 L0緩沖液1:50mM Na2HPO4 - NaH2PO4，180mM Nacl pH=5.5
配制:200 ml 0.2 M Na2HPO4 和 45 m 10.2 M NaH2PO4 混合，加入 10.53 g Nacl，用注射用水定容至1.0 L。溶液J:0.1 M NaOH溶液 K:1.0 M NaOH
表1:每一層析步驟所需平衡、預洗、洗脫、再生溶液的體積(柱體積)
權利要求
1.一種分離純化重組人干擾素a 2b-CTP融合蛋白的方法，該方法可以從含有重組人干擾素a 2b_CTP融合蛋白的豐收液中提取重組人干擾素a 2b_CTP融合蛋白，并可以進一步將不同糖基化程度的重組人干擾素a2b_CTP融合蛋白分離，具體包含以下層析方法: (a)藍膠染料親和層析； (b)陽離子層析； (c)陰離子層析。
2.根據權利要求1所述方法，其中步驟(a)的層析pH要求在5.5-8.5，優選？!17.0-8.0,洗脫鹽濃度為0.5-2M NaCl，優選1.0-1.5 M NaCl。
3.根據權利要求1所述方法，其中步驟(a)洗脫液要脫鹽后才能進行步驟(b)。
4.根據權利要求1所述方法，其中步驟(b)的層析pH要求在3.5-5.0，優選pH4.2-4.7，洗脫鹽濃度為 0.1-0.2M NaCl，優選 0.12-0.16 M NaCl。
5.根據權利要求1和4所述方法，其中步驟(b)所使用的層析介質包括強陽離子和弱陽離子型介質，強陽離子如SP及性質相似的任何一種介質，弱陽離子如CM及性質相似的任何一種介質。
6.根據權利要求1所述方法，其中步驟(b)所使用的層析介質包括復合型陽離子層析介質,如MMC及性質相似的任何一種介質。
7.根據權利要求1、5和6所述方法，其中步驟(b)的洗脫蛋白溶劑要置換為步驟(c)的平衡液后才可進行步驟(c )。
8.根據權利要求1所述方法，其中步驟(c)所使用的層析介質為粒徑小于40μπι的陰離子型介質，如Q Sepharose High Performance>SOURCE 15Q及性質相似的任何一種介質。
9.根據權利要求1所述方法，其中步驟(c)的層析pH要求在5.0-8.0，優選pH5.5-6.5，洗脫鹽濃度范圍為0.17-1.0 M NaCl，優選范圍為0.17-0.25 M NaCl0
全文摘要
本發明涉及到一種分離純化重組人干擾素α2b-CTP融合蛋白的方法，該方法包括將含CHO細胞表達重組人干擾素α2b-CTP的澄清豐收液采用以下層析方法(a)藍膠染料親和層析；(b)陽離子層析；(c)陰離子層析進行純化。藍膠染料親和層析能使豐收液無需稀釋直接上柱進行純化，并穩定重組人干擾素α2b-CTP融合蛋白，陽離子層析可以去除非干擾素類雜蛋白，陰離子層析可去除與目的蛋白同源的不同糖基化程度的干擾素類雜蛋白。
文檔編號C07K1/18GK103102417SQ201110351260
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月9日 優先權日2011年11月9日
發明者劉恒, 梁秋波, 張秀芹, 呂中華, 李會成, 王瑩, 李鄭武, 姜媛媛, 孫磊, 徐巖, 李國軍, 陳玉軍, 黃宇紅, 王麗娜, 高晶, 曹翊婕 申請人:哈藥集團技術中心