專利名稱：酵母重組株及IFNα－2b干擾素的純化方法
專利說明酵母重組株及IFNα-2b干擾素的純化方法 本發明涉及表達α-2b干擾素的工程菌株及它來生產α-2b干擾素的純化方法。目前，國內生產的α-2b干擾素，多為大腸桿菌表達產物，主要工藝缺陷是大腸桿菌的表達系統為包含體型，生產過程中需要復性，復性率低，最高為40％，因而比活性低，只有1.0×108單位/毫克蛋白，有較大的副作用；并且，分離純化中要用價值昂貴的單抗柱，純度才能達到95％以上；而目前國產的單抗柱，無論在產量和質量上，都不能夠滿足廠家需要，需要花大量經費進口，生產成本很高。為了克服上述缺陷，本發明采用酵母分泌表達系統取代大腸桿菌包涵體表達系統，目標蛋白α-2b干擾素不需要復性，其生物比活性可達到6.0×108單位/毫克蛋白，毒副作用低；在純化過程中，不需要價值昂貴的單抗柱，即可從發酵液中提取獲得純度達95％以上的目標蛋白α-2b干擾素，降低了生產成本。
α-2b干擾素酵母重組株的構建方法為將克隆修飾的α-2b干擾素基因插入pGAPZα-A之GAP啟動子/α-factor信號肽下游位點，刪除Kex2(Lys-Arg)位點之后的Ste13位點(Glu-Ala-Glu-Ala)和啟始密碼子ATG，構建成α-2b干擾素基因分泌型表達載體；利用澳大利亞Invitrogen公司的Pichia EasyComp Transformation Kit的方法作改進，將α-2b干擾素基因分泌型表達載體轉化畢赤氏酵母(Pichia pastoris)的菌株GS115，構建成分泌型表達α-2b干擾素的酵母工程菌株-IFNα-2b/pGAPZα-A/GS115；通過抗生素篩選、SDS-PAGE分析及生物比活性測定，獲得目標酵母重組株。
上述的酵母重組株目標蛋白α-2b干擾素的表達量為目標蛋白占分泌總蛋白的50-60％，比活性為1.08×109單位/毫克蛋白；目標蛋白α-2b干擾素具有與天然α-2b干擾素相同的免疫原性。本工程菌株接受外源基因是以整合于基因組形式，這與大腸桿菌、釀酒酵母的獨立染色體組外質粒表達體系有顯著差別，故本工程菌株較大腸桿菌、釀酒酵母穩定，不易發生外源基因丟失現象，一旦以工程菌作為樣品模板，通過PCR、分子雜交等技術鑒定選擇出來的陽性菌株一定是真實可靠的，且其目標表達產物α-2b直接表達分泌在培養液中，因此檢測其蛋白表達量及目標產物的生物活性非常簡易，這較大腸桿菌表達體系—表達產物需復性—優越得多；另外，酵母是一種簡單的真核生物，因此其表達后加工模式類似高等真核生物，故用它表達的基因產物不僅具有天然產物相同的生物活性，而且低毒副作用，產品加工成本低，適用性更廣。
α-2b干擾素的純化方法為利用獲得的高產物表達量、高產物活性的酵母重組株進行發酵，離心收集上清液，以醋酸調節pH，過陽離子層析柱，收集目標洗脫峰，加硫酸銨至稍混濁，離心取上清液，過疏水層析柱，收集目標洗脫峰，過陰離子層析柱，收集目標洗脫峰，過Sephacryl分子篩層析柱，收集目標峰，得到α-2b干擾素。
本發明提供的α-2b干擾素的純化方法，縮短了純化時間，不需要價格昂貴的單抗柱就可以得到純度大于95％的α-2b干擾素原液，降低了成本，在工業生產中應用將良好的經濟效益。附圖
為α-2b干擾素表達載體構建圖。
pGAPZα-A/IFNα-2b表達載體分子大小為3.6kb。
pGAPZα-A載體結構為磷酸甘油酸脫氫酶基因啟動子區域第1-483bp磷酸甘油酸脫氫酶基因啟動子引物位點第455-476bpα-交配因子分泌信號肽序列第493-759bpα-交配因子分泌信號肽引物位點第696-716bp載體多克隆位點第760-828bpmyc抗原決定簇包第827-856bp多聚組氨酸包第872-889bp3’-乙醇氧化酶1基因引物位點第974-994bp乙醇氧化酶1轉錄終止區域第893-1233bp轉錄延伸因子1啟動子區域第1234-1644bp合成原核啟動子第1645-1712bp
鏈霉菌zeocin抗性基因閱讀框第1713-2087bp細胞色素合成酶1轉錄終止區域第2088-2405bp大腸桿菌復制子1(來源于pUC載體)第2416-3089bp[具體實施方式
]下面結合實施例詳細介紹本發明在α-2b干擾素重組酵母工程菌株的構建和α-2b干擾素純化工藝中的具體應用。
(二)方法1.基因PCR擴增(1)引物設計在5’端引物中刪除Kex2(Lys-Arg)位點之后的Ste13位點(Glu-Ala-Glu-Ala)和啟始密碼子ATG。
P1-5’GCTCGAGAAAAGAATGTGTGATCTGCCTCAAACC3’(“ATG”被刪除)XhoI Lys-Arg(Kex2位點)P2-5’GTCTAGATCATTCCTTACTTCTTAAACT3’XbaI(2)熱循環95℃，5’；95℃，30”→49℃，30”→72℃，60”72℃，10’；擴增30個循環。
2.PCR擴增產物回收與克隆(1)IFNα-2b基因經擴增電泳后獲得約521bp的DNA帶；(2)用德國寶靈曼公司生產的PCR產物高純度試劑盒回收目標片段并進行T-Vector克隆。
3.基因序列分析采用美國PE公司生產的ABI 377A DNA自動測序儀進行DNA序列分析。
4.酵母分泌型表達載體構建采用基因克隆技術將α-2b干擾素基因通過XhoI/XbaI插入pGAPZα-A之GAP啟動子/α-factor信號肽下游的XhoI/Xba I位點，構建成含α-factor信號肽的分泌型酵母表達載體；表達載體轉化GS115(his4)利用澳大利亞Invitrogen公司生產的PichiaEasyComp Transformation Kit(Cat.No.K1730-01)經稍作改進的方法進行。具體操作如下(1)挑取畢赤氏酵母(Pchia pastoris)GS115單菌落，在30℃，300轉/分鐘條件下以YPD+Zeocin100毫克/升培養基振蕩培養至OD600＝1.3-1.5；取0.1-0.5毫升菌液至50毫升同樣培養基中振蕩培養至OD600＝6-8，在5000轉/分鐘、4℃條件下離心5分鐘，去上清液，用10毫升溶液I重懸，制成感受態細胞；(2)取100微升感受態，加入5-10微升線性化的α-2b干擾素重組表達載體，再加400毫升溶液II，混勻后28℃培養1小時，加1毫升YPD，30℃培養1小時；(3)將培養物在5000轉/分鐘、4℃條件下離心15分鐘，去上清，用200毫升溶液III重懸，涂布YPD+Zeocin100毫克/升平板，28-30℃培養24-36小時，產生單菌落。
5.高表達酵母工程菌株的篩選用Zeocin抗生素篩選獲得陽性菌株后，提取工程菌基因組DNA，進一步以引物P1/P2作PCR分析和以德國寶靈公司生產的DiG Labelling and Detection Kit標記α-2b干擾素基因之520bp DNA片段為探針，進行Southern blotting等技術鑒定篩選出陽性菌株，再用SDS-PAGE篩選高表達目標蛋白的IFNα-2b/pGAPZα-A/GS115工程菌株。
權利要求
1.一種酵母重組株，其特征在于將克隆修飾的α-2b干擾素基因插入pGAPZα-A之GAP啟動子/α-factor信號肽下游位點，刪除Kex2(Lys-Arg)位點之后的Ste13位點(Glu-Ala-Glu-Ala)和啟始密碼子ATG，構建成α-2b干擾素基因分泌型表達載體IFNα-2b/pGAPZα-A，轉入畢赤氏酵母(Pichia pastoris)的菌株GS115，構建成分泌型α-2b干擾素重組酵母工程菌株IFNα-2b/pGAPZα-A/GS115。
2.一種α-2b干擾素的純化方法，其特征在于直接從分泌型α-2b干擾素酵母工程菌株(IFNα-2b/pGAPZα-A/GS115)的發酵液中分離純化α-2b干擾素離心收集發酵上清液，以醋酸調節pH，過陽離子交換層析柱，收集目標洗脫峰，加硫酸銨至稍混濁，離心取上清液，過疏水層析柱，收集目標洗脫峰，過陰離子層析柱，收集目標洗脫峰，過Sephacryl分子篩層析柱，收集目標峰，得到α-2b干擾素。
全文摘要
本發明涉及分泌表達α－2b干擾素的酵母工程菌株IFNα－2b/pGAPZα－A/GS115構建的關鍵技術、構建結果及利用它來生產α－2b干擾素的純化方法。本發明采用酵母分泌表達系統取代大腸桿菌包涵體表達系統，目標蛋白α－2b干擾素不需要復性，其生物比活性可達到1.0×10
文檔編號C07K14/435GK1405298SQ0210897
公開日2003年3月26日 申請日期2002年4月16日 優先權日2002年4月16日
發明者梁國棟, 周鵬, 夏中寧 申請人:海南海梁生物高科技有限公司