對hla分子結合親和力提高的肽的制作方法

專利名稱：：對hla分子結合親和力提高的肽的制作方法
背景技術：
：本發明涉及預防、治療或診斷許多病理狀態的組合物和方法。特別提供能夠結合選擇的主要組織相容復合物(MHC)分子并誘導免疫反應的新肽。MHC分子可分成Ⅰ型或Ⅱ型。Ⅱ型MHC分子基本上表達于參與激發和維持免疫反應的細胞，如T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞等。Ⅱ型MHC分子被輔助T淋巴細胞識別，并誘導輔助T淋巴細胞的增殖，和對呈現的特定免疫原性肽的免疫反應的放大。Ⅰ型MHC分子表達于幾乎所有的有核細胞上，并被細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)識別，這種T淋巴細胞然后破壞帶有抗原的細胞。CTLs在腫瘤排斥和抵抗病毒、真菌和寄生蟲的感染中是十分重要的。用兩種不同的試驗方法已經分析了Ⅰ型MHC分子的結合親和力與分散的肽表位的免疫原性的關系(Sette等，免疫學雜志.，153:5586-5592(1994))。在第一種方法中，MHC分子結合親和力在10000倍范圍內變化的潛在表位的免疫原性在HLA-A※0201轉基因小鼠中進行了分析。在第二種方法中，用急性乙型肝炎病人的PBL評價了大約100種乙型肝炎病毒來源的不同的潛在表位的抗原性，這些表位都帶有A※0201結合基元。在這兩種方法中，發現結合閾值約為500nM(優選500nM或更低)決定肽表位引起CTL反應的能力。這些結果與天然加工的肽或前面所述的T細胞表位的Ⅰ型結合親和力的測定值十分相符。這些結果說明，在T細胞反應形成中決定基選擇具有重要作用。通常，CTL反應并不直接針對所有可能的表位。而是限于少數幾個免疫優勢決定基(Zinkernagel等，免疫學進展27,51-59(1979)；Bennink等，實驗醫學雜志168,1935-1939(1988)；Rawle等，免疫學雜志146,3977-3984(1991))。早就認識到免疫優勢(Benacerraf等，科學175,273-279(1972))可以解釋為一個給定的表位選擇性地結合一個特定的MHC分子的能力(決定基選擇理論)(Vitiello等，免疫學雜志131:1635(1983)；Rosenthal等，自然267,156-158(1977))，或被存在的TCR特異性選擇性地識別(全能理論)(Klein,J.,Immunology,theScienceofSelf-NonselfDiscrimination,JohnWiley&Sons,NewYork,pp270-310(1982))。已經證實，另外的因素，大多數與處理過程相關，也在誘發嚴格的免疫原性以外的反應中起關鍵作用，這些因素中的多數潛在的決定基將以免疫優勢的形式存在(Sercarz等，免疫學年評11,729-766(1993))。調節一個特定的免疫原性肽與一個或多個HLA分子結合親和力的能力，以及由此而調節由此肽引發的免疫反應的能力，將大大提高肽基疫苗和治療制劑的用途。本發明提供這些和其它的優勢。發明概述本發明提供用于疫苗和治療學的肽和編碼這些肽的核酸。本發明提供在病人身上誘導對預選的抗原產生細胞毒T細胞反應的方法。此方法包括將細胞毒T細胞與本發明的免疫原性肽接觸。本發明的肽可能來源于許多抗原，包括病毒抗原、腫瘤相關抗原、寄生蟲抗原、真菌抗原等。本發明的方法可以在體外和體內進行。在優選實施方案中，向病人給予含有編碼免疫原性肽序列的核苷酸分子，使肽與細胞毒T細胞接觸。在一個實施方案中，肽有約9-15個殘基，以小于約500nM的解離常數結合至少2個HLA-A3樣分子，并誘導細胞毒T細胞反應。此免疫原性肽具有包含一個結合基元的9殘基序列，從N末端到C末端如下位于第2位的第一個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的的第二個初級錨定殘基，選自R和K；和一個或多個次級錨定殘基，選自位于第3位的Y、F或W，位于第6位的Y、F或W，位于第7位的Y、F或W，位于第8位的P，以及這些的任意組合。本發明進一步提供結合HLA-A※0301基因產物的免疫原性肽。這些肽含有一個9殘基的結合基元，從N末端到C末端如下位于第2位的第一個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第二個初級錨定殘基，選自R和K；和一個或多個次級錨定殘基，選自位于第1位的R、H或K，位于第3位的Y、F或W，位于第4位的P、R、H、K、Y、F或W，位于第5位的A，位于第6位的Y、F或W，位于第8位的P，以及這些的任意組合。本發明也提供結合HLA-A※1101基因產物的免疫原性肽。這些肽含有一個9殘基的結合基元，從N末端到C末端如下位于第2位的第一個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第二個初級錨定殘基，選自R和K；和一個次級錨定殘基，選自位于第1位的A，位于第3位的Y、F或W，位于第4位的Y、F或W，位于第5位的A，位于第6位的Y、F或W，位于第7位的Y、F或W，位于第8位的P，以及這些的任意組合。本發明也提供結合HLA-A※3101基因產物的免疫原性肽。這些肽含有一個9殘基的基元，從N末端到C末端如下位于第2位的第一個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第二個初級錨定殘基，選自R和K；和一個次級錨定殘基，選自位于第1位的R、H或K，位于第3位的Y、F或W，位于第4位的P，位于第6位的Y、F或W，位于第7位的Y、F或W，位于第8位的A或P，以及這些的任意組合。本發明也提供結合HLA-A※3301基因產物的免疫原性肽。這些肽含有一個9殘基的基元，從N末端到C末端如下位于第2位的第一個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第二個初級錨定殘基，選自R和K；和一個次級錨定殘基，選自位于第3位的Y、F或W，位于第7位的A、Y、F或W，以及這些的任意組合。本發明也提供結合HLA-A※6801基因產物的免疫原性肽。這些肽含有一個9殘基的基元，從N末端到C末端如下位于第2位的第一個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第二個初級錨定殘基，選自R和K；和一個次級錨定殘基，選自位于第1位的Y、F、W、S、T或C，位于第5位的Y、F、W、L、I、V或M，位于第7位的Y、F或W，位于第8位的P，以及這些的任意組合。本發明也提供鑒定以小于約500nM的解離常數結合HLA-A3樣分子的免疫原性肽的方法。此方法包括篩選抗原蛋白中存在本發明結合基元的氨基酸序列，在抗原蛋白中選擇有結合基元的一個或多個亞序列。制備和檢測包含選定亞序列的約8個和11個殘基的試驗肽。然后鑒定解離常數小于500nM的肽。定義“肽”這個詞與“寡肽”在本說明書中交換使用，以指示一系列殘基，典型的是L氨基酸，一般是相鄰氨基酸的α氨基與羧基之間通過肽鍵相互連接。本發明的寡肽長度小于15個殘基，通常包含8個至11個殘基，優選9或10個殘基。一種“免疫原性肽”是一種含有等位基因特異的基元或超基元的肽，這樣此肽能結合一個MHC分子，并誘導CTL反應。本發明的免疫原性肽能結合到合適的HLA-A3樣分子上，并誘導對產生此免疫原性肽的抗原的細胞毒T細胞反應。“初級錨定殘基”是在肽序列上一個特定位置的氨基酸，它可以在免疫原性肽和MHC分子之間提供一個接觸點。一個限定長度的肽中1～3個，通常是2個初級錨定殘基決定一個免疫原性肽的基元。這些殘基通常與肽結合槽緊密接觸，它們的側鏈埋在槽本身的特定口袋中。典型的初級錨定殘基位于9聚體肽的第2位和第9位。“次級錨定殘基”是指一個氨基酸，它在肽中除初級錨定位置外的一個特定位置上，出現頻率顯著高于隨機出現頻率。另外次級錨定殘基可以鑒定為高親和力結合肽中出現頻率較高的氨基酸或與高親和力結合相關的氨基酸。在這些位置上特定殘基的存在與否，可以用來精細地調節含有特定基元的肽的結合親和力。這里使用的“負結合殘基”是指如果在一定的位置(通常不是初級錨定位置)上存在，將會引起對靶HLA分子結合親和力降低的氨基酸。“基元”是指限定長度的肽，通常是8到15個氨基酸，中殘基的模式，它被特定的MHC分子識別。對于每種人的MHC等位基因，肽基元通常是不同的，并且在初級和次級錨定殘基的模式上，肽基元也是不同的。“超基元”是指存在于免疫原性肽上時，使肽結合一個以上的HLA抗原的基元。超基元優選被至少一個HLA等位基因以高或中等親和力(見下面的限定)識別，優選被至少2個等位基因識別，更優選被至少3個等位基因識別，最優選被3個以上等位基因識別。共有某些相似的肽結合基元的HLAⅠ型分子歸類為HLA超型。這里所用的“HLA超型或家族”表示基于共同的肽結合特異性而歸類的分子組，而不是基于共同的抗原決定基的血清超型。這里所用的“HLA-A3樣”HLA分子(也稱為一個等位基因)是指由HLA-A等位基因編碼的一組HLA分子，它們與這里所公開的HLA-A3超基元共有交叉的肽結合基元。這些等位基因共有的9個殘基的超基元包括以下初級錨定殘基在第2位的A、L、I、V、M、S或T和第9位(9聚體的C末端)的正電荷殘基，如R和K。用血清學或DNA分型鑒定的此家族的典型成員包括A3(A※0301)、A11(A※1101)、A31(A※3101)、A※3301和A※6801。此家族的其它成員包括A34、A66和A※7401。正如下面的詳細解釋，通過在次級錨定位置的置換，可以精細的調節與每一種等位基因的結合。“HLA-A2樣”超型的特征是在肽配體的第2位和C末端偏愛小的或脂肪族氨基酸(L、I、V、M、A和T)。此家族包含至少8種HLA-A等位基因(A※0201、A※0202、A※0203、A※0204、A※0205、A※0206、A※6802和A※6901)。“HLA-B7樣”超型包括至少一打HLA-B等位基因編碼的產物(B7、B※3501、B51、B※5301、B※5401、B※5501、B※5502、B※5601、BB※6701和B※7801)(Sidney等，免疫學雜志154:247(1995)；Barber等，CurrBiol.5:179(1995)；Hill等，自然360:434(1992)；Rammensee等，免疫遺傳學41:178(1995))，其特征是識別在第2位帶脯氨酸并在C末端帶疏水性或脂肪族氨基酸(L、I、V、M、A、F、W和Y)的肽。“分離的”和“生物純的”這個詞是指基本上沒有在天然狀態經常與之相伴的組分的物質。因此，本發明的肽不含有正常與原位環境相關的物質，如抗原呈遞細胞上的MHCⅠ分子。一種蛋白即使分離到均一或優勢帶，仍然有天然蛋白的5-10％的痕量污染物與目的蛋白一起純化。本發明的分離肽不含有這種共純化的內源性蛋白。“殘基”是指通過酰胺鍵或酰胺鍵模擬物整合到寡肽中的氨基酸或氨基酸模擬物。附圖簡述圖1顯示5個A3樣等位基因的精確等位基因特異的基元A※0301、A※1101、A※3101、A※3301和A※6801。顯示了與每一個非錨定位置相關的，以良好的或弱的結合能力結合到每個單獨的等位基因上的單個殘基，或化學性質相似的殘基族。圖2顯示A3樣超基元。圓括號內的數字指示優選的或有害的殘基或殘基族的分子數。圖3概括了影響肽對a)B※0702、b)B※3501、c)B51、d)B※5301和e)B※5401結合能力的次級作用。這些圖隨后用來確定B7樣超基元(f)。圓括號內的數值指示優選的或有害的殘基或殘基族的頻率。圖4顯示由于在每一個非錨定位置上不同殘基的作用，A※0101亞基元9聚體肽的相對平均結合能力。2-9殘基(a)3-9殘基(b)亞基元肽的數據組，象在材料與方法中介紹的那樣分析和列表顯示。2-9和3-9組分別含有101和85個不同的肽。也顯示了影響帶2-9(c)3-9(d)殘基的A※0101亞基元的9聚體肽的結合能力的次級作用圖。圖5顯示由于在每一個非錨定位置上不同殘基的作用，A※0101亞基元10聚體肽的相對平均結合能力。分析和列表顯示了2-10殘基(a)或3-10殘基(b)亞基元肽的數據組。2-10和3-10組分別含有91和89個不同的肽。也顯示了影響帶2-10(c)殘基和(1)和或3-10殘基(d)A1亞基元的10聚體肽的結合能力的次級作用圖。優選實施方案的描述本發明涉及對人Ⅰ型MHC(稱為HLA)等位基因，特別是HLA-A3樣等位基因的等位基因特異的肽基元和超基元的確定。然后這些基元用來制備和修飾任何目的抗原的T細胞表位，這些抗原特別包括與人病毒病、寄生蟲病、真菌病或癌癥相關的抗原。正如上面所提到的，高HLA結合親和力與更高的免疫原性相關。更高的免疫原性可以用數種不同的方法加以證明。例如，更高結合的肽會更經常地產生免疫。接近90％的高結合肽是免疫原性的，相比之下，以中等親和力結合的肽只有50％是免疫原性的。更高結合的肽也導致更強烈的反應。結果，就需要更少的肽產生相似的生物學作用。因此在本發明的某些實施方案中，特別希望高結合的表位。在本發明的某些實施方案中，需要鑒定與優勢表位相對的亞優勢表位。這里采用的術語中(見Sercarz等，(1993)，同上)，一個“優勢表位”誘導用完全天然抗原免疫產生的反應。這樣一種反應在體外與肽表位交叉。一個“隱藏表位”激發由肽免疫引起的反應，但在體外不與完整蛋白用作抗原時交叉。最后，一個“亞優勢表位”是這樣一種表位，即用完整的抗原免疫幾乎不引起任何免疫反應，但用肽免疫可以獲得一種反應，而且這種反應(不象隱藏表位那樣)在用完整蛋白在體外回憶這種反應時被檢測。優勢和亞優勢的概念是與病毒病和癌癥的治療有關的。在慢性病毒病過程中，亞優勢表位的參與對感染的成功清除是十分重要的，特別是在由于功能性耐受、抑制、病毒突變和其它機制引起優勢CTL特異性失活時(Franco等，CurrentOptioninImmunology,7:524-531,(1995))。而且，在癌癥和腫瘤抗原的情況下，識別至少某些最高結合的肽的CTL，似乎由于耐受和抑制而功能性失活，而較低結合親和力的肽就被優先識別。特別是已經提到的，大量的來自已知的非病毒腫瘤相關抗原(TAA)的肽，以中等親和力(IC50％在50-500mM之間)結合HLAⅠ型。已經發現15個已知的TAA肽中的8個，被腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)或CTL識別，以50-500mM結合。這些結果與估計的組成對照，即90％的已知病毒抗原被識別為以50μM的IC50％或更小結合HLA的肽，而大約只有10％以50-500mM之間結合(Sette等，J.Immunol.,153:5586-5592(1994))。這種現象可能是由于在癌癥狀態下，因T細胞的耐受，而消除或功能性抑制識別數種最高結合的肽的CTL所致。本發明提供通過初級和次級錨定位置上所需殘基的選擇，而調節免疫原性肽的結合親和力的方法。正如以下詳細解釋的那樣，這里提供了增強結合到A3樣等位基因的超基元。依靠對結合親和力的理想作用，置換合適肽上的錨定殘基。用本發明可以獲得的修飾的例子包括增加特定等位基因的親和力(如，通過對等位基因特異的次級錨定殘基的置換)、提高不同等位基因之間的交叉反應性(如，通過一個以上的等位基因共有的次級錨定殘基的置換)、和產生亞優勢表位(如，通過能增加親和力，但在免疫優勢表位不存在的殘基的置換)。許多潛在的靶蛋白上的表位可以用于本發明。合適抗原的例子包括前列腺特異抗原(PSA)、乙型肝炎核心和表面抗原(HBVc、HBVs)、丙型肝炎抗原、EB病毒抗原、黑色素瘤抗原(如MAGE-1)、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原和人乳頭瘤病毒(HPV)抗原。真菌抗原的例子包括來自白色念珠菌、新型隱球菌、球孢菌屬的種類、組織胞漿菌屬的種類和煙曲霉的抗原。寄生蟲抗原包括來自瘧蟲屬的種類、錐蟲屬的種類、血吸蟲屬的種類、利氏曼蟲等的抗原。本發明肽的制備和評價在PCT出版物W094/20127和WO94/03205中有描述。簡言之就是合成含有來自特定抗原的表位的肽，并檢測其結合到合適MHC分子上的能力，使用的檢測方法包括用純化的Ⅰ型分子和放射碘標記的肽和/或表達空載Ⅰ型分子的細胞，進行免疫熒光染色和流動顯微熒光測定法；肽依賴的Ⅰ型裝配測定法；和肽競爭性CTL識別抑制。進一步評價了那些結合到Ⅰ型分子上的肽作為CTLs靶子的能力，這些CTLs來自感染的或免疫過的個體；也評價它們誘導初級體外或體內CTL反應的能力，這些CTL反應可以產生能與疾病相關的選擇性靶細胞反應的CTL群體。在整個這篇公開的內容中，用IC50’s這個詞來表示結果。設定測定法進行的條件(即限制MHC和標記的肽的濃度)，這些值大約是KD值。應該指出的是，如果測定的條件改變了，IC50的值可以改變，而且常常依據所用的特定的試劑而變化很大(如MHC制劑)。例如MHC過濃會增加給定配體的表觀的IC50檢測值。正如這里所用的，“高親和力”定義為以小于50nM的IC50(或KD)結合。“中等親和力”是以50-500nM之間的IC50(或KD)結合。測定結合的檢測法在PCT出版物WO94/20127和WO94/03205中有詳細描述。另一個表示結合數據的方法，是以與一個參照肽的相對值來表示。這個參照肽在每一次檢測中都用。隨著特定檢測法的敏感度的升降，被試肽的IC50’s也有一些變化。然而，與參照肽的相對的結合力是不會變的。例如在一定條件下進行檢測，參照肽的IC500增加10倍，所有的IC50值也將升高約10倍。因此。為了避免意思不清楚，評價一個肽是一個好的、中等的、弱的或負的結合物，應該根據它與標準肽的IC50相對的IC50。用來描繪肽化合物的名稱遵循常規的方法，即每個氨基酸殘基的氨基在左邊(N末端)，羧基在右邊(C末端)。在代表本發明選擇的特殊實施方案的表達式中，盡管沒有特別指明，但氨基和羧基基團是處于生理pH值條件下的狀態，除非有特別的說明。在氨基酸結構式中，每種殘基通常以標準的3字母或單字母表示法表示。氨基酸殘基的L型以一個大寫的單字母符號或大寫3字母符號中的第一個字母表示，而有D型的氨基酸殘基的D型以小寫的單字母符號或小寫的3字母符號表示。甘氨酸沒有不對稱的碳原子，就簡單地以“Gly”或G表示。免疫原性肽可以通過合成、DNA重組技術或從諸如全病毒或腫瘤等天然來源而制備。雖然這種肽優選基本上沒有其它天然存在的宿主細胞蛋白及其碎片，但在某些實施方案中，此肽能夠被合成連接到天然的片段或顆粒上。多肽或肽可以有不同的長度，不管是在中性(無電荷)狀態，還是其鹽，也不管是在沒有被糖基化、側鏈氧化或磷酸化的修飾狀態，還是在有這些修飾狀態，只要在這些修飾狀態下，多肽的生物活性不被破壞。理想的條件是，肽盡可能小，而仍然保持大肽的全部生物活性。如果可能，將本發明的肽優化到8至20個氨基酸殘基的長度比較理想，典型的是9到15個，優選9到10個，與結合到細胞表面MHCⅠ型分子上的、內源性處理的病毒肽或腫瘤細胞肽的大小相當。這里公開的優選的超基元適合于長度約9個殘基的肽。其它長度的肽(如8、10和11個殘基)的超基元、初級錨定和次級錨定的鑒定，可以用這里介紹的技術進行。有所需活性的肽可以按需要被修飾成含有某些所需的特征，如改進的藥理學特性，而增加或至少基本上保留未修飾肽的全部生物活性，以結合理想的MHC分子并活化合適的T細胞。例如肽可以被不同地改變，如保守的或非保守的置換，這種改變為其使用提供了一定的優勢，如改進的MHC結合。保守置換是指一個氨基酸殘基被另一個生物學和/或化學性質相似的殘基所置換，如一個疏水殘基被另一個疏水殘基置換，或一個極性殘基被另一個極性殘基置換。這些置換包括如下的組合Gly,Ala；Val,Ile,Leu.,Met；Asp,Glu；Asn,Gln；Ser,Thr；Lys,Arg；和Phe,Tyr。單個氨基酸置換的效果也可以用D-氨基酸檢測。這種修飾可以用熟知的肽合成方法完成，正如在Merrifield，科學232:341-347(1986)，和StewartandYoung,SolidPhasePeptideSynthesis,(Rockford,I11.,Pierce),2dED.(1984)介紹的那樣。肽也可以通過延伸或縮短此化合物的氨基酸序列而被修飾，如氨基酸的增加或刪除。本發明的肽或類似物也可以通過改變某些殘基的次序或組成而被修飾，但首先應該清楚某些氨基酸殘基對生物活性是必需的，如那些在關鍵結合位點的或保守的殘基，這些殘基通常不被改變，從而對生物活性沒有不利的作用。非關鍵的氨基酸不必限定于在蛋白中天然存在的那些，如L-α氨基酸或其D異構體，也可以包括非天然的氨基酸，如β-γ-δ氨基酸，和許多L-α氨基酸的衍生物。通常，單個氨基酸置換的一系列的肽被用來測定靜電荷、疏水性對結合的影響。例如，沿著肽的長度制備一系列的正電荷(如Lys或Arg)或負電荷(如Glu)氨基酸置換物，揭示對各種MHC分子和T細胞受體敏感性的不同模式。另外，可以用小的、相對中性的殘基如Ala、Gly、Pro、或類似的殘基進行多個置換。置換物可以是同源寡聚體或異源寡聚體。被置換或添加的殘基的數量和類型，取決于基本結合點之間的必需間距與所尋求的特定功能特征(如疏水性對親水性)。與母本肽的親和力相比，這種置換也可以獲得對MHC分子或T細胞受體增加的結合親和力。在任何情況下，這種置換所選用的氨基酸殘基或其它分子片段，應該避免破壞結合的空間和電荷的干擾。典型的氨基酸置換是單個殘基置換。置換、刪除、插入或這些的任何組合可以合并以獲得最終的肽。置換的變體是指那些在肽上至少一個殘基被刪除而在其位置上插入另一個不同的殘基。這些置換通常按照以下的表1進行，此時希望精確調節肽的特征。表1原始殘基示范置換AlaSerArgLys,HisAsnGlnAspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyProHisLys；ArgIleLeu；ValLeuIle；ValLysArg；HisMetLeu；IlePheTyr；TrpSerThrThrSerTrpTyr；PheTyrTrp；PheValIle；Leu通過選擇比表1中的置換更不保守的置換得到功能上(如對MHC分子或T細胞受體的親和力)的明顯改變，即選擇對維持以下特征有顯著不同作用的殘基，(a)在置換區域內肽主鏈的結構，如片層或螺旋構象，(b)在靶位點分子的電荷或疏水性，或(c)側鏈的大小。通常預計對肽的性質產生最大改變的置換是(a)親水殘基，如絲氨酰基，置換(或被)疏水殘基(置換)，如亮氨酰基、異亮氨酰基、苯丙氨酰基、纈氨酰基或丙氨酰基；(b)帶正電荷側鏈的殘基，如賴氨酰基、精氨酰基、或組氨酰基，置換(或被)負電荷殘基(置換)，如谷氨酰基或天冬氨酰基；或(c)有龐大側鏈的殘基，如苯丙氨酸，置換(或被)沒有側鏈的殘基(置換)，如甘氨酸。此肽也可以包含免疫原性肽中兩個或更多個殘基的等配物。這里所說的等配物是指由于第一段序列的空間構象符合第二段序列特異的結合位點，而能夠置換第二段序列的兩個或更多殘基的一段序列。這個詞特別包括本領域技術人員熟知的肽主鏈修飾。這些修飾包括酰胺氮的修飾、α碳的修飾、酰胺羧基的修飾、酰胺鍵的完全取代、延伸、刪除或主鏈交聯。一般參見Spatola,ChemistryandBiochemistryofAminoAcids,PeptidesandProteins,Vol.Ⅶ(Weinsteined..1983)。用各種不同的氨基酸的模擬物或非天然的氨基酸進行肽修飾在提高肽在體內的穩定性是特別有用的。穩定性可以用許多方法檢測。例如，肽酶和各種生物介質，如人血漿和血清，已被用于檢測穩定性。見如Verhoef等，Eur.J.DrugMetab.Pharmcokin11:291-302(1986)。本發明的肽的半衰期用25％人血清(V/V)檢測法方便地確定。方法大致如下收集的血清(AB型，非熱滅活)在使用前離心去除脂肪。然后用RPMI組織培養基稀釋到25％，用于檢測肽的穩定性。在預定時間間隙，取出小量的反應液，加入6％的三氯乙酸或乙醇水溶液。絮狀反應樣品冷卻(4℃)15分鐘，然后旋轉使沉淀的血清蛋白形成小球。然后用穩定特異的層析條件，通過反相HPLC確定肽的存在。本發明的肽或有CTL刺激活性的類似物，可以被修飾而提供所需的特性，而不是提高血清半衰期。例如肽誘導CTL活性的能力可以通過連接一段序列而加強，此序列含有至少一個能誘導T輔助細胞反應的表位。特別優選的免疫原性肽/T輔助肽結合物通過一個間隔分子連接。典型的間隔分子包括相對小的中性分子，如氨基酸或氨基酸模擬物，它們在生理條件下基本不帶電。間隔物一般選自Ala、Gly，或其它非極性氨基酸或中性極性氨基酸的中性間隔物。應當知道，任選的現有的間隔物不必包含同一個殘基，因此可以是異源或同源寡聚物。現有的間隔物通常是至少一個或兩個殘基，更常見的是3-6個殘基。另外，CTL肽可以不用間隔物連接到T輔助肽上。免疫原性肽可以直接地，或借助一個間隔物在CTL肽的氨基末端或羧基末端，連接到T輔助肽上。免疫原性肽或T輔助肽的氨基末端可以被酰化。本發明所用的T輔助肽可以以CTL肽同樣的方式修飾。例如，它們可以被修飾成含有D氨基酸或連接到諸如脂、蛋白質、糖等其它分子上。典型的T輔助肽包括破傷風類毒素830-843、流感307-319、瘧疾環子孢子382-398和378-389。另外，T輔助肽是一種被大多數T輔助細胞識別的肽。這可以通過選擇結合許多、大多數或全部的Ⅱ型MHC分子的氨基酸序列而實現。這些是被認為“MHC不嚴格限定的”或“雜亂的”T輔助序列。氨基酸序列雜亂的例子，包括來自抗原的序列，如破傷風毒素830-843位(QYIKANSKFIGITE),PlasmodiumfalciparumCS蛋白378-398位(DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS)和鏈球菌18KD蛋白1-16位(GAVDSILGGVATYGAA)。另外，用自然界未發現的氨基酸序列，以MHC不嚴格限定的方式，可以制備能刺激T輔助淋巴細胞的合成肽(見PCT出版物WO95/07707)。這些稱為Pan-DR結合表位(PADRE)的合成化合物是根據其對大多數HLA-DR(人Ⅱ型MHC)分子的結合活性而設計的。例如，發現含有通式aKXVWANTLKAAa的肽，這里X=環己基丙氨酸、苯丙氨酸、或酪氨酸，a=D-丙氨酸或L丙氨酸，結合大多數HLA-DR等位基因，并刺激大多數個體的T輔助淋巴細胞的反應，不管個體的HLA類型。T輔助表位也可以被修飾而提高其生物學作用。例如，存在于T輔助表位的肽可以含有D-氨基酸而提高其對蛋白酶的抵抗力，因此延長其血清半衰期。T輔助表位也可以結合到其它分子上，如脂質、蛋白質或糖，或任何其它的合成化合物，而提高其生物活性。尤其是T輔助肽可以以氨基或羧基末端結合到一個或多個棕櫚酸鏈上。在某些實施方案中，可能需要在本發明的藥用組合物中包含至少一種引發CTL的組分。脂質已被鑒定為能引發體外抗病毒抗原CTL的試劑。例如，棕櫚酸殘基能結合到Lys殘基的α和ε氨基基團上，然后借助一個或多個連接殘基，如Gly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser等，連接到免疫原性肽上。然后這種脂化的肽能以分子團的形式、整合到脂質體中或與不完全弗氏佐劑等佐劑乳化直接注射。在優選實施方案中，特別有效的免疫原包括結合到Lys殘基的α和ε氨基基團上的棕櫚酸，這是借助Ser-Ser的連接結合到免疫原性肽的氨基端上。作為CTL反應的脂質引發的另一個例子，大腸桿菌脂蛋白，如三棕櫚酰-S-甘油酰半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(P3CSS)Ⅰ，當共價結合到一個適合的肽上，可以用來引發病毒特異的CTL。見Deres等，自然342:561-564(1989)，在此引用作為參考。本發明的肽可以偶聯到P3CSS上，例如給一個個體給予脂肽以特異地引發對靶抗原的CTL反應。而且，由于中和抗體的誘導也可以用結合到呈現合適表位的肽上的P3CSS引發，所以這兩種組合物可以合并使用，以更加有效地激發對抗感染的體液和細胞介導的應答。另外，額外的氨基酸可以加到肽的末端，而使一個肽容易連接到另一個肽上、使肽偶聯到載體或大肽上、修飾肽或寡肽的理化性質等。氨基酸如酪氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、谷氨酸或天冬氨酸等可以被引入到肽或寡肽的C或N末端。在某些例子中，C末端的修飾會改變肽的結合特性。而且肽和寡肽的序列由于被末端-NH2酰化，如鏈烷基(alkaboyl)(C1-C20)、或巰基乙酰化，末端羧基酰胺化，如氨、甲胺等修飾，而與天然序列不同。在某些例子中，這些修飾能提供結合到一個支持物或其它分子的位點。本發明的肽能夠以許多途徑制備。由于較短，此肽可以按常規技術在溶液中或在固體支持物上合成。有許多商品化的自動合成儀，可以按已知的程序使用。例如見StewartandYoung,SolidPhasePeptideSynthesis,2d.ed.,PierceChemicalCo.(1984)，同上。另外，可以用重組DNA技術，將編碼一個感興趣的免疫原性肽的核苷酸序列插入到一個表達載體中，轉化或轉染到一個合適的宿主細胞中，在適合表達的條件下培養。這些步驟在本領域是眾所周知的，正如在Sambrook著的MolecularCloning,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NewYork(1982)所一般介紹的，在此引用作為參考。因此，包含一個或多個本發明的肽序列的融合蛋白可以用來呈遞合適的T細胞表位。由于這里期望長度的肽的編碼序列可以通過化學技術合成，例如Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.103:3185(1981)介紹的磷酸三酯法，可以通過簡單地將編碼天然肽序列的合適堿基置換而進行修飾。然后編碼的序列可以提供合適的連接物，并連接到本領域常用的表達載體中，此載體用來轉化合適的宿主產生所需要的融合蛋白。現在已有許多這樣的載體和合適的宿主系統。對于融合蛋白的表達，編碼序列帶有可操作連接的起始密碼子和終止密碼子、啟動子和終止子區以及通常的復制系統，以提供在所需的細胞系統中表達的表達載體。例如，與細菌宿主相容的啟動子序列裝在含有合適的限制位點以插入所需編碼序列的質粒中。得到的表達載體轉化到合適的細菌宿主中。當然，合適的載體和對照序列也可以使用酵母或哺乳動物細胞宿主。本發明的肽和本發明的藥用和疫苗組合物，對給哺乳動物給藥，特別是人給藥，以治療和/或預防病毒感染和癌癥是有用的。用本發明的免疫原性肽可以治療的疾病的例子包括前列腺癌、乙型肝炎、丙型肝炎、AIDS、腎癌、頸癌、淋巴瘤、CMT和尖銳濕疣。另外，此肽可用于治療任何感染性疾病，如病毒、真菌和寄生蟲感染。例如在WO94/20127和WO94/03205中公開了合適的抗原。正如上面所提到的。本發明的肽與對肽上表位特異的CTL接觸時，誘導CTL免疫反應。然而，肽與CTL接觸的方式對本發明并不關鍵。例如肽可以在體內或體外與CTL接觸。如果接觸發生在體內，肽本身可直接對病人給藥，或用以下介紹的其它的載體(如編碼一種或多種肽的DNA載體、編碼此肽的病毒載體、脂質體等)給藥。對于藥用組合物，免疫原性肽或編碼它們的DNA給藥給已經患有癌癥或感染有目的病原體的病人。肽或編碼它們的DNA可以單獨給藥，或以這里公開的一個或多個肽序列融合給藥。處于潛伏期或急性感染期的病人可以用免疫原性肽單獨治療，或與其它合適的治療方法聯合。在治療應用中，向病人給予足夠量的組合物，以引發對病毒或癌癥抗原有效的CTL反應，來治療或至少部分控制癥狀和/或并發癥。達到此目的的足夠的量稱為“治療有效量”。對這種用途的有效量取決于諸如所給予的特定的組合物、給藥的方式、疾病治療時的階段和嚴重程度、病人的體重和大概健康狀態和處方醫生的判斷。但初次免疫(治療或預防給藥)的劑量范圍大概是70kg的病人1.0μg～5000μg的肽。加強劑量為1.0μg-1000μg的肽，根據檢測病人血液中特異的CTL的活性而確定的病人的反應和條件，決定加強期為數周或數月。必須牢記本發明的肽和組合物通常是用于嚴重的疾病狀態，即威脅生命或潛在威脅生命的狀態。在這種情況下，鑒于此肽的外源物質最少和相對無毒性，治療醫生可能和希望給予超量的肽組合物。對于治療應用，應該在病毒感染的第一癥狀出現時，或腫瘤檢出或手術切除時，或急性感染診斷后不久，開始給藥。然后加強劑量直到至少癥狀基本消退并維持一段時間。在慢性感染中需要在加強劑量后補充劑量。用本發明的組合物治療感染的病人可以促進急性感染病人感染的消除。對于那些易于(或傾向于)發展成慢性感染的病人，這些組合物對于預防從急性轉變成慢性是特別有用的。例如一旦在感染前或在感染過程中，確定了易于轉變的病人，正如這里介紹的，就向他們給予組合物，盡量減少給更大人群給藥的必要。此肽和其它組合物也可以用來治療慢性感染，和刺激免疫系統來清除攜帶者中病原體感染的細胞。重要的是，以一種制劑和方式提供的免疫增強肽的量，要足以有效地刺激T細胞反應。因此，為了治療慢性感染，典型的劑量是，70kg病人每次約1.0μg～5000μg的范圍，優選約5μg～1000μg。可能需要在確定的間隔期，如1到4周，給予免疫劑量繼之以加強劑量，持續一個延長期至有效地免疫病人。在慢性感染的情況下，應該連續給藥，直到臨床癥狀或實驗室檢測顯示病毒感染被清除或基本消退，并維持一段時間。用于治療的藥用組合物打算通過非腸道、表面、口服或局部給藥。優選地，此藥用組合物通過非腸道給藥，如靜脈、皮下、真皮內或肌肉內。因此本發明提供用于非腸道給藥的組合物，此組合物包括免疫原性肽溶于或懸浮于一個可接受的載體，優選水性載體的溶液。可以使用各種水性載體，如水、緩沖水、0.8％的鹽水、0.3％的甘氨酸、透明質酸等。這些組合物可以通過常規的、熟知的滅菌技術除菌，也可以通過過濾除菌。得到的液體溶液可以分裝備用，或凍干。凍干的制劑在給藥前與無菌溶液聯合。這些組合物可以含有藥用可接受的、因需要接近生理條件而加的輔助物質，如pH調節和緩沖劑、張力調節劑、潤濕劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、單月桂酸山梨聚糖、三乙醇胺油酸酯等。本發明的CTL刺激肽在藥用制劑中的濃度變化很大，即從重量小于0.1％，通常在或小于2％，到高至20％至50％或更高。濃度主要通過液體體積、粘性等選擇，與所選擇的特定的給藥方式一致。本發明的肽也可以借助脂質體給藥，脂質體把肽送到特定的組織，如淋巴組織、或選擇性地送到感染的細胞，還可以延長肽組合物的半衰期。脂質體包括乳劑、發泡劑、微膠粒、不溶性單分子層、液晶、磷脂分散體、片層等。在這些制劑中，釋放的肽單獨地、或與一個分子聯合整合到脂質體中，這個分子結合到淋巴細胞中普遍存在的受體，如結合CD45抗原的單克隆抗體上，或與其它治療的或免疫原性的組合物聯合整合到脂質體中。因此填充有或包裹有本發明肽的脂質體，可以被直接送到淋巴細胞的部位，在這里脂質體然后釋放選擇的治療性/免疫原性肽組合物。本發明所用的脂質體是由標準的發泡脂制備的，通常包含中性的和帶負電荷的磷脂和甾醇，如膽甾醇。脂質的選擇通常以以下的考慮為指導，如脂質體的大小、耐酸性和脂質體在血流中的穩定性。已有許多方法制備脂質體，如Szoka等，生物物理與生物工程年評9:467(1980),U.S.PatentNos.4235871,4501728,4837028，和5019369中介紹的。在此引入作為參考。為了運送到免疫細胞上，整合到脂質體中的配體可以包括，諸如對所需的免疫系統細胞的表面決定基特異的抗體或其片段。含有肽的脂質體懸液可以靜脈給藥，表面給藥或局部給藥，給藥的劑量具體根據給藥的方式、所給的肽的種類和所治療疾病的階段而變化很大。對于固體組合物可以使用常規的無毒的固相載體，例如包括藥用級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。對于口服給藥，藥用可接受的無毒組合物是通過混合任何正常使用的賦形劑，如前面列出的那些載體，和一般10-95％的活性成分，即一種或多種本發明的肽，更優選的濃度為25-75％而形成。對于氣溶膠給藥，免疫原性肽優選地與表面活性劑和推進劑一起以精細分散的形式提供。肽的典型的百分比是重量的0.01％-20％，優選1％-10％。表面活性劑必須是無毒的，而且最好在推進劑中是可溶的。這些試劑的代表是含6至22個碳原子的脂肪酸的酯或不完全酯，如己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、油硬脂酸(olesteric)和油酸與脂肪族多元醇或其環狀酐形成的酯。可以使用混合酯如混合或天然的甘油酯。表面活性劑可以占組合物重量的0.1％-20％，優選0.25-5％。組合物的平衡是用通常的推進劑。如果需要，也可包括載體，如鼻內給藥的卵磷脂。本發明的另一方面涉及疫苗，疫苗含有一種活性組分，即免疫有效量的這里介紹的一種或多種免疫原性肽。這種肽可以通過連接到自身的載體或以活性肽單元的同源多聚物或異源多聚物的形式引入到包括人的宿主體內。這種多聚物具有提高免疫反應的優勢，而且如果用不同的肽制備多聚物，就有另外的能力來誘導與病毒或腫瘤細胞不同的抗原決定基反應的抗體和/或CTLs的產生。有用的載體在本領域是熟知的，包括諸如甲狀腺球蛋白、白蛋白如人血清白蛋白、破傷風類毒素、多聚氨基酸如多聚(賴氨酸∶谷氨酸)、流感病毒、乙型肝炎核心蛋白、乙型肝炎重組疫苗等。疫苗也可以含有生理耐受的(可接受的)稀釋劑，如水、磷酸緩沖鹽水、或鹽水，而且進一步一般包括一種佐劑。佐劑，如不完全弗氏佐劑、磷酸鋁、氫氧化鋁、或明礬是本領域熟知的物質。而且，如上所述，CTL反應可以通過將本發明的肽結合到脂質，如P3CSS上而引發。用這里介紹的肽組合物，通過注射、氣溶膠、口服、經皮或其它途徑免疫，宿主的免疫系統通過產生大量的對目的抗原特異的CTLs而對疫苗反應，而且宿主對以后的感染至少部分免疫，或對發展成慢性感染有抵抗力。含有本發明肽的疫苗組合物給予易于患、或正處于病毒感染或癌癥危險的病人，以激發對抗原的免疫反應，因此提高病人自身的免疫反應能力。這樣一種量稱為“免疫有效量”。在這種使用中，精確的劑量再次取決于病人的健康狀況和體重、給藥的方式和制劑的性質等。但通常的范圍是70kg的病人約1.0μg至大約5000μg，更常用的是每70kg體重約10μg至大約500μg。在某些例子中，需要將本發明肽疫苗與能誘導對目的病毒，特別是對病毒被膜抗原，產生中和抗體反應的疫苗聯合。為了治療或免疫的目的，本發明的肽也可以用減毒的病毒宿主，如牛痘或禽痘病毒表達。這種方法涉及將牛痘病毒用作載體來表達編碼本發明肽的核苷酸序列。如果將其引入急性或慢性感染的宿主或引入未感染的宿主，重組的牛痘病毒會表達免疫原性肽，因而激發宿主的CTL反應。牛痘載體和免疫程序有用的方法如U.SPatentNo.4722848的描述。在此引入作為參考。另一個載體是BCG(BcilleCalmetteGuerin)。BCG載體在Stover等，(Nature351:456-460(1991))中有描述，在此引入作為參考。對本發明肽的治療給藥或免疫有用的大量其它的載體，如傷寒沙門氏菌載體等，從這里的描述，本領域的技術人員是明了的。抗原肽也可用來引發離體CTL。產生的CTL能用來治療對其它常規的治療方法沒有反應，或對肽疫苗的治療方法沒有反應的病人的慢性感染(病毒性或細菌性)或癌癥。通過將病人的CTL前體細胞(CTLp)與一種來源的抗原呈遞細胞(APC)以及合適的免疫原性肽在組織培養中共孵，可以誘發對特定病原體(感染因子或腫瘤抗原)的離體CTL反應。經過合適的孵育時間(通常1-4周)，CTLp被激活并成熟和發展成效應CTL。這些細胞重新輸回給病人，這樣它們將破壞特異的靶細胞(感染的細胞或腫瘤細胞)。編碼一個或多個本發明肽的DNA也可以給病人給藥。這種方法，例如在Wolff等，科學247:1465-1468(1990)和U.S.PatentNos.5580859和5589466中有描述。編碼本發明肽的核苷酸給藥的一個優選方法是使用編碼多個本發明表位的小基因構建體。為了構建在人細胞中表達的編碼選擇的CTL表位的DNA序列(小基因)，反翻譯此表位的氨基酸序列。使用人密碼子使用表指導每一個氨基酸的密碼的選擇。這些編碼表位的DNA序列直接毗連，構建一個連續的多肽序列。為了優化表達和/或免疫原性，將另外的元件整合到小基因的設計上。能夠被反翻譯并包括在小基因序列中的氨基酸序列的例子包括輔助T淋巴細胞表位、引導(信號)肽和內質網滯留信號。另外，CTL表位的MHC呈遞，能夠通過包含與CTL表位毗連的合成的(如多聚丙氨酸)或天然存在的旁側序列而加強。小基因序列通過裝配寡核苷酸而轉到DNA中，這些寡核苷酸編碼小基因的正鏈和負鏈。用熟知的技術，在合適的條件下合成、磷酸化、純化和退火重疊的寡核苷酸(30-100個堿基長)。用T4DNA連接酶連接寡核苷酸的末端。這種合成的小基因，編碼CTL表位多肽，能夠克隆到所需的表達載體中。本
技術領域：
熟知的標準調節序列包含在載體中，以保證在靶細胞中表達。還需要幾種載體元件一個帶有下游克隆位點以便小基因的插入的啟動子；一個為了有效轉錄終止的聚腺苷化信號；一個大腸桿菌復制起始區；和一個大腸桿菌的選擇標記(如氨芐青霉素或卡那霉素抗性)。許多啟動子可以用于此目的，如人巨細胞病毒(hCMV)啟動子。其它合適的啟動子序列，見U.S.PatentNos.5580859和5589466。可能需要另外的載體修飾來優化小基因表達和免疫原性。在某些情況下，有效的基因表達需要內含子，一個或多個合成的、或天然存在的內含子可以整合到小基因的轉錄區。也可以考慮包含mRNA穩定序列以提高小基因的表達。近來已經提出免疫刺激序列(ISSs或CpGs)對DNA疫苗的免疫原性起作用。如果發現可以提高免疫原性，這些序列可以包含在載體中，在小基因編碼序列之外。在某些實施方案中，可以使用雙順反子，使產生小基因編碼的表位和第二蛋白，后者用來加強或減弱免疫原性。蛋白或多肽如果協同表達，能夠有助于加強免疫反應的例子包括細胞因子(如IL2、ILl2、GM-CSF)、細胞因子誘導分子(如LeIF)或協同刺激分子。輔助(HTL)表位可以結合到細胞內靶信號上，并與CTL表位分開表達。這就使HTL表位針對與CTL表位不同的細胞區。如果需要，還可以使HTL表位更有效地進入到Ⅱ型MHC途徑，因此加強CTL誘導。與CTL誘導相比，通過免疫抑制分子(如TGF-β)的協同表達特異性地減弱免疫反應在某些疾病是有益的。一旦選擇了一個表達載體，小基因就克隆到啟動子下游的多克隆位點中。這個質粒轉化到合適的大腸桿菌菌株中，用標準技術制備DNA。小基因的方向和DNA序列，以及包含在載體中的其它元件，用限制性酶切圖譜和DNA序列分析來證實。裝有正確質粒的細菌細胞可以以主細胞庫和工作細胞庫保存。治療量的質粒DNA通過發酵大腸桿菌生產，接著純化。用工作細胞庫中的小量菌種，接種到發酵培養基中(如Terrific肉湯)，按熟知的技術在搖瓶或生物反應器中生長至飽和。用標準的生物分離技術，如Quiagen公司提供的固相陰離子交換樹脂，純化質粒DNA。如果需要，可以用凝膠電泳或其它方法從開環和線性DNA中分離超螺旋DNA。純化的質粒DNA可以用許多制劑注射。最簡單的是凍干的DNA在滅菌的磷酸緩沖鹽水(PBS)中重配。這種方法稱為“裸DNA”，近來正用于臨床實驗的肌肉內(IM)注射。為了使小基因DNA疫苗的免疫治療效果達到最大，可能需要另一種方法配制純化的DNA。已經介紹了許多方法，并且有新方法。陽離子脂質也可以用于這種制劑(如見DebsandZhu(1993)WO93/24640；ManninoandGould-Fogerite(1988)生物技術6(7):682-691；RoseU.S.PatNo.5279833；Brigham(1991)WO91/06309；和Felgner等，(1987)美國國家科學院院刊84:7413-7414中介紹的)。另外，糖脂、融合脂質體、肽和統稱為保護性、相互作用、非濃縮(PINC)的化合物也可以與純化的質粒DNA混合，以影響變量，如穩定性、肌肉內分散、或結合到特異的器官或細胞類型上。核酸也可以用彈道發送的方式給藥，例如，象U.S.PatentNo.5204253介紹的那樣。可以給予只包含DNA的顆粒。另外，DNA可以粘附到顆粒，如金粒上。靶細胞的致敏可用作一種功能性檢測法，檢測編碼CTL表位的小基因的表達和Ⅰ型MHC的呈遞。質粒DNA引入到哺乳動物細胞系中，此細胞系合適于作為標準CTL鉻釋放檢測法的靶子。使用的轉染法取決于最終的配方。對于“裸”DNA可以用電穿孔法，而陽離子脂質就可以在體外直接轉染。表達綠熒光蛋白(GFP)的質粒可以共轉染，而通過熒光活化細胞分類法(FACS)富集轉染的細胞。然后這些細胞用鉻-51標記，用作表位特異的CTL系的靶細胞。細胞裂解，通過51Cr的釋放檢測，指示編碼CTL表位的小基因的MHC呈遞的產生。體內免疫原性是第二種功能性檢測小基因DNA制劑的方法。表達合適人MHC分子的轉基因小鼠用DNA產物免疫。給藥劑量和途徑取決于制劑(如，IM適合溶于PBS的DNA,IP適合與脂質混合的DNA)。免疫后21天，收集脾細胞，在有編碼每種被試表位的肽存在下再刺激1周。用標準的技術檢測這些效應細胞(CTLs)對帶有肽、鉻-51標記的靶細胞的細胞裂解作用。由于MHC載有相應于小基因編碼的表位的肽而致敏的靶細胞裂解，就證實了DNA疫苗體內誘導CTLs的功能。本發明的肽也發現用作診斷試劑。例如本發明的肽可以用來確定特定的個體對使用肽或相關肽的治療方案的敏感性，因此對改進現有的治療方案、或確定感染病人的預后是有幫助的。另外，此肽也可以用來預測哪些病人會有發展成慢性感染的危險。下面提供的例子是為了說明，并非為了限制。實例1A3樣超型結合此實例提供每一種A3樣等位基因A3、A11、A※3101、A※3301和A※6801的精細的基元，概要的次級錨定結合特異性。基元是通過計算此肽序列上每一個非錨定位置上肽的平均相對結合能力而得到的，這些肽帶有20個常見氨基酸的每一個。按照每一個的化學相似性分組。材料與方法Ⅰ型純化。以下的Epsstein-Barr病毒(EBV)轉化的純合細胞系用作Ⅰ型分子的來源GM3107(A3、B7；人遺傳突變資源庫)；BVR(A11、B35.3、Cw4；人遺傳突變資源庫)；SPACH(A31、B62、Cw1/3；ASHI資源庫總匯)；和LWAGS(A※3301、B14、Cw8；ASHI資源庫總匯)(Bodmer等，人類免疫學43:149(1995))。由Dr.WalterStorkus(匹茲堡大學)鑒定的C1R轉染子用來分離A※6801。細胞系按以前的介紹維持(Sidney等，免疫學雜志154:247(1995)；Sette等，分子免疫學31:813(1994))。按以前的介紹(Sidney等，免疫學雜志154:247(1995)；Sette等，分子免疫學31:813(1994))制備細胞裂解物并純化Ⅰ型分子。簡言之，細胞在含1％NP-40(FlukaBiochemika,Buchs,Switzerland)、150mMNaCl、5mMEDTA和2mMPMSF的50mMTris-HCl,pH8.5中以108細胞/ml的濃度裂解。裂解物過0.45μM的濾膜，10000g離心20分鐘除去細胞核和碎片。然后用親和層析純化主要組織相容復合物(MHC)分子。非活化的SepharoseCL4B和蛋白ASepharose柱用作預柱。細胞裂解物反復通過連接有抗HLA(B、C)抗體B1.23.2(Rebai等，組織抗原22:107(1983))的蛋白ASepharose珠，而清除HLA-B和HLA-C分子。為了有效地清除，一般需要2至4次通過。接著，用抗HLA(A、B、C)抗體W6/32(Barnstable等，細胞14:9(1978))來結合HLA-A分子。蛋白的純度、濃度、和清除步驟的效果由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測。結合檢測和超基元確定。基于放射標記的標準探針肽結合到溶于去污劑的MHC分子的抑制，肽與可溶Ⅰ型分子結合的定量檢測按以前介紹的進行(Kubo等，免疫學雜志152:3913(1994)；Kast等，免疫學雜志152:3904(1994)；Sidney等，免疫學雜志154:247(1995)；Sette等，分子免疫學31:813(1994)；Ruppert等，細胞74:929(1993))。簡言之，1-10nM放射標記的探針肽，氯胺T法標記碘(Greenwood等，生物化學雜志89:114(1963))，在有1μM人β2微球蛋白(ScrippsLaboratories,SanDiego.CA,USA)和混合的蛋白酶抑制劑存在下，與不同量的MHC在室溫下共孵。共孵2天后，MHC結合的放射活性的百分率用TSK2000柱上通過大小排除凝膠過濾層析確定。A3CON1肽(序列KVFPYALINK)(Kubo等，免疫學雜志152:3913(1994))用作檢測A3、A11、A31和A※6801的放射標記探針。HBVc141-151(序列STLPETYVVRR)的T7→Y類似物(Missale等，實驗醫學雜志177:751(1993))用作檢測A※3301的放射標記探針。在競爭檢測法的情況中，計算產生放射標記探針肽結合抑制50％的肽濃度(IC50)。常常在一或兩個高劑量檢測肽，在隨后的實驗中確定產生陽性抑制的肽的IC50，在此實驗中如果需要，進一步檢測2-6個稀釋度。使放射標記探針肽大約15％結合的MHC濃度用于所有的競爭抑制檢測。因為在這些條件下(標記的)<(MHC)而且IC50>(MHC)，檢測的IC50是真實KD值的合理的近似值。每一種競爭肽在2-4個完全獨立的實驗中檢測。作為一個陽性對照，在每一次實驗中都要檢測與放射標記探針有關的未標記的肽，并測定其IC50。A3CON1檢測A3、A11、A31和A※6801的平均IC50分別是11、6、18和8nM。ehHBVc141-151肽在A※3301檢測法中的平均IC50是29nM。HLA-A特異的次級錨定基元的確定。使用Ruppert等(Ruppert等，細胞74:929(1993))介紹的方法的改良法來確定A※0201的次級錨定基元。簡言之，等位基因特異的次級錨定基元，通過評價對20個常見氨基酸在9聚體序列的每一個非錨定位置上的HLA結合的作用而確定。通過計算每一位置氨基酸組合(如1位丙氨酸；2位丙氨酸等)的平均相對結合值而進行評估。為克服某些氨基酸的出現頻率低的問題，如以前介紹的(Ruppert等，細胞74:929(1993))那樣，將一些氨基酸與其它性質類似的歸成一組。在特定位置上以平均結合能力4倍高于(或低于)全部200肽組合的總的平均結合能力結合的殘基類型，就被認為以好(或弱)結合能力結合。肽合成。按以前介紹的方法(Ruppert等，細胞74:929(1993))合成肽，或從ChironMimotopes(ChironCorp.,Australia)以原料購買。合成的肽通過反相高壓液相層析(HPLC)純化到＞95％的均一性。這些合成肽的純度在分析反相柱上檢測，其組成用氨基酸分析、測序和/或質譜分析確定。在不同的人種背景和設計的人群覆蓋度中HLA超型的表型頻率的計算。用雙向分布公式gf=1-(SQRT(1-af))(Tiwari等，TheHLAComplex，見HLAandDiseaseAssociates,NY,Springer-Verlag(1985))從抗原或等位基因的頻率計算每一種HLA等位基因的基因頻率(Imanishi等，第11屆國際組織相容性專題討論會論文匯編，Vol,1,Tokyo,OxfordUniversityPress(1992)；Fernandez-Vina等，人類免疫學33:163(1992))。為獲得總的表型頻率，計算累積基因頻率，用逆公式(af=1-(1-Cgf)2)推算累積抗原頻率。如下所討論的，如果在DNA分型水平沒有頻率數據，就假定對應的血清學鑒定的抗原頻率。為了獲得總的潛在的人群覆蓋度，假定沒有連鎖不平衡并且只包括經鑒定屬于每一種超型的等位基因(最少估計值)。由基因座相互組合取得的總的潛在覆蓋度的估計值，是通過把非A覆蓋人群的比例加到A的覆蓋度，非A覆蓋人群的比例可以認為是B等位基因所覆蓋的部分(如，總數=A+B※(1-A))。A3系超型的確定成員是A3、A11、A31、A※3301和A※6801。雖然A3樣超型可能潛在地包括A32、A66和A※7401，但這些等位基因并不包括在總的頻率計算值中。同樣地，A2樣超型家族的確定成員包括A※0201、A※0202、A※0203、A※0204、A※0205、A※0206、A※6802和A※6901(可能也包括A※3001)。最后，B7樣超型的確定等位基因是B7、B※3501-03、B51、B※5301、B※5401、B※5501-2、B※5601、B※6701和B※7801(可能也包括B※1401、B※3504-06、B※4201和B※5602)。結果不同的HLA等位基因的肽結合口袋的結構分析。如上所述，以前的研究顯示，HLA分子A3、A11和A※6801與第二位帶有小的或疏水的殘基、并在C末端帶正電荷的配體的特異性有關(Kubo等，免疫學雜志152:3913(1994)；Guo等，自然360:364(1994)；Falk等，免疫遺傳學40:238(1994)；Dibrino等免疫學雜志151:5930(1993)；Dibrino等，美國國家科學院院刊90:1508(1993)；Zhang等，美國國家科學院院刊90:2217(1993)；Sette等，分子免疫學31:813(1994))。我們決定更詳細地評價在配體特異性上這些明顯的相似性的結構基礎。為這個目的，由于已知抗原肽在第二位和C末端的殘基側鏈與形成HLAⅠ型分子的B和F口袋的殘基接觸(Madden等，細胞75:693(1993)；Saper等，JMolBiol219:277(1991))，因此列表顯示對于各種HLAⅠ型分子形成這些多形袋口的殘基。發現已知識別第二位上小的或疏水的殘基的HLA型(如，A※0101、A※0201、A※0301、A※1101、A※6801、和A※6802)，和識別配基肽的C末端帶正電荷殘基的HLA型(如，A※0301、A※1101、A※6801、和A※2705)共有某些關鍵的結構特征。尤其是，結合第二位小的和疏水殘基的HLA分子分別在第45位和67位帶有脂肪族殘基(M或V)，在66位和70位分別帶有潛在的氫鍵形成殘基如N和K，或H和Q。所有的分子在99位都帶有Y殘基。相比之下，表現出不同結合特異性的Ⅰ型分子在一個或多個位置不同。同樣，只有優選的C末端帶正電荷的Ⅰ型分子在77、80、81和116位分別帶有D、T、L和D。總而言之，這種分析顯示一類HLAⅠ型分子(A3、A11和A※6801)在其B和F口袋共有某些關鍵的結構特征，以及一個常見的肽配體基元，其特征在于第二位的小的或疏水的殘基和C末端帶正電荷的殘基。在這一點上，我們暫時把這些HLAⅠ型分子稱為A3樣超型的一部分，相應的基元稱為A3樣超基元。對其它基元不清楚的Ⅰ型分子的分析顯示，A※3101、A※3301、A※3401、A※6601和A※7401在B和F口袋也共有這些同樣的共有序列。因此預測這些分子是A3樣超型的一部分。最近的結果(Falk等，免疫遺傳學40:238(1994))獨立地證實A31和A33的確有A3樣肽基元的特征。表現重疊初級錨定特異性和肽結合全部特性的A3樣分子。為了比較被某些最常見的A3樣分子(A3、A11、A31、A※3301和A※6801)識別的基元的范圍，對這些分子的主要錨定(第二位和C末端)結合特異性進行了更詳細的分子分析。以前已經介紹了測定非標記合成肽對放射標記探針肽結合到親和純化的HLAⅠ型分子的抑制能力的A3和A11特異的肽結合檢測法(Kubo等，免疫學雜志152:3913(1994)；Kast等，免疫學雜志152:3904(1994)；Sette等，分子免疫學31:813(1994))。用類似的方法建立了對A31、A※3301和A※6801特異的結合檢測法(Kubo等，免疫學雜志152:3913(1994)；Kast等，免疫學雜志152:3904(1994)；delGuercio等，.免疫學雜志154:685(1995)；Sidney等，免疫學雜志154:247(1995)；Sette等，分子免疫學31:813(1994)；Ruppert等，細胞74:929(1993))。然后，通過檢測一個原型多聚A肽AXAAAAAAX的第2位或第9位被置換的一組肽對A3、A11、A31、A※3301和A※6801的抑制能力，考察A3樣分子的初級錨定特異性。每一個分子顯示偏愛各自特定的殘基，但在大多數所考慮的例子中，第2位被A、I、L、M、S、T或V占據和C末端被R或K占據時，獲得顯著的結合。這些結果與由我們(Kubo等，免疫學雜志152:3913(1994))和其它人(Falk等，免疫遺傳學40:238(1994)；Dibrino等免疫學雜志151:5930(1993)；Dibrino等，美國國家科學院院刊90:1508(1993))得出的集中測序結果完全相符，并且在A31、A※3301和A※6801的初級錨定基元的確定中也相符。總而言之，這些結果顯示，A3樣初級錨定基元可定義為第2位的A、I、L、M、S、T或V和C末端的R或K。A3樣分子共有重疊的肽結合全部特征。下一步檢查A3樣超型初級錨定基元使A3樣超型分子之間的結合減弱的程度。收集了一組200個，第2位帶有A、I、L、M、S、T或V和C末端帶有R或K的，天然存在的9聚體肽序列。與限制每一種可能的錨定組合以單個氨基酸的天然頻率的比例出現不同，含有此組合的肽是從病毒和腫瘤抗原序列中隨機選擇。當檢測每種肽結合純化的A3、A11、A31、A※3301和A※6801分子的能力時，顯然，獨特的結合模式與每一種等位基因型相關(結果未列出)。例如，有些肽更選擇性地只結合一種Ⅰ型分子，而另一些肽則更廣泛的交叉結合4種或5種被試分子。我們發現，一般大約10％(5％-16％)的肽-HLA組合與良好結合(IC50≤50nM)到任何給定的等位基因相關，大約17％(11％-24％)與中等結合(IC5050-500nM)到任何給定的等位基因相關。高結合和中等結合的頻率與以前提到的含A※0201集中測序基元的肽的頻率相當(Ruppert等，細胞74:929(1993))。然而，最值得注意的是觀察到相對高的交叉反應性。在能夠結合最少一種A3樣分子的127種肽中，有43種(34％)結合3種或更多個A3樣超型分子。4種肽結合所有5個被測試的A3樣分子。比較起來，在被測試的結合5個無關的Ⅰ型分子(A※0101、A3、A24和B7)的39種肽中，只有3種(8％)結合兩個分子，沒有一種結合3個或更多的分子。5種測試的A3樣分子中的至少4種被鑒定為高或中等結合物的肽，見表2。在此表中，好或中等結合能力是指IC50≤500nM，并用陰影加以突出。綜合在一起，這些結果證實，在A3樣超型分子的結合全部特征上有顯著的重疊，而且證實了A3樣超型的初級錨定基元。A3樣超型確定對潛在的肽配體提供簡并性的次級錨定殘基。如上所述，雖然A3樣超型分子的結合全部特征上的重疊是顯著的，但也遠不是完全的；每一種A3樣分子保留相當程度的特異性。為了了解所觀察到的交叉反應性的基礎，我們試圖限定一個A3樣超基元，此基元能描繪與A3樣超型簡并性有關的肽配體的特征，并在預測A3樣簡并的結合物時是有用的。首先，這里分析的概括了次級錨定結合特異性的每一種A3樣等位基因的精確的基元(A3、A11、A31、A※3301和A※6801)，象在材料與方法中介紹的那樣得到。方法與以前用于確定一個精確的A※0201基元的方法(Ruppert等，細胞74:929(1993))類似。通過計算帶有20種常見氨基酸的每一種的肽序列上每一個非錨定位置的平均相對結合能力而得到這些基元，按照單個的化學相似性分組。用這種方法產生的結果的代表、A3的計算值見表3A。接著，正如一個例子，檢測在其序列的第3位帶有一個芳香族殘基(F、W、Y)的21種不同的肽。這些肽對A3的平均相對結合能力，是200個肽的總的平均值的31.7倍。與以前在A※0201介紹的相類似，優選的和有害的殘基是指平均結合能力比總的平均值分別高4倍或低4倍的殘基。因此，在第3位的芳香族殘基被認為是對A3結合“優選的”殘基。表2．A3樣超基元交叉反應性肽表3由相對結合值確定的等位基因特異性次級錨定優先位點對每一種等位基因(A3、A11、A31、A※3301)進行類似的分析，并用來得出每一位置上等位基因特異的次級錨定所需圖(表3B-E)。檢測的A3樣超型的每種等位基因所獲得的修飾的基元總結于圖1。每種分子表現出各自獨特的次級錨定需要。例如，在第4位帶正電荷殘基(R、H、K)的被A3優選，而不被任何其它A3樣分子優選。同樣，在第8位，甘氨酸(G)與A11的低結合能力有關，而負電荷殘基(D、E)只對A31有害。除了這些類型的獨特的等位基因特異的特性外，某些殘基與大多數的A3超型分子的低結合力或高結合力有關。例如，第1位的脯氨酸(P)對所有被檢測的5種A3樣分子都是有害的。第7位的芳香族殘基(F、W、Y)和第8位的脯氨酸被5種被檢測分子中的4種優選(圖1)。基于這些不同的單個精確的基元，構建了A3樣超基元。對所考慮的5種等位基因的至少3種是有害的殘基，確定為在超基元上有害的殘基。相反，被所考慮的5種等位基因的至少3種優選，但對任何等位基因無害的殘基，確定為優選殘基。按這種方法得到的A3樣超基元見圖2。預測高交叉反應性肽的A3超基元功效的實驗。為了檢測以上確定的A3樣超基元的正確性，檢測了以前未用于分析超基元的另外一組108個肽對A3、A11、A31、A※3301和A※6801的結合。這組肽包括至少有一個優選的超基元殘基而沒有有害的殘基(超基元陽性)的30個肽，至少有一個有害殘基的43個肽(超基元陰性)，和既沒有優選的也沒有有害的殘基的35個肽(超基元中性)。在30個超基元陽性的肽中，27個(90％)結合到2個或更多的A3樣分子上，16個(53％)結合到3個或更多的分子上。相比之下，35個超基元中性的肽中的18個(51％)結合2個或更多A3型，8個(23％)結合3個或更多的分子。最后，超基元陰性的肽結合多個等位基因的能力低很多，6個肽(14％)結合2個A3樣分子，沒有肽結合3個或更多的分子。這些結果與原來那組用來確定超基元的肽用同一類型的分析得到的結果性質相似，而與以前提到的對照肽結合無關的HLA等位基因所觀察到的交叉反應性水平形成鮮明的對照。在以前的實驗中，只有少數幾個肽(8％)結合到一個等位基因上，而不是原始的限制元件上。從用于證實A3樣超基元的那組肽中，證實了10個另外的肽以高或中等親和力結合5個被試A3樣分子中的至少4個(表2B)。在所有主要人種群中保守的HLA超型的高表型頻率。為了評價HLA超型大體上的潛在關聯，特別是A3樣超型的潛在關聯，檢測了各種HLAⅠ型等位基因或抗原的發生率。到目前為止，現有的大多數HLA-A和B的數據是根據血清學分型得到的。這些數據在DNA序列確定的等位基因水平沒有分辨率，因此不能區分亞型。然而，通過肽結合的研究(delGuercio等，免疫學雜志154:685(1995)；Tanigaki等，人類免疫學39:155(1994))，或集中測序分析(Fleischer等，組織抗原44:311(1994)；Rotzschke等，Eur免疫學雜志22:2453(1992))，或基于一級序列的口袋結構的分析，比較亞型的肽結合特異性顯示，大多數例子的亞型有非常相似的，即使不完全一致的，肽的主要錨定特異性。因此在以下的分析中，如果沒有DNA亞型水平的群體數據，但結合的數據、發表的基元或序列分析認為亞型有重疊的肽結合特異性，就可以假定在亞型等位基因和血清學確定的抗原之間有一對一的相關。檢測不同的人種背景中各種A3樣等位基因的發生率時，很明顯每一種單個的等位基因或抗原的頻率在人種群之間變化很大(Imanishi等，第11屆國際組織相容性專題討論會論文匯編，Vol.1,Tokyo,OxfordUniversityPress(1992)),5種A3樣等位基因的累積頻率是非常恒定的(在37％至53％之間)。例如，A3在高加索人、北美黑人和西班牙人中常見，但在日本人中幾乎沒有。相反，A31在日本人中常見而在高加索人和北美黑人中很少見。相比之下，在5種被檢測的人群中的每一種中，A3樣超型在至少37％、高的達53％的個體中存在。在本文中也有興趣指出A3樣超型的存在不是一個孤立的事情，因為最近我們已經報道了A2樣(delGuercio等，免疫學雜志154:685(1995))和B7樣(Sidney等，免疫學雜志154:247(1995))超型的存在。每種這些另外的超型也是非常突出的，在不同人種背景中以十分恒定的累積頻率(在40％至60％之間)存在。事實上，能夠容易地在基因水平計算出，現存的HLA-A或B基因總拷貝的至少一半，似乎屬于這3種HLA超型中的一種或另一種。討論這里發表的結果證實來自至少5種不同的HLA等位基因(A3、A11、A31、A※3301和A※6801)，和依據口袋結果分析預示的可能的至少3種其它的等位基因(A※3401、A※6601和A※7401)產物，可以歸類為一個功能性A3樣超型。這個確定是基于許多觀察作出的。作為一個組，這些分子(a)在它們的肽結合區內共有一定的關鍵結構特征，(b)它們偏愛類似的初級錨定，(c)共有大部分重疊的結合性能。通過檢查這些等位基因分子優選的、大量的帶錨定殘基的肽的結合活性，也確定了A3樣超基元。這種超基元，是基于每一種A3樣超型分子的次級錨定需要的詳細圖得到的，可以有效地預測A3樣簡并的結合肽。最后，A3樣超型，和通用的超型，在所有主要人種群中以非常高的表型頻率出現。照此，基于肽結合特異性的HLAⅠ型超型，代表了解HLAⅠ型分子之間相互關系的血清學和系譜分類的一種功能性的替代。除了用于A3樣超基元的產生外，本研究公開的單個次級錨定圖本身對了解肽結合到Ⅰ型分子上有顯著作用。由于這些圖是用大小均一的肽得到的，因此在每個次級位置上的優選決定基可能比天然加工肽的集中測序得到的更加準確。這里確定的基元也可以確定對肽結合起有害作用的殘基。Barber和他的同事(Barber等，當代生物學5:179(1995))已經證實，肽可以被我們歸于HLA-B7樣超型中的兩個分子識別，兩個其它的肽被一個以上的A3樣等位基因識別(Missale等，實驗醫學雜志177:751(1993)；Koenig等，免疫學雜志145:127(1990)；Culmann等，免疫學雜志146:1560(1991))(見表4)。使用一種體內誘導初級CTLs的方法(Wentworth等，分子免疫學32:603(1995))，我們觀察到能夠被A3和A11識別的肽的幾個例子。我們檢測了A3樣超型限制性表位對A3樣超型分子的結合能力，并注意到相對高水平的簡并性。在表4所列的7個表位中，只有一個是九堿基順序，能夠分析在圖2A中提出的超基元(將來的研究目標是把超基元擴展到長于9個殘基的肽)。這個肽是超基元陽性的，并結合5個A3樣分子中的3個。然而，每種表位與A3樣超型的初級錨定特異性相符是重要的。比較我們基于肽結合而提出的超型的分類與基于DNA序列(和血清學反應性)的HLA-A等位基因的分類的關系(Ishikawa等，人類免疫學39:220(1994)；Firgaira.等，免疫遺傳學40:445(1994)；Karo等，免疫學雜志143:3371(1989))揭示了相似和差異。例如，HLA-A3和A11似乎關系密切，而且來自一個共同的祖先基因(48-50)。然而，A31和A33來自含有A2/A10/A19組的古老譜系，這個譜系與A3和A11的譜系不同。最后，HLA-A※6901屬于A28HLA進化組(Fernandez-Vina等，人類免疫學33:163(1992)；Ishikawa等，人類免疫學39:220(1994)；Lawlor等，免疫學年評8:23(1190))，也含有HLA-A※6802和-A※6901等位基因。然而，基于它們的肽結合特異性，HLAA※6801是A3樣超型的一員，而A※6802和A※6901已證實屬于A2樣超型(delGuercio等，免疫學雜志154:685(1995))。因此，基于現有的HLA等位基因的表型樹(Ishikawa等，人類免疫學39:220(1994)；Firgaira.等，免疫遺傳學40:445(1994)；Karo等，免疫學雜志143:3371(1989))，在兩種古代HLA譜系中發現A3樣等位基因:含有A3和A11的A1/A9，和含有A31、A33和A※6801的A2/A10/A19。如果HLA-A3樣超型的存在是共同祖先的反映，那么A3樣基元事實上代表原始人HLAⅠ型肽結合特異性，其它的特異性代表對變化的致病環境的適應。表4A3樣限制肽的結合b良好結合能力是指＜500nM，以陰影突出。然而，這些觀察也激起引起興趣的可能性，即可能在群體水平，存在一個維持各種HLAⅠ型超型等位基因的高頻率的選擇優勢，這種選擇優勢由共同的祖先或趨同進化產生。這種優勢可能與群體水平有效肽結合特性的產生相關。這種觀察明顯來自這個事實，即來自同一個系統發育家族的不同分子可能屬于不同的結合超型家族。也有可能這些現象部分地與人轉運相關抗原加工分子(TAP)的肽特異性的最佳利用有關(Androlewicz等，美國國家科學院院刊90:9130(1993)；Androlewicz等，免疫1:7(1994)；vanEndert等，免疫1:491(1994)；Heemels等，免疫1:775(1994)；Momburg等，當代免疫學視點6:32(1994)；Neefjes等，科學261:769(1993))，這些TAP分子優先轉運帶有一定序列特征的肽，如疏水的、芳香族的、或C端帶正電荷的。最近由vanEndert和他的同事與我們合作進行的研究，評價了大量肽的TAP相對親和力，并且介紹了擴展的TAP結合基元。令人驚奇的是，這個基元含有許多與A3樣超基元相關的結構特征，如在9聚體肽的第3位和第7位優選芳香族殘基，而且在第1位和第3位沒有負電荷殘基，在第1位沒有P。基于這里提供的實驗證據，似乎除了基于血清學或系統發育關系的分類外，HLAⅠ型等位基因也可以根據它們配體的特異性歸類到超型。最近已鑒定了3個超型A2樣、A3樣和B7樣，其它的，如B44樣超型已在文獻中提出(Fleischer等，組織抗原44:311(1994)；Harris等，免疫學雜志151:5966(1993)；Thorpe等，免疫遺傳學40:303(1994)；Falk等，免疫遺傳學41:162(1994)；Falk等，免疫遺傳學41:165(1994))。雖然尚不知道還有多少超型將被鑒定，也不知道它們包括哪些種類，但現有的結果證實肽結合特異性簡并的現象，以前認為是限制于Ⅱ型HLA(Panina-Bordignon等，Eur免疫學雜志19:2237(1989)；O’Sullivan等，免疫學雜志145:1799(1990)；Busch等，國際免疫學2:443(1990))，也是肽結合到Ⅰ型HLA的特征。不管Ⅰ型超型出現的原因是什么，都應該強調它們潛在的實際的關聯。定量結合檢測法的可行性和詳細的超基元可以鑒定高交叉反應的肽。接著這個可以用幾種混合的CTL表位廣泛地覆蓋，也可能對潛在地使用以肽為基礎的方法發展疫苗有重大的意義(Vitiello等，JClinInvest95:341(1995))。實例2B7樣超型結合以前的工作(Sidney等，免疫學雜志.，154,247-159(1995)；Hill等，自然360:434-439(1992)；Falk等，免疫遺傳學38:161-162(1993b)；Barber等，當代生物學5:179(1995)；Schonbach等，免疫學雜志.，154:5951-5958(1995))顯示，統稱為B7樣超型的HLAB特異性的較大家族，以常見的肽結合基元為特征(第2位的P、C末端的疏水殘基或芳香族殘基)。在這個例子中，用以上介紹的分子結合檢測法詳細檢測5種最常見的B7樣等位基因(B※0702、B※3501、B51、B※5301和B※5401)初級錨定(第2位和C末端)的特異性。為完成這個，我們合成并檢測了一系列FHVnef84-92肽(序列FPVRPQVPL)的單個置換類似物的結合。HIVnef84-92以高(IC50≤50nM)或中等(IC5050-500nM)親和力結合B※0702、B※3501、B51、B※5301和B※5401。發現B7樣超型分子有共同的而更嚴格的第2位特異性。對于所有的5個等位基因，脯氨酸都是優選的殘基。除了一個例外(在B※3501中的A)，所有被檢測的第2位置換物比在C末端帶脯氨酸錨定的親本肽的結合親和力降低10倍以上。相比之下，當分析結合特異性時，每一種HLA-B型在C末端表現出完全不同的特異性模式。例如，B※0702優選M、F和L，而B※5101優選L、I和V。除了這些差異以外，所有的C末端特異性模式呈現很大程度的重疊。脂肪族殘基I和V至少被5種分子中的4種優選，A、L、M、F和W在大多數例子中優選或耐受。其它殘基，如Y或T，只被個別的例子耐受，有些(如K或D)根本不被耐受。這些關于初級錨定特異性的結果與Sidney等，免疫學雜志，154,247-259(1995)公開的結果完全相符。能夠簡并B7樣超型結合的肽，在第2位帶有脯氨酸，在C末端帶有疏水或芳香族殘基(V、I、L、M、F、W、A)。在正式確定B7樣超型初級錨定基元時，我們也保守地包括Y，盡管它相對缺乏簡并性，因為Y在集中測序分析時構成B※3501的優勢信號(Hill等，自然360,434-439(1992)；Falk等，免疫遺傳學38.161-162(1993b)；Schonbach等，免疫學雜志154:5951-5958(1995))。總而言之，B7樣超型的初級錨定基元確定為第2位的P，和C末端的A、I、L、M、V、F、W和Y。B7樣超型配體的優選大小Ⅰ型分子通常優選長度為8至10個殘基的肽(Falk等，自然351，290-296(1991))，雖然更長的肽也表現結合(Massale等，實驗醫學雜志177:751(1993)；Chen等，免疫學雜志.152:2874(1994)；Collins等，自然371-626(1994))。為了確定對B7樣超型最佳的肽長度，合成了幾組8-、9-、10-和11-殘基的肽，它們代表了天然存在的病毒、腫瘤或細菌序列，并且每種都帶有上述的B7樣超型初級錨定特異性，對它們的B7樣每個類型6種結合能力進行了分析。結論是9殘基代表所有被檢測的B7樣分子的最佳肽長度。這個評估在任何分子結合每種大小的肽的百分率方面，和在觀察到的交叉反應程度方面都是真實的(結果未列出)。B7樣等位基因的次級錨定基元和B7樣超基元其它的殘基可以作為次級錨定，因此對肽提供補充的結合能量(Ruppert等，細胞74:929-937(1993)；Madden等，細胞75,693-708(1993)；Saito等，生物與化學雜志268,21309(1993)；Sidney等，人類免疫學45,79-93(1996)；Kondo等，免疫學雜志155:4307-4312(1995)；Parker等，免疫學雜志152,163-175(1994))。也已經證實，一些殘基可能對肽結合到Ⅰ型分子有負作用(Ruppert等，細胞74:929-937(1993)；Sidney等，人類免疫學45,79-93(1996)；Kondo等，免疫學雜志155:4307-4312(1995)；Boehncke等，免疫學雜志150，331-341(1993))。為了建立能有效地選擇有簡并B7樣結合能力的肽的B7樣超基元，我們用這里介紹的方法，試圖確定參與肽結合到B7樣分子的次級錨定和次級作用。確定了5種最常見的B7樣分子，B※0702、B※3501、B51、B※5301和B※5401的結合能力，這5種分子包含199個9聚體肽，代表含有B7樣超型初級錨定(第2位的脯氨酸、C末端的A、V、I、L、M、F和W)的天然存在的病毒序列；并分析了結果。計算了帶有20種氨基酸中每一種的肽的每一位置的平均相對結合能力(ARBC)，并與完整的肽的ARBC進行比較。因為一些氨基酸很少出現，因此，按照以前介紹的(Ruppert等，細胞74:929-937(1993))按單個化學相似性對殘基分組。這個分析對B※0702、B※3501、B51、B※5301和B※5401分別進行。發現優選的和排斥的模式，對于次級錨定而言，每個分子表現的相當不一致。例如，在實驗組中，18個肽在第1位有正電荷殘基(R、H或K)。這些肽作為一組，是很好的B※0702結合物，ARBC為21。然而，對于B51，同樣的肽是相對弱的結合物，ARBC為0.25。然而也可以注意到優選的很大的相似性。例如，在第1位帶有芳香族殘基(F、W和Y)的肽作為一組，是B7樣超型分子組的良好結合物，對B※0702、B※3501、B51、B※5301和B※5401，ARBC分別為4.2、17、16、20和70。以上討論的數值，接著用來獲得每個位置等位基因特異的次級錨定所需條件的圖譜。為完成這個，優選的和有害的殘基定義為ARBCs比總的平均值分別高3倍或低3倍的殘基。這些優選的和有害的作用總結于圖3。次級錨定圖更清楚的揭示，盡管每個分子表現自己獨特的次級錨定需要，但一些特征在B7樣分子之間高度保守。例如，如上所示，在第1位的芳香族殘基(F、W和Y)被所有5種B7樣分子優選。相反，第8位的酸性殘基(D、E)與所有5種分子的弱結合能力相關。被所考慮的5種等位基因中3種或更多優選，但對任何分子無害的次級效應，或另一方面，對5種分子中的3種或更多種有害的次級效應稱為共有的效應。然后這些共有的特征，整合到擴展的B7樣超基元限定的，與大多數B7樣超型分子弱或好結合相關的殘基中。按照這個邏輯，預計帶有優選的次級殘基超基元的肽，將比不帶優選殘基或帶有害殘基的肽表現出更大程度的B7樣超型簡并性。通過確定一組獨立的帶有B7樣初級錨定特異性的肽的結合交叉反應性而檢測這種假設。正如預計的，超基元陽性的肽(即，至少一個超基元帶優選的次級殘基，并沒有有害殘基的肽)，比超基元陰性的肽(一個或更多的超基元有有害的殘基)在B7樣超型內表現出明顯更大程度的交叉反應性(結果未列出)。提高結合能力的超基元的完成正如這里證實的，HLA超基元在預測高度簡并的肽可能是有價值的。然而，最有趣的是，HLA超基元的確定，應該也能夠通過鑒定肽序列內哪些殘基可能被歸類或“固定”，而設計高度交叉反應的表位，并在一個超型內使肽有更大的簡并性。為評估這種可能性，選擇了在B7樣超型內顯示高度簡并性的6個肽(表5)。每一種肽以高(IC50＜50rtM)或中等(IC5050-500nM)親和力結合5種最常見的B7樣分子中的至少3種。這些肽在以上介紹的B7樣超基元和等位基因特異的次級錨定基元的范圍內進行了分析，以確定在其序列內的特定的殘基是否能被“固定”，而進一步加強它們結合到B7樣超型分子上。這個評估發現所考慮的特定的肽中，沒有一個含有超基元陰性殘基。3種肽(HCV核心168、MAGE2170和MAGE3196)每種帶有一個對單個B7樣分子有害的殘基(表5)。下一步，合成一組單個置換的類似物。某些含有次級錨定置換的類似物根據這里公開的數值選擇，這些置換為超基元陽性，或在特定的等位基因是陽性，對任何其它置換無害。因為C末端初級錨定的優選對每種等位是獨特的，因此也考慮在這個位置的置換。因此，例如為了檢測是否能夠增加簡并性，用超基元陽性F置換第1位的天然殘基制備許多類似物。其它的置換，如HBVpol541C末端的L置換Y，用以說明親本肽對B※0702和B※5401的弱結合。當檢測這組肽與B7樣超型分子的結合能力時，產生表5所示的結果。在每種情況下，第1位被F置換時，表現出比親本序列增強的結合和/或簡并性。例如，MAGE2170以高的親和力結合到B※0702上，以中等親和力結合到B※3501、B51和B※5301上，但以弱親和力結合到B※5401上。此肽的F1類似物以高親和力結合所有5種分子。針對特異分子的置換的成功很難加以概括。例如，HBVpol541C末端L置換天然的Y在結合到B※0702上是成功的，同時增加結合到其它分子上的親和力(在B51和B※5401最顯著)。在另一些例子中，觀察的效果不象預期的那樣，正如在HBVenv313證實的那樣。此肽以高親和力結合到B※0702、B※3501、B51和B※5301上，但只很弱地結合到B※5401上。基于這個觀察，即第5位的脂肪族殘基(L、I、V和M)對B※5401是陽性的，而對其它分子是相對中性的，因此制備第5位是M的類似物以提高B※5401的結合。然而，正如表5所示，用M5類似物獲得的顯著提高的B※5401的結合能力是以降低對B※0702、B51和B※5301的結合為代價的。雖然單個類似物的成功是可變的，但值得注意的是，對于每一種情況，至少一種類似物能夠提高結合親和力，或擴展親本肽的簡并性。因此，已經簡并的肽能夠被獨立地“固定”以提高其結合能力并擴展其簡并性。表5獨立的置換提高肽配體的B7樣超型結合能力和簡并性總之，根據這里顯示的結果，很明顯更高親和力的結合肽可以通過用中性或優選的殘基置換序列中的“陰性”或中性的殘基而產生。這些肽也可能具有獨特的免疫學特性，即盡管與野生型序列仍然有交叉反應，但不會發生耐受、刪除或抑制機制，不會滅活對野生型序列有反應的CTL，并由于癌癥的慢性感染而呈遞。同樣的技能可以用來產生有更高程度交叉反應性，因此更有利群體覆蓋的肽。實例3A2樣超型結合我們也進一步獲得了關于A2.1結合的結構要求的信息。為完成這個，我們試圖確定第2位和第9位錨定的可行程度。為了這個目的，合成了一組在第2位或第9位帶單個置換的多聚(A)9聚體模型肽的類似物，此模型肽含有以前報道的(Ruppert等，細胞74:929-937(1993))在第2位是L、第9位是V的A2.1基元，并測定了結合能力。合成了第2位和第9位錨定的一共13個不同的類似物。與以前報道的A2.1基元十分相符，在第2位帶有L或甲硫氨酸(M)的肽是最好的結合物。即使用相對保守的置換，如異亮氨酸(Ⅰ)、V、丙氨酸(A)和蘇氨酸(T)也引起結合能力的顯著降低(10至100倍)。更加根本的改變(即D、K、F、C、P、G、N和S殘基)會完全消除結合能力。在第9位得到相似的結果，在此位置上只有保守的置換，如L和I，在10倍以內結合未置換的模型多聚AA2.1肽結合物。帶有A或M置換的類似物也結合，但強度較低(降低10-至100-倍)。最后，所有其它被測置換(T、C、N、F、S、G、P和R)與A2.1結合能力的完全喪失相關。因此，基于這些結果并與以前的研究(19-20)十分相符，“典型的”A2.1基元可以被鑒定為在第2位是L或M，第9位是L、V或I。從這些結果我們推測，任何在第2位或第9位(或第10位)帶有“非典型的”(但仍能接受的)殘基的肽(例如第2位是I、V、A或T，第9或10位是A、M或T)的A2結合能力，可以通過用更“典型的”錨定取代而提高。下面舉出一些例子說明實際上這是怎樣完成的。例如，序列為LWVTVYYGV的FHVEnv2181肽以12500nM的IC50％結合A2.1，而第2位的錨定被置換的類似物LMVTVYYGV以3.3nM的IC50％結合。天然存在序列FLPSDFFPSI的HBVc以22nM的IC50％結合A2.1，但其C末端錨定被置換的V10變型以2.5nM的Kd結合A2.1。最后，HBVpol538肽(YMDDVVLGA)以200nM的IC50％結合A2.1，而V9變型以5.1nM的IC50％結合。其它固定的錨定肽的例子見表6。檢測了某些固定肽誘導CTL反應的能力。例如，用初級CTL檢測法(21)檢測了HIVEnv2181肽和HBVpol721肽，發現是陽性。陽性CTL識別結果也見于HBVc18-27和HBVpol538肽。進一步的實驗揭示了非錨定殘基在確定結合能力方面的突出作用。這些分析的結果也在Ruppert等(同上)中有介紹。按照我們的分析，一個給定的氨基酸組別在A2.1結合物上的頻率被非結合物的頻率相除得到頻率比率。這個比率說明一個給定的殘基組別是否優先存在于結合物(比率＞1)或非結合物(比率＜1)的給定的位置上。為了便于分析，設定了比率的臨界水平，使在結合物上的頻率比非結合物上高4倍以上的殘基視為是有利的或優選的殘基，而在結合物的頻率比非結合物上低4倍以上的殘基視為是不利的或有害的殘基。按照這個方法，鑒定了與A2.1結合能力或結合缺失有顯著關系的殘基組別。通常，最不利的作用見于帶電氨基酸。在第1位，P和酸性殘基(E和D)在A2.1結合肽上不常見。在第6位非結合肽是堿性(R、H或K)殘基，而酸性和堿性殘基在好的結合物的第3位和第7位不常見。相反，第1、3和5位的芳香族殘基與高親和力結合相關。而且帶有側鏈的OH-或SH-殘基，如S、T或C偏愛第4位，而A偏愛第7位，P偏愛第8位。總之，不同氨基酸組別的頻率分析使我們能夠更準確地確定A2.1基元，這個基元考慮了第2和第9錨定位置之外的其它位置對A2.1結合親和力的影響。10聚體A2.1配體的分析以上介紹的用于9聚體肽的同樣的方法也用于分析由一組10聚體肽獲得的結果。在10聚體肽的N-和C-末端，觀察到的模式與9聚體肽觀察到的十分相似。例如，象在9聚體肽中的一樣，在10聚體肽組中，第1位的特征是，在結合物組中芳香族殘基的頻率升高，而負電荷殘基和P同樣與弱結合相關。在第3位，也是負電荷與弱結合相關。有趣的是在這個位置上，脂肪族(不是芳香族)殘基與高親和力結合相關。在此肽的C末端也觀察到一定的相似性。在10聚體肽中，倒數第二位即第9位(與9聚體肽的第8位對應)是相當隨意的，只有堿性殘基在非結合物上出現頻率較高。與9聚體肽的第7位的情況相似，10聚體的倒數第3位，即第8位既不容忍正電荷殘基也不容忍負電荷殘基。同樣，在10聚體的第7位不喜歡正電荷殘基，這與以前觀察的9聚體的第6位一樣。與第3位觀察到的相比，與高結合相關的殘基是不同的。芳香族和疏水性殘基在高親和力結合物的第8位常見(這與9聚體上第7位只有A常見不同)。最后，在肽的中間觀察到一個明顯有特色的模式。在第4位，G被高結合物偏愛，而A和正電荷殘基非常常見于非結合物。在A2.1結合物的第5位完全沒有P。值得注意的是在10聚體肽的第4和5位觀察到的趨勢，沒有一個與9聚體肽的第4或5位相對應。概括地說，按照以上在9聚體肽中介紹的相似的策略，可以產生A2.110聚體肽的詳細的基元。比較9聚體肽和10聚體肽的非錨定位置，可以發現重要的差別和顯著的相似性。總之，根據這里顯示的結果，很明顯更高親和力的結合肽可以通過用中性或優選的殘基置換序列中的“陰性”或中性的殘基而產生。這些肽也可能具有獨特的免疫學特性，即盡管與野生型序列仍然有交叉反應，但不會發生耐受、刪除或抑制機制，不會滅活對野生型序列有反應的CTL，并且由于癌癥的慢性感染而呈遞。肽抗原結合到多個HLA等位基因上以確定A2樣超型。已經建立了用放射標記的肽和表達HLAⅠ型的哺乳動物細胞，如EBV轉化的B細胞系和PHA活化的母細胞的直接MHC結合檢測法。如果靶細胞在有β2微球蛋白存在時26℃預孵過夜，可以獲得放射標記探針的顯著結合。在這些條件下，每個細胞類型表達的HLA分子的小部分都可以被標記的肽結合。用這些檢測法可以檢測A※0201限制的乙型肝炎病毒核心18-27肽與其它A2亞型的交叉反應程度。已經確定此肽表位也結合A※0202、A※0205和A※0206但不結合A※0207亞型。用數組合成的肽類似物進行的抑制實驗強調了HLA-A※0201、A※0202和A※0205等位基因的類似配體特異性。有助于形成不同HLA等位基因的B和F口袋的多形殘基的分析可以預測乙型肝炎病毒核心18-27表位與2個其它的HLA等位基因的結合(HLA-A※6802和A※6901)。因此，統稱為A2超型的至少6個不同的HLA-A分子組成的一個家族，似乎共有重疊的配體特異性(在第2位和C末端的脂肪族殘基)。這些結果顯示廣泛交叉反應的肽表位可以被鑒定，并可以極大地提高肽基接種方法的預期可行性。而且，這些結果顯示置換的類似物的另外的用途。特別是同時提高A2超型的數個成員的結合親和力。用HPV16EF.86-93肽、TLGIVCPI及其類似物TLGIVXPI(這里X代表α氨基丁酸)為例，說明了這是怎樣完成的。然后檢測了這兩種肽對A2樣等位基因的結合模式。顯然X置換極大地提高了對所有A2樣等位基因的結合親和力，而得到一個更有用的肽。其特征是比其原來的親本序列有更高的結合能力和更廣泛的交叉反應性。用A2/Kb轉基因小鼠隨后進行的實驗證實，X置換肽誘導的CTL與野生型序列完全交叉反應，而且X肽，由于它的更高的結合親和力，是一個更有效的免疫原。實例4A24和A1結合次級作用和A24結合我們使用一個多聚(A)9聚體模型肽，此肽含有在第2位是Y、第9位是F的A24特異的基元。發現第2位不僅接受Y也接受F、M，可能還接受W。在9或10殘基配體的C末端，F和W是最優選的，但L和Ⅰ也能接受。預計M在這個位置也能接受(Kubo等，免疫學雜志152:3913(1994))。從這些結果，我們得出結論，在第2位或第9位(或第10位)帶有一個非典型的，但仍能被接受的殘基(例如在第2位是F、M、W或第9(或10)位是L、I、M)的任何肽的A24結合力，可以通過用一個更典型的錨定取代這些殘基而提高。Kondo等，免疫學雜志155:4307-4312(1995)介紹了非錨定殘基在決定A24結合能力的突出作用的進一步實驗的結果。收集了所有A24結合的數據庫，并且計算了帶有特定殘基的肽的每個位置的相對平均結合親和力。在9聚體肽的情況下發現，例如在第1位帶G或負電荷殘基(D、E)的肽傾向弱結合，平均親和力比所分析的總共141個9聚體肽的平均親和力低10倍。相比之下，在第1位帶芳香族殘基(F、Y、W)的肽結合良好，平均親和力比總的平均親和力高11.8倍。在第1位帶正電荷殘基(R、K、M)的肽也傾向良好結合，平均親和力比總的平均親和力高4.6倍。也檢測了數個其它位置對A24結合能力的消極的次級作用第3和6位的D或E，第4和7位的G，第6位的正電荷殘基(K、R、H)，第8位的A，第5位的P，和第5和8位的酰胺(Q和N)。相反，發現第7或8位的芳香族殘基(Y、F、W)對A24結合有利，第4位的小的氫鍵殘基如(S、T、C)有積極的作用。顯然，9聚體序列上的每個單個的位置都可能影響A24的結合。還有趣的是疏水殘基(F、W、Y、L、I、V和M)從不與弱結合相關。用10聚體肽獲得的結果也進行了類似的分析。與上一節的結果相似，在10聚體肽中也發現數個次級作用。象9聚體肽的情況那樣，第3和第6位的負電荷殘基(D、E)與弱結合相關。然而，一般來說，10聚體的次級作用圖與9聚體的完全不同。例如，在9聚體肽中，P在任何位置都與顯著提高結合不相關，但在第5位時，與降低結合相關。對于10聚體，P在10聚體肽配體第4、5或7位與提高結合能力相關。在10聚體中，第5位似乎對次級作用最重要，因為Y、F和W(除了已經提到的P)與好的A24結合相關，而R、H和K與弱的結合能力相關。第7和9位存在A和第4和8位存在酰胺(Q、N)也與弱結合能力相關。次級作用和A1結合與以上介紹的對A24類似的分析也應用于HLA-A※0101分子。簡言之，以上的研究已經確定了兩個對HLA-A※0101特異的不同的肽結合基元。獲得了對A※0101亞基元的9聚體和10聚體次級相互作用圖。為得到這個次級相互作用圖，收集了與這兩個基元的每個相對應的肽組有關的A※0101結合數據。對于每個位置，計算了帶每個特定殘基的肽的相對平均結合親和力。為了補償某些特定殘基的低出現率，并獲得更有意義的抽樣，按Ruppert等(同上)的介紹，組合帶有類似化學側鏈的氨基酸。對9聚體肽進行這種分析獲得的，2-9和3-9亞基元的結果分別見圖4a和4b。由這種分析檢測的次級作用的說明圖見圖4c和4d(分別代表2-9和3-9亞基元)。正如上面所介紹的，平均親和力提高或降低4倍以上被斷定為顯著的。一般說來，特定殘基類型的存在會消極地或積極地影響大多數位置的結合能力。例如，在2-9亞基元的情況下，發現在第1位帶有D或E的肽很弱地結合到A※0101分子上，平均相對結合能力(ARBC)為0.20。相反，在同一位置(第1位)帶有芳香族殘基(Y、F或W)的肽，平均親和力比整個肽組的總平均結合能力高4倍(ARBC4-0)。檢查這個圖發現肽結合A※0101的肽的一些有趣的特征。首先，如上面所提到的，在第2和3位上的兩個錨定相互之間起協同作用。在第2位帶有M、S或T錨定的肽的親和力，被第3位存在的D或E顯著提高(第3位是A時提高程度弱一些)。反之，在第3位帶有D或E錨定的肽的親和力，被S、T和M的存在顯著提高(但也可以是其它的疏水或短鏈分子如L、V、I、C和A)。通過檢測其它位置揭示了帶兩個亞基元的肽與同A※0101分子相互作用的差異程度。比較圖4a和4b的數值，清楚地顯示有許多例子在一個基元上起中性作用的殘基，在另一個基元上起積極的或消極的作用。例如，在2-9基元的第1位，G和芳香族殘基(Y、F和W)是優選的(ARBC＞4.0)，A和帶正電荷的殘基(R、H和K)是相對中性的(ARBCs在4.0和0.25之間)，而帶負電荷的殘基(D和E)是有害的(ARBC＜0.25)。在帶3-9亞基元的肽中注意到有一個不同的模式，除了G仍然是優選的外，其它的優選被打亂了。在第1位帶正電荷的殘基對肽結合有顯著的正影響(ARBC為8.3)，帶負電荷的殘基和芳香族殘基是中性的(ARBCs分別為1.3和0.61)，A是有害的(ARBC為0.15)。在基元內的每個位置都觀察到類似的修飾類型。總的說來，次級錨定優選殘基在亞基元之間不同，在圖3的總結圖中可以清楚地看到。在這一節里可以看到，除了第1位的G是共有的優選殘基這個唯一的例外，和第2和3位的協同錨定外，兩個A※01019聚體亞基元的次級基元事實上是完全不同的。因此，定量而言，兩個9聚體基元的27個次級作用中只有一個是共有(3.7％)。與見于A24、A※0201擴展的基元和A3樣分子(20)之間的多種相似性相比，這些A※0101基元差異的程度是顯著的，在那些基元之間，任何兩個擴展的基元之間可見共有3到5(13-26％)個次級作用。10聚體配體次級錨定殘基的確定。與上一節關于9聚體配體的介紹相類似，也確定了2-10和3-10亞基元的次級錨定殘基和次級作用。這些分析的結果見圖5a-d。第2和3位的錨定再一次表現出相互協同作用。在2-10亞基元中，第3位的D、E(A、Q和N的程度低很多)，在3-10亞基元中，第2位的疏水(L、I、V、M)或短鏈(S、T、C)殘基與顯著提高平均結合能力相關。在第2、3位和C末端以外的位置比較兩個10聚體基元顯示，與9聚體中的情況一樣，次級錨定特異性的修飾取決于主要錨定殘基。例如，在第7位，A和S,T和C在2-10基元上優選，而在3-10基元上是中性的。相反，G在3-10基元上優選，而在2-10基元上是中性的。但與9聚體亞基元對比，在10聚體中觀察到的這些差異明顯沒有那么顯著。事實上，兩個10聚體亞基元共有許多優選殘基。第1和5位的Y、F和W，第4位的A，第7位的P，和第8位的G對兩種亞基元都有積極的作用。同樣，第8位的R、H和K對兩種10聚體亞基元都是有害的(圖5c和5d)。總的說來，兩種10聚體基元共有25個次級作用中的6個(24％)。提供以上的例子用來說明本發明，而非限制其范圍。本發明的其它改變對本領域的技術人員是顯而易見的，并包括在所附權利要求中。本文引用的所有出版物、專利和專利申請均引作參考文獻。權利要求1．一種誘導病人對預選的抗原發生細胞毒T細胞反應的方法，此方法包括將細胞毒T細胞與約9至15個殘基的免疫原性肽接觸，這些肽以小于約500nM的解離常數結合至少兩種HLA-A3樣分子，并誘導細胞毒T細胞反應，免疫原性肽具有含有一個結合基元的9殘基序列，從N末端至C末端如下位于第2位的第1個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2個初級錨定殘基，選自R和K；和一個或多個次級錨定殘基，選自第3位的Y、F或W，第6位的Y、F或W，第7位Y、F或W，第8位的P，和任何這些的組合。2．權利要求1的方法，其中肽由9至10個殘基組成。3．權利要求1的方法，其中肽來自病毒抗原、腫瘤相關抗原、寄生蟲抗原，或真菌抗原。4．權利要求1的方法，其中接觸步驟在體外進行。5．權利要求1的方法，其中接觸步驟通過向病人給予包含編碼此免疫原性肽的序列的核酸分子而進行。6．一種誘導病人對預選的抗原發生細胞毒T細胞反應的方法，此方法包括將細胞毒T細胞與約9至15個殘基的免疫原性肽接觸，這些肽以小于約500nM的解離常數結合HLA-A*0301基因產物，并誘導細胞毒T細胞反應，免疫原性肽具有含有一個結合基元的9殘基序列，從N末端至C末端如下位于第2位的第1個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2個初級錨定殘基，選自R和K；和一個或多個次級錨定殘基，選自第1位的R、H或K，第3位的Y、F或W，第4位的P、R、H、K、Y、F或W，第5位的A，第6位的Y、F或W，第8位的P，和任何這些的組合。7．權利要求6的方法，其中肽由9至10個殘基組成。8．權利要求6的方法，其中肽來自病毒抗原、腫瘤相關抗原、寄生蟲抗原，或真菌抗原。9．權利要求6的方法，其中接觸步驟在體外進行。10．權利要求6的方法，其中接觸步驟通過向病人給予包含編碼此免疫原性肽的序列的核酸分子而進行。11．一種誘導病人對預選的抗原發生細胞毒T細胞反應的方法，此方法包括將細胞毒T細胞與約9至15個殘基的免疫原性肽接觸，這些肽以小于約500nM的解離常數結合HLA-A*1101基因產物，并誘導細胞毒T細胞反應，免疫原性肽具有含有一個結合基元的9殘基序列，從N末端至C末端如下位于第2位的第1個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2個初級錨定殘基，選自R和K；一個次級錨定殘基，選自第1位的A，第3位的Y、F或W，第4位的Y、F或W，第5位的A，第6位的Y、F或W，第7位的Y、F或W，第8位的P，和任何這些的組合。12．權利要求11的方法，其中肽由9至10個殘基組成。13．權利要求11的方法，其中肽來自病毒抗原、腫瘤相關抗原、寄生蟲抗原，或真菌抗原。14．權利要求11的方法，其中接觸步驟在體外進行。15．權利要求11的方法，其中接觸步驟通過向病人給予包含編碼此免疫原性肽的序列的核酸分子而進行。16．一種誘導病人對預選的抗原發生細胞毒T細胞反應的方法，此方法包括將細胞毒T細胞與約9至15個殘基的免疫原性肽接觸，這些肽以小于約500nM的解離常數結合HLA-A*3101基因產物，并誘導細胞毒T細胞反應，免疫原性肽含有9到約15個殘基，具有含有一個結合基元的9殘基序列，從N末端至C末端如下位于第2位的第1個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2個初級錨定殘基，選自R和K；一個次級錨定殘基，選自第1位的R、H或K，第3位的Y、F或W，第4位的P，第6位的Y、F或W，第7位的Y、F或W，或第8位的A或P，和任何這些的組合。17．權利要求16的方法，其中肽由9至10個殘基組成。18．權利要求16的方法，其中肽來自病毒抗原、腫瘤相關抗原、寄生蟲抗原，或真菌抗原。19．權利要求16的方法，其中接觸步驟在體外進行。20．權利要求16的方法，其中接觸步驟通過向病人給予包含編碼此免疫原性肽的序列的核酸分子而進行。21．一種誘導病人對預選的抗原發生細胞毒T細胞反應的方法，此方法包括將細胞毒T細胞與約9至15個殘基的免疫原性肽接觸，這些肽以小于約500nM的解離常數結合HLA-A*3301基因產物，并誘導細胞毒T細胞反應，免疫原性肽包括含有一個結合基元的9殘基序列，從N末端至C末端如下位于第2位的第1個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2個初級錨定殘基，選自R和K；一個次級錨定殘基，選自第3位的Y、F或W，第7位的A、Y、F或W，和任何這些的組合。22．權利要求21的方法，其中肽由9至10個殘基組成。23．權利要求21的方法，其中肽來自病毒抗原、腫瘤相關抗原、寄生蟲抗原，或真菌抗原。24．權利要求21的方法，其中接觸步驟在體外進行。25．權利要求21的方法，其中接觸步驟通過向病人給予包含編碼此免疫原性肽的序列的核酸分子而進行。26．一種誘導病人對預選的抗原發生細胞毒T細胞反應的方法，此方法包括將細胞毒T細胞與約9至15個殘基的免疫原性肽接觸，這些肽以小于約500nM的解離常數結合HLA-A*6801基因產物，并誘導細胞毒T細胞反應，免疫原性肽包括含有一個結合基元的9殘基序列，從N末端至C末端如下位于第2位的第1個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2個初級錨定殘基，選自R和K；一個次級錨定殘基，選自第1位的Y、F、W、S、T或C，第5位的Y、F、W、L、I、V或M，第7位的Y、F或W，第8位的P，和任何這些的組合。27．權利要求26的方法，其中肽由9至10個殘基組成。28．權利要求26的方法，其中肽來自病毒抗原、腫瘤相關抗原、寄生蟲抗原，或真菌抗原。29．權利要求26的方法，其中接觸步驟在體外進行。30．權利要求26的方法，其中接觸步驟通過向病人給予包含編碼此免疫原性肽的序列的核酸分子而進行。31．一種包含約9至15個殘基的免疫原性肽的組合物，這些肽以小于約500nM的解離常數結合至少兩個HLA-A3樣分子，并誘導細胞毒T細胞反應，免疫原性肽具有包含一個結合基元的9殘基序列，從N末端到C末端如下位于第2位的第1個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2個初級錨定殘基，選自R和K；一個或多個次級錨定殘基，選自第3位的Y、F或W，第6位的Y、F或W，第7位的Y、F或W，第8位的P，和任何這些的組合。32．一種包含約9至15個殘基的免疫原性肽的組合物，這些肽以小于約500nM的解離常數結合HLA-A※0301基因產物，并誘導細胞毒T細胞反應，免疫原性肽具有包含一個結合基元的9殘基序列，從N末端到C末端如下位于第2位的第1個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2個初級錨定殘基，選自R和K；一個或多個次級錨定殘基，選自第1位的R、H或K，第3位的Y、F或W，第4位的P、R、H、K、Y、F或W，第5位的A，第6位的Y、F或W，第8位的P，和任何這些的組合。33．一種包含約9至15個殘基的免疫原性肽的組合物，這些肽以小于約500nM的解離常數結合HLA-A※1101基因產物，并誘導細胞毒T細胞反應，免疫原性肽具有包含一個結合基元的9殘基序列，從N末端到C末端如下位于第2位的第1個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2個初級錨定殘基，選自R和K；一個次級錨定殘基，選自第1位的A，第3位的Y、F或W，第4位的Y、F或W，第5位的A，第6位的Y、F或W，第7位的Y、F或W，第8位的P，和任何這些的組合。34．一種包含約9至15個殘基的免疫原性肽的組合物，這些肽以小于約500nM的解離常數結合HLA-A※3101基因產物，并誘導細胞毒T細胞反應，免疫原性肽含有9到約15個殘基，具有包含一個結合基元的9殘基序列，從N末端到C末端如下位于第2位的第1個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2個初級錨定殘基，選自R和K；一個次級錨定殘基，選自第1位的R、H或K，第3位的Y、F或W，第4位的P，第6位的Y、F或W，第7位的Y、F或W，第8位的A或P，和任何這些的組合。35．一種包含約9至15個殘基的免疫原性肽的組合物，這些肽以小于約500nM的解離常數結合HLA-A※3301基因產物，并誘導細胞毒T細胞反應，免疫原性肽具有包含一個結合基元的9殘基序列，從N末端到C末端如下位于第2位的第1個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2個初級錨定殘基，選自R和K；一個次級錨定殘基，選自第3位的Y、F或W，第7位的A、Y、F或W和任何這些的組合。36．一種包含約9至15個殘基的免疫原性肽的組合物，這些肽以小于約500nM的解離常數結合HLA-A※6801基因產物，并誘導細胞毒T細胞反應，免疫原性肽包括含有一個結合基元的9殘基序列，從N末端到C末端如下位于第2位的第1個初級錨定殘基，選自A、L、I、V、M、S和T，位于第9位的第2個初級錨定殘基，選自R和K；一個次級錨定殘基，選自第1位的Y、F、W、S、T或C，第5位的Y、F、W、L、I、V或M，第7位的Y、F或W，第8位的P，和任何這些的組合。37．一種鑒定以小于約500nM的解離常數結合HLA-A3樣分子的免疫原性肽的方法，此方法包括以下步驟篩選抗原蛋白中存在權利要求31、32、33、34、45和36的結合基元的氨基酸序列；在抗原蛋白中選擇有結合基元的一個或多個亞序列；制備包含選定亞序列的約8個和約11個殘基的試驗肽；確定試驗肽結合基因產物的能力；鑒定解離常數小于500nM的肽。全文摘要本發明提供包含HLA－A3超基元的免疫原性肽。此肽可用于治療、診斷或檢測許多病理狀態。文檔編號C07K14/47GK1225590SQ97194430公開日1999年8月11日申請日期1997年3月10日優先權日1996年3月11日發明者A·瑟特,R·W·徹斯特魯特,J·悉尼申請人:埃皮曼尼公司