一種運用花粉管通道轉化技術培育耐鹽水稻的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種培育耐鹽水稻的方法，屬于植物育種技術領域，更具體地說是一 種運用花粉管通道轉化技術培育耐鹽水稻的方法。
【背景技術】
[0002] 土壤的鹽漬化是影響農業與生態環境的一個嚴重問題。我國的耕地總面積19. 5 億畝，其中20%存在著不同程度的鹽漬化和次生鹽漬化，灘涂共計1.4億多畝。此外還有 5. 2億畝內陸鹽堿化土壤，其中鹽堿地1. 5億畝。人們曾試圖通過合理的排灌、淡水洗滌、施 用化學改良劑等方式來改造鹽堿地，但常因耗資巨大，見效少而難以推廣。于是把目光轉 向發掘和培育耐鹽作物方面。國內外在培育耐鹽水稻新品種方面，主要集中在兩個方面：
[0003] -是對地方農家水稻品種進行篩選，馴化成具有經濟價值的耐鹽品種，但由于水 稻品種具有特殊多樣化的生態條件，適應性相對較窄的特點，因此篩選出來的耐鹽資源大 多沒能在實踐中得到有效利用，更沒有進入鹽堿地區進行生產應用，目前，我國沿海灘涂和 鹽堿地主要是中低產田，適合我國種植的耐鹽水稻很少，水稻畝產量只有200公斤左右。
[0004] 二是隨著分子生物學技術的發展，借助生物技術和雜交育種，改造并提高水稻的 耐鹽性，培育耐鹽新品種日益成為熱點。目前已有一些導入單個基因提高植物耐鹽性的報 道，如通過基因工程手段，使植物細胞產生和積累某些低分子有機化合物，如甜菜堿、脯胺 酸、糖醇類等以維持滲透勢平衡和體內水分，能在一定程度上提高植物的耐鹽性，但目前 大多還處于實驗室研宄階段。突出的例子是陳受宜等轉入甜菜堿脫氫酶（BADH)基因的水 稻，經鹽脅迫篩選得到轉化植株在0. 5%NaCl的鹽池中多數生長基本正常，但結實率僅為 10%。目前還沒有得到真正意義上的耐鹽水稻作物，其原因主要是植物的耐鹽機制十分復 雜，是一種數量性狀，受多基因控制，因此轉移單個基因往往只能獲得部分耐鹽性，要獲得 具有經濟價值的耐鹽作物可能需要同時轉移多個基因，而目前在識別和分離耐鹽基因以及 同時操作多個基因方面尚有很大困難。
[0005] 自從上世紀50年代聯合國教科文組織提出耐鹽植物開發研宄的方向以來，鹽土 農業作為一種新興的農業模式正在逐漸興起。2013年4月，國際水稻研宄所稱，通過野生稻 種雜交已經培育出一種新型耐鹽水稻，可以在海水侵蝕的濱海土地種植，但目前仍處于對 品種性能進行改進和評定的階段，若要田間試種至少還需4到5年（參見Salt-tolerant ricebredatPhilippinesinstituteApr16,2013)。日本理化學研宄所嘗試用重離 子培育耐鹽水稻，但目前也還處于實驗室研宄階段。另有報道，泰國國家遺傳工程和生 物技術中心植物細胞技術實驗室的主任ChalermpolKirdmanee2001年在實驗室中發現 了 4株能耐2%NaCl的泰國香水稻，但是一直沒有關于最新進展的后續相關報道（參見 Transcriptionalregulationsofthegenesofstarchmetabolismandphysiological changesinresponsetosaltstressrice(OryzasativaL)seedlings)，2005 年中國 科學院上海生科院植物生理生態所宣布：水稻耐鹽功能基因研究在滬取得重大突破性進 展。該所與美國專家合作，成功克隆了與水稻耐鹽相關的數量性狀基因，但距離實際應用 尚需時曰。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種運用花粉管通道轉化技術培育耐鹽水稻的方法，該方法 中運用花粉管通道技術將鹽生植物的總DNA轉移，實現超遠緣遺傳物質的轉移，能同時導 入多個基因，達到耐鹽植物分子育種的目的。
[0007]本發明為一種運用花粉管通道轉化技術培育耐鹽水稻的方法，包括以下步驟：
[0008] (1)提取鹽生植物蘆葦葉片DNA作為供體；
[0009] (2)取水稻9311、鹽559、7海76、7海74作為受體，在盛花期選擇正在開花的稻 穗，去除未開過的穎花和已開過的穎花，每穗只留下當天剛開的穎花約20朵；1. 5?2. 0小 時后剪去小穗內穎，并將1/3?1/2的花柱連同柱頭一起剪去；立即用微量注射器在剛剪去 柱頭的花柱切面上滴注含外源DNA溶液2?3yL;注射時間：水稻開花后1?3小時進行， DNA溶液濃度是250?300yg/ml，導入量是10-20y1，套上雜交袋以防止水份蒸發，25? 30天后收獲％代種子；
[0010] (3)收獲的％代種子全部播種，經觀察，各導入系基本無變異或變異不明顯，分別 全收各株的種子為種子；
[0011] (4)將0:代種子分為兩組，第一組在含鹽分濃度為5%。的塑料盆中進行種子發芽 和育苗，對種子進行耐鹽性篩選，選留健壯幼苗移栽到普通無鹽大田，進行常規栽培，觀察 變異情況，選留生長正常的單株收種；第二組種子則種植于普通水田內發芽和育苗以及全 過程生長，選留變異株，進行單株收種；鹽篩和非鹽篩所選留的各單株收種稱為％代種子；
[0012] (5)將收獲的D2種子再在鹽池鹽度為4%。?5%。的條件下進行耐鹽性篩選，以未導 入外源DNA的受體作為對照，進行水稻生長的耐鹽性和產量品質性狀的篩選鑒定，篩選生 長正常的單株，收獲〇 3代種子；
[0013] (6)將收獲的D3代種子在鹽池鹽度為4%。?5%。的條件下進行耐鹽性篩選，以未導 入外源DNA的受體作為對照，進行水稻生長的耐鹽性和產量品質性狀的篩選鑒定，篩選生 長正常的單株，收獲比代種子；
[0014] (7)在鹽池鹽度為5%。的條件下進行多代篩選，直至D6代植株基本穩定；
[0015] (8)同時，培育出與雙8S/海湘4號C815S雜交獲得F#植株；
[0016] (9)將收獲的D6代株系的種子與獲得的Fi代單株種子分別在鹽分為2%。和4%。、 6%。不同梯度的江蘇鹽城灘涂鹽地中進行田間試種，選育出耐鹽性高、生長好、產量高的新 品種或新品系，以未導入外源DNA的受體作為對照；
[0017] (10)次年，將新品系或新品種在鹽分為3%。-4%。的江蘇鹽城灘涂鹽地中進行50畝 "耐鹽水稻高產示范區"中展示，以未導入外源DNA的受體作為對照，進行水稻生長的耐鹽性 和產量品質性狀的篩選鑒定。
[0018]在本發明中，由該方法得到的耐鹽水稻新品種或新品系的新的DNA片段，其編碼 序列為序列表1中所示。
[0019] 綜上所述，本發明運用花粉管通道技術將鹽生植物的總DNA轉移的方法，操作簡 單，具有無基因型限制和易于實現大規模基因轉化的特點，可以在任何開花植物和不同物 種之間實現基因的轉移，并省略了組織培養過程，避免了植物組織培養過程中可能產生的 各種無法預測的不利影響，能同時導入多個基因，達到耐鹽植物分子育種的目的。
[0020] 本發明的的有益效果為：
[0021] (1)供體材料新。從發掘、搜集的十余種鹽生植物種質資源中選出蘆葦，是培育創 制耐鹽水稻的核心種質材料；以鹽生植物蘆葦總DNA作為供體材料，區別于克隆分離單個 耐鹽相關基因轉化受體植物；
[0022] (2)導入方法新。盡管以前有人通過花粉管通道將外源基因導入植物，但就其固有 的研宄目的和操作細節而言都與本發明所述的大不相同。本發明建立了關于水稻的程序化 導入方法。通過花粉管通道導入蘆葦總DNA進行耐鹽水稻育種是首次應用；
[0023] (3)篩選方法新、效果明顯。該鹽篩方法是先將種子鹽篩；幼苗至全生育期在人工 鹽池篩選；大田選育；鹽灘田間種植成功，可以逐步進入鹽灘地大田生產中應用；一般轉基 因植物在實驗室可能有一定的耐鹽性，而一旦進入大田中其耐鹽性狀就不明顯了；
[0024] (4)育種周期短。通過常規育種獲得穩定株系一般需要8-10年，而通過該方法培 育的水稻株系僅僅只用了 3-4年就穩定了；
[0025] (5)利用本發明育成的耐鹽水稻新品系耐鹽性好、產量高
[0026] 在2012年5月將培育出的一批性能穩定的耐鹽水稻新品系21個組合或株系，在 江蘇鹽城沿海灘涂進行不同梯度鹽分2%。、4%。、6%。（低、中、高）進行田間中試，海湘030、 海湘016、海湘121表現突出，育種時間較一般的常規育種縮短了一半。2013年，將海湘030、 海湘016、海湘121三個耐鹽水稻新品系在鹽城沿海灘涂50畝"耐鹽水稻高產示范區"中展 示，在3%。_4%。鹽分下對照品種全部死亡絕收而這三個耐鹽水稻表現優異，其中海湘030最 好，株高100厘米左右、整齊一致，畝產達817斤。
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發明培育耐鹽水稻及田間中試示意圖；
[0028] 圖2為海湘030、海湘016、海湘121三個耐鹽水稻新品系在鹽度為3%。的江蘇鹽城 沿海灘涂種植圖，其中030表示海湘030,016表示海湘016,121表示海湘121，對照株全死 亡；
[0029] 圖3為海湘030、海湘016、海湘121三個耐鹽水稻新品系在鹽度為6%。一9%。的江 蘇鹽城沿海灘涂種植圖，其中030表示海湘030,016表示海湘016,121表示海湘121，CK為 水稻9311對照株；
[0030] 圖4為海湘030、海湘016、海湘121三個耐鹽水稻新品系在3%。一4%。的江蘇鹽城 沿海灘涂50畝"耐鹽水稻高產示范區"中展示圖；
[0031] 圖5為水稻海湘030的長勢圖；
[0032] 圖6為轉基因水稻植株PCR擴增檢測結果。
【具體實施方式】
[0033] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明：
[0034] 下述實施例中所用的材料，試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0035] -、耐鹽水稻的培育
[0036] 1 ?材料
[0037] 供體：鹽生植物蘆葦
[0038] 受體：水稻9311、鹽恢559、7海76、7海74
[0039] 2.具體操作步驟如下所述：
[0040]