通過微小rna診斷類風濕性關節炎的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及測試衍生自測試對象血液的樣品用于確定類風濕性關節炎的病理狀 態的方法，用于其的診斷試劑等。
【背景技術】
[0002] 類風濕性關節炎（RA)是特征在于破壞性關節炎的全身性炎性疾病。它的發病率 據說是全世界人口的1%，并且0.7-1百萬患者位于日本，其中每年15, 000人新近發展該疾 病。近年來，已闡明類風濕性關節炎中的不可逆關節破壞比常規預測的更早開始，并且因此 已推薦從早期開始積極使用顯示出高關節破壞抑制性作用的生物制劑，這增加類風濕性關 節炎的早期診斷的重要性。
[0003] 微小RNA (miRNA)是長度約22個堿基的短鏈RNA分子，并且通過與其信使RNA的 3'非翻譯區中的互補序列結合而抑制靶基因的翻譯。miRNA已知調節多種生物現象，并且 整個基因的1/3假定為處于通過miRNA的表達調節下。在2008年，顯示miRNA (miR-141) 存在于血漿中，并且可用作前列腺癌的生物標記(非專利文件1)，其中由于RNA降解酶的存 在，在血漿中RNA長久以來被視為不存在。
[0004] 另一方面，本發明人已闡明通過測量血楽中的miR-16、miR-132、miR_146a、 miR-155和miR-223濃度，可以確定類風濕性關節炎，并且可以判斷疾病狀態，所述miRNA已 報道為細胞內存在且與類風濕性關節炎相關(專利文件1)。
[0005] [文件列表]
[專利文件] 專利文件 1 :W0 2011/126105 [非專利文件] 非專利文件 1 :Proc Natl Acad Sci USA 2008，105 :10513-10518。
[0006] 發明概述 待由本發明解決的問題 根據2010年公布的類風濕性關節炎的新分類標準，因為顯著重點在于診斷評分中風 濕病因子和抗CCP抗體的得分，所以即使當關節腫脹很小時，這些檢查項目陽性的病例也 可以診斷為具有類風濕性關節炎，而陰性病例不能診斷為具有類風濕性關節炎，除非關節 腫脹在11個或更多部分中發現。在據說占0.7-1百萬人的日本類風濕性關節炎患者中，百 分之三十預測為對于抗CCP抗體是陰性的。因為根據目前的診斷標準，診斷在抗CCP抗體 陰性病例中是延遲的，所以需要即使在抗CCP抗體陰性病例中也能進行類風濕性關節炎的 早期診斷的診斷標記。
[0007] 考慮到上述情況，本發明旨在建立屬于不同于自身抗體例如抗CCP抗體、風濕病 因子等那種的類別的類風濕性關節炎標記，特別是同樣可應用于自身抗體陰性病例的標 記，并且提供用于確定類風濕性關節炎病的存在或不存在和類風濕性關節炎患者中癥狀的 進展（即，疾病狀態）的方法。
[0008] 解決問題的方法 在實現上述目標的嘗試中，本發明人全面研究類風濕性關節炎患者和健康人的血漿 中的miRNA濃度。因此，他們已發現在類風濕性關節炎患者的血漿中比健康人的那些顯 示顯著更高的表達水平的 miRNA (miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、 miR-125a-5p、miR-126-3p 和 miR-502-5p)。當來自這些 miRNA 的 miR-24、miR-26a 和 miR-125a-5p用作標記時，類風濕性關節炎確定中的靈敏度和特異性分別為63. 7%/89. 5%、 53. 9%/94. 3%和64. 7%/89. 5%，具有最佳截斷值。作為常規用于確定類風濕性關節炎的最 出名標記的風濕病因子和抗CCP抗體的靈敏度和特異性據報道分別為54%/91%和48%/98% (ARTHRITIS & RHEUMATISM 2000,43(1):155-163)。因為 miR-24、miR-26a 和 miR-125a-5p 無一迄今據報道與疾病相關，所以與眾所周知的類風濕性關節炎確定標記的那些可比較的 高靈敏度和特異性完全是無法預測的。另外，使用miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p組 合的三種miRNAs (ePRAM，使用微小RNA估計的RA概率)的復合值，可以執行靈敏度78. 4%、 特異性92. 3%的測試，并且進一步地，使用現有的抗CCP抗體和這三種miRNA組合，可以執 行靈敏度94. 1%、特異性95. 2%的測試。此外，在抗CCP抗體陽性病例和陰性病例之間未觀 察到miR-24、miR_26a和miR-125a_5p表達水平中的顯著差異，其已闡明miRNA也可用于確 定抗CCP抗體陰性病例中的類風濕性關節炎。
[0009] 本發明人還研究了在類風濕性關節炎患者的血漿中的miRNA濃度的絕對值或其 對數和類風濕性關節炎的指數（VAS、DAS28 (ESR)和DAS28 (CRP))之間的關聯。因此， 在VAS和miR-24、miR-26a、miR-30c、miR-126-3p和miR-502-5p;DAS28 (ESR)和miR-24、 miR-26a、miR-30c、miR-30e-3p、miR-126-3p和miR-502-5p;以及DAS28 (CRP)和miR-24、 miR-26a、miR-30c、miR-30e-3p、miR-126-3p和miR-502-5p之間發現關聯，并且發現這些 miRNA可用作疾病狀態標記。這些miRNA和類風濕性關節炎之間的關系迄今為止尚未報道。
[0010] 本發明人已基于這些發現進行進一步研究并且完成本發明。
[0011] 相應地，本發明如下所述。
[0012] [1]測試衍生自測試對象血液的樣品用于確定類風濕性關節炎的病理狀態的方 法，其包括下述步驟： (a) 在衍生自測試對象血液的樣品中，測量選自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、 miR-28_3p、miR_30c、miR-30e_3p、miR-125a_5p、miR-126_3p和miR-502_5p的至少一種 miRNA的表達水平，或miR-24和miR-125a-5p的表達水平，并且用樣品中的內部標準miRNA 的表達水平來標準化一種或多種表達水平。
[0013] [2] [1]的方法，其進一步包括下述步驟： (b) 使步驟（a)中測量的表達水平與類風濕性關節炎的病理狀態關聯。
[0014] [3] [1]或[2]的方法，其中在步驟（a)中，在衍生自測試對象血液的樣品中， 測量選自miR-24, miR-26a和miR-125a-5p的至少一種miRNA的表達水平，或miR-24和 miR-125a-5p的表達水平。
[0015] [4] [3]的方法，其中在步驟（a)中，在衍生自測試對象血液的樣品中，測量 miR-24和miR-125a-5p的表達水平。
[0016] [5] [3]或[4]的方法，其進一步包括下述步驟： (a'）在衍生自測試對象血液的樣品中，測量抗CCP抗體的水平， 其中在步驟（b)中，使步驟（a)中測量的表達水平和步驟（a'）中測量的抗CCP抗體水 平與類風濕性關節炎的病理狀態關聯。
[0017] [6] [3]或[4]的方法，其中所述測試對象是抗CCP抗體陰性的。
[0018] [7] [1] - [6]中任一項的方法，其中所述衍生自血液的樣品是血漿。
[0019] [8] [1] - [7]中任一項的方法，其中所述測試對象是人。
[0020] [9]用于確定類風濕性關節炎的病理狀態的診斷試劑，其包含能夠特異性檢 測選自 miR-24、miR_26a、miR-28_5p、miR-28_3p、miR_30c、miR-30e_3p、miR-125a_5p、 miR-126-3p和miR-502-5p的至少一種miRNA的核酸探針或核酸引物，或 能夠特異性檢測miR-24的核酸探針或核酸引物， 和 能夠特異性檢測miR-125a-5p的核酸探針或核酸引物。
[0021] [10] [9]的診斷試劑，其包含能夠特異性檢測選自miR-24、miR-26a和 miR-125a-5p的至少一種miRNA的核酸探針或核酸引物，或 能夠特異性檢測miR-24的核酸探針或核酸引物， 和 能夠特異性檢測miR-125a-5p的核酸探針或核酸引物。
[0022] [11] [10]的診斷試劑，其包含能夠特異性檢測miR-24的核酸探針或核酸引物， 和 能夠特異性檢測miR-125a-5p的核酸探針或核酸引物。
[0023] [12] [9] - [11]中任一項的診斷試劑，其進一步包含環狀瓜氨酸肽。
[0024] [13] [1] - [8]中任一項的方法，其中所述內部標準miRNA是miR-30a-5p。
[0025] [14] [9] - [12]中任一項的診斷試劑，其進一步包含能夠特異性檢測 miR-30a-5p的核酸探針或核酸引物。
[0026] [1' ]測試衍生自測試對象血液的樣品用于確定類風濕性關節炎的病理狀態的方 法，其包括下述步驟： (a) 在衍生自測試對象血液的樣品中，測量選自miR-24、miR-26a、miR-28