專利名稱：一種體外誘導神經干細胞定向分化為膽堿能神經元的方法
技術領域：
本發明涉及生物工程和發育生物學，具體涉及神經干細胞的分化研究，更具體地涉及體外誘導神經干細胞定向分化為膽堿能神經元的方法。
背景技術：
神經干細胞的發現是近年來神經科學領域研究的重大突破，已成為近期研究的熱點，不僅因為其具有研究神經系統發育的重要性，更主要的是其潛在的治療價值[1]。Mckay[2]等認為，神經干細胞指具有自我更新能力和分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞能力的細胞。自我更新和多分化能力是神經干細胞的2個基本屬性。
神經干細胞的多分化潛能成為目前研究的熱點之一。神經干細胞當移植到發育中樞神經系統或成年中樞神經系統的神經發生區域，就能分化成某些特別的神經元[3.4]。但是當將神經干細胞移植到成年中樞神經系統非神經發生區域時，神經干細胞仍然保持未分化或大部分分化成神經膠質細胞。而神經元是一種非常重要的細胞，因此在移植前將神經干細胞在體外誘導分化成特定的神經元是非常必要的。
誘導神經干細胞分化的關鍵問題是如何才能將神經干細胞高效的誘導分化成產生專門遞質的功能神經元或特定類型的神經膠質細胞，如膽堿(Ach)能、多巴胺(DA)能、去甲腎上腺素(NE)能、γ-氨基丁酸(GABA)能、甘氨酸(Glycine)能神經元，以及星形膠質細胞、少突膠質細胞等。但目前有關這方面研究的資料不多，仍然處在探索階段。就科研工作者研究發現，神經干細胞的分化受外部環境和自身基因調控的影響。
影響神經干細胞增殖分化的因素是神經營養因子，它對中樞神經系統和周圍神經系統的神經元均有一定的促進存活和刺激突起生長的作用。生長因子在神經干細胞和祖細胞的分化發育過程中的作用亦愈來愈受到重視，其中絲裂原樣的生長因子信號在增殖過程中起著相當重要的作用。已用于維系干細胞特性的絲裂原信號主要包括表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)[5]。
神經干細胞的體外分離培養為研究神經系統的發育及神經系統疾病治療提供了一條新的途徑。目前，神經干細胞的來源較廣，根據起源部位的不同，可以分為紋狀體源、皮層源、腦干源、脊髓源以及骨髓源神經干細胞。但是起源不同的神經干細胞對不同的生長因子有不同的反應特性，根據一些前期研究發現，紋狀體源的神經干細胞既可以在EGF的刺激下分裂增殖，又可以在bFGF的刺激下分裂增殖；而脊髓源性的神經干細胞基本就喪失了對單獨的EGF的反應，只對bFGF的刺激有反應，甚至只有在EGF和bFGF的協同作用下才能長出能夠分裂傳代的功能性神經干細胞團[6]。研究證據表明神經營養因子對不同種類中樞神經元的存活、胞體發育和突起延伸具有促進作用。但神經元在發育分化增殖過程中存活的微環境及參與調控的因子十分復雜，絕非僅受一種神經營養因子的影響。迄今對神經營養因子之間的聯合作用還不甚清楚。同一神經元上可以同時存在不同營養因子的受體，當不同神經營養因子共同作用于同一個神經元時，效果互補而增加營養效應。
由于膽堿能神經元是一種重要的神經元，能取代由于肌萎縮或脊髓損傷導致的運動神經元的損失，能改善人或動物的學習、記憶等能力，對老年癡呆、癲癇等也具有重要的調節作用。目前研究膽堿能神經元的分化主要是從基因調控方面來研究的，由于膽堿能神經元的分化可能受多個基因調控，故而用該方法來研究較為復雜。而且對這些神經元分化的研究，大多著重于膽堿乙酰轉移酶(ChAT)的活力研究，而關于不同神經營養因子對神經元發育分化和突起發育生長的作用是否相同，以及神經營養因子間有否協同作用的研究較少。本發明者通過在培養基中添加幾種神經營養因子，以不同的組合方式來改變外部培養條件，研究定向誘導分化膽堿能神經元的最佳組合，從而完成了本發明。
發明內容
本發明的目的是提供一種體外誘導神經干細胞定向分化為膽堿能神經元的方法。
本發明的方法包括以下步驟(1)神經干細胞的分離、培養和鑒定；(2)神經干細胞的誘導分化在含1％B27(v/v)、20ng/mL EGF的F12-DMEM(1∶1)培養基中加入bFGF、肝素、層粘連蛋白后，于37℃、50mL/L CO2飽和濕度下將神經干細胞誘導分化為膽堿能神經元；(3)膽堿能神經元的鑒定。
本發明方法中，神經干細胞較佳為從胎鼠紋狀體分離得到。
所述神經干細胞的培養方法將胎鼠紋狀體在含有1％B27、20ng/mL EGF、10ng/mL bFGF的F12-DMEM(1∶1)培養基中，吹打制成細胞懸液，于37℃、50mL/L CO2飽和濕度下進行培養。
在將神經干細胞誘導分化為膽堿能神經元后，再進行體外培養7天。
所述神經干細胞和膽堿能神經元采用免疫熒光法進行鑒定。
本發明從胎鼠紋狀體中分離培養了神經干細胞并確定了從骨髓中能分離培養出神經干細胞；同時，以胎鼠紋狀體培養的神經干細胞為材料，從改變外部環境以及基因水平兩個方面進行定向分化研究，提供了獲得膽堿能神經元的一種新途徑，為研究老年癡呆提供了一種重要的思路，為研究與神經干細胞分化相關基因功能并篩選與其定向分化相關基因提供了一種有力的工具，為探索其定向分化、調控機制提供了一定的線索，并為實現神經干細胞的移植和相關神經功能奠定了基礎。
本發明的方法操作簡單，重復性好，分化率達30％以上。
具體實施例方式
1.神經干細胞的分離培養無菌條件下取出14天大鼠胚胎的紋狀體，放入含有1％B27，20ng/mL EGF，10ng/mL bFGF的F12-DMEM(1∶1)培養基中，吹打制成細胞懸液，于37℃，50mL/L CO2飽和濕度下常規培養。
2.神經干細胞的鑒定將細胞貼附在載玻片上生長，2天后取出。吸出培養液，用PBS洗去殘余培養液，4％(m/m)多聚甲醛固定20分鐘。PBS洗2次(每隔10分鐘1次)；10％正常山羊血清封閉1h；PBS洗3次；抗nestin抗體(v/v 1∶100，用抗體緩沖液稀釋)4℃過夜，PBS洗3次；二抗(v/v 1∶50，用抗體緩沖液稀釋)32℃孵育1小時，PBS洗3次；50％(v/v)甘油封片，觀察熒光。
3.從神經干細胞誘導分化成膽堿能神經元本研究是將20ng/mL bFGF(簡稱F)，5μg/mL肝素(簡稱H)，1μg/mL層粘連蛋白(簡稱L)三種物質進行組合(即FHL，FH，FL，LH四種組合)后，加入到含1％B27(v/v)，20ng/mL EGF的F12-DMEM(1∶1)培養基中而構成四種不同成分的培養基，將神經干細胞置于四種不同的培養基中，于37℃、5％CO2飽和濕度下進行誘導分化，同時做空白對照(培養基置于預先放有涂有多聚賴氨酸的載波片的培養皿中)。
4.膽堿能神經元的免疫鑒定培養7天后，將含有細胞的載玻片取出，用PBS洗去殘余培養液，4％(m/m)多聚甲醛固定20分鐘。PBS洗2次(每隔10分鐘1次)；10％正常山羊血清封閉1小時；PBS洗3次；抗膽堿乙酰基轉移酶(ChAT)抗體(v/v 1∶500，用抗體緩沖液稀釋)4℃過夜，PBS洗3次；二抗(v/v 1∶50，用抗體緩沖液稀釋)32℃孵育1小時，PBS洗3次；50％(v/v)甘油封片，觀察熒光。
5.結果神經干細胞在分別含FHL、FH、FL和LH的四種基礎培養基中培養1天后，顯微鏡下觀察，結果在含FHL的基礎培養基中培養的細胞的分散程度明顯大于其它三種培養基培養的細胞。培養第三天后，在含FHL的基礎培養基中培養的細胞有部分開始分化，而在分別含FH、FL、LH的基礎培養基中的細胞仍然處于未分化狀態。培養7天后，經ChAT免疫反應，發現只有含FHL、FH的培養基誘導的細胞才檢測到ChAT+即觀察到綠色熒光。取十個視野分別在熒光和明光下觀察，FHL混合物誘導的膽堿能神經元占總細胞的30％，但FH混合物誘導的膽堿能神經元僅占10％。
由于bFGF、肝素以及層粘連蛋白可作為膽堿能神經元分化調節因子，這可能對臨床膽堿能神經元性疾病有治療作用。FHL和FH兩種培養液能分化為較多的膽堿能神經元其原因可能有兩點第一，bFGF能促進神經干細胞的分化[7]；第二，bFGF因與肝素親和力高，故又稱為肝素結合生長因子，其對各種體外培養神經元具有神經營養作用，表現為促進神經元的存活與生長[8]。
參考文獻[1]Gage F H，Ray J，Fisher L J.CNS干細胞的分離、鑒定和使用，Annu.Rev.Neurosci.，1995，18159。
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Shihabuddin L S，Ray J & Gage F H.基礎科學和臨床應用中的干細胞技術，Arch.Neurol.，1999，5629-32。
邵寧生成纖維細胞生長因子與神經元再生，神經解剖學雜志，1994，10(3)274。
權利要求
1.體外誘導神經干細胞定向分化為膽堿能神經元的方法，包括以下步驟(1)神經干細胞的分離、培養和鑒定；(2)神經干細胞的誘導分化在含1％B27(v/v)、20ng/mL EGF的F12-DMEM(1∶1)培養基中加入bFGF、肝素、層粘連蛋白后，于37℃、50mL/L CO2飽和濕度下將神經干細胞誘導分化為膽堿能神經元；(3)膽堿能神經元的鑒定。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述神經干細胞從胎鼠紋狀體分離得到。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述神經干細胞的培養方法是將胎鼠紋狀體在含有1％B27、20ng/mL EGF、10ng/mL bFGF的F12-DMEM(1∶1)培養基中，吹打制成細胞懸液，于37℃、50mL/L CO2飽和濕度下進行培養。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述神經干細胞的鑒定采用免疫熒光法。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述神經干細胞在誘導分化后再進行體外培養7天。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述膽堿能神經元的鑒定采用免疫熒光法。
全文摘要
提供一種體外誘導神經干細胞定向分化為膽堿能神經元的方法，包括神經干細胞分離、培養和鑒定后，在含1％B27(v/v)、20ng/mL EGF的F12－DMEM(1∶1)培養基中加入bFGF、肝素、層粘連蛋白后，于37℃、50mL/L CO
文檔編號C12N5/06GK1673356SQ20051002357
公開日2005年9月28日 申請日期2005年1月26日 優先權日2005年1月26日
發明者陳付學, 任雯雯, 楊洋, 過七根, 宋紅生, 文鐵橋 申請人:上海大學