制備樣品的方法

專利名稱：制備樣品的方法
制備樣品的;^法
駄領域
本發明涉及組織學領域，特別是制備樣品的方法。
背景技術：
組織學是對生物組織的形態和組成的微觀研究。特別是對于建立可冑^寸病人 的治療進行定位的診斷來說，這項研究非常重要。在對生物組織的mn研究之前， 通常將其包埋入在室溫下為固態的基質中，然后制備成具有幾微米數量級厚度的 薄切片，最后進行染色反應，所述染色反應可以識別組織的不同成分。
制備用于微見檢驗的生物組織的領域中的標準方法早已有描述，例如已在M. Langeron的書籍"Pr6cis de microscopie"， Ed.MassonandCie，巴黎，1942;或者 R Ganter禾口 G Jolies 的書素音"Histochimie normale et patiiologique " Ed. Gauthier-Villais，巴黎1969中描述。設計包埋以允許由待檢驗的組織片制備薄且規 則的切片。最廣泛j頓的包埋介質是石蠟。石蠟為疏冰性，樣品應進行脫水，通
常艦在濃度增加的乙醇浴中浸漬，然后再在甲辯n二甲苯浴中浸漬規行脫水。
隨后將樣品置于包含熔化的石蠟的浴中，隨后石蠟滲入M組織片，此方法是公 知的浸漬銜impregnation)。組織片冷卻后將其成型為固體石蠟塊，生物組織片包 埋在其中。隨后用切片機(microtome)制備石蠟塊的切片，所述切片機能制備通常 為l-3pm厚的薄切片。
將這些切片置于載玻片上并染色。染色劑通常為水溶性的，因此在染色前必 須將切片再7K合，以使得它們處于可以進行組織學染色的狀態。再水合M從切 片中除去石蠟而進行，其通過將切片在甲苯或二甲苯浴中浸漬，然后在濃度漸減 的醇浴中浸漬，最后在水中浸漬3I64行。
染色前的切片制對除去石蠟和7K合MOT了大量有機溶劑，特別是醇、甲苯或 二甲苯，由于所述、歸贓4頓以及隨后的處置或回社魏管限制，從而導致高 成本。
已知應用的趨勢M管使有機溶齊啲應用M^甚至停止使用。與過去幾十年
年經常使用但現在其應用受嚴格的監管的某些溶齊,如苯或氯仿對以，例如甲苯 或二甲苯的溶劑的應用恐怕在將來也會受至販為嚴格監管限制。
因此需要以減少有機溶劑的使用或不使用有機溶劑為目的的制備用于醫學分 析的樣品的新方法。

發明內容
本發明的目的 供處理包埋在固體基質中的生物組織，特別是包埋在石蠟 中的脫水組織的薄切片的方法，從而制備不含所述基質，并處于物理化學狀態， 特別是水合或用水溶性物質浸漬的狀態的組織，這使得它們適于被組織學染色。
已知處于純物質狀態和混合物形式的有機溶劑的實例，其在制備用于組織學 分析的樣品的領域的應用已被評價，并且其適于代替甲苯或二甲苯。特別要提到 的是二噁烷、氯仿、甲餅己'臓脂肪族烴。已知這些溶劑存在毒性問題和域由 于易燃而導致的處理過程中的安全性問題。此外，本領域技術人員已知使用這些 溶劑處理的樣品的質量遠低于使用甲苯的標準方法處理獲得的樣品。
在越來越多的申請中使用壓縮流體，特別是、液體或超臨界二氧化碳，用于許 多方法，其中它們可以有利地代替有機溶劑。
首先給出流體的各種狀態及其處于這些狀態下的性質的概述。已知通常認為 物質有三種狀態，即固態、液態或氣態，通過改窮鵬和域壓力，可以從一個狀 態轉換至另一狀態。除了固態以外，液態和氣態的存在由蒸^/冷凝曲線劃分；并 且存在一個點，超過該點就可以從液態轉換到氣態或蒸汽狀態而不發生沸騰，或 相反i也不發生冷凝，該點被稱為臨界點。
超臨界流體的特征為在純物質的情況下分別超過臨界壓力和溫度的壓力和溫 度，或者為在混合物的情況下位于圖(壓力、、鵬)中表示的臨界點包圍的范圍之外 的代表性的點(壓力、、鵬)；因此，其對非常多的物質顯示出高溶解能力，這是在 處于壓縮氣體狀態的相同流體中觀察到的溶解能力無法相比的。同樣也適用于所 謂的"亞臨界'液體，即處于一種狀態下的流體，所述狀態的特征為在純物質的情 況下壓力大于臨界壓力，，低于臨界溫變，或在混合物的情況下壓力大于組分 的臨界壓力，溫度低于組分的臨界溫度(參見Michel PERRUT的文章-Les Techniques de l'Ing6nieur " Extraction par fluide supercritique， J 2 770 -1至12,1999 ")。 此外，超臨界流體的溶解能力的大范圍并可調節的變化在提取(固體/液體)、併留(液體/流體)、分析或制備色譜、材料處理(陶瓷和聚合物材料等)、以及顆粒生產的多 種方法中應用，在j5脫溶劑中腿行化學或生物化學反應。
應注意的是，二氧化碳的物理化學M和其臨界參數(臨界壓力7.4MPa，臨
界溫度3(rc)使M許多應用中成為tt^的溶劑，特別是由于其無毒并且可以以
極低的成本極大量地獲得。在類似的條件下也可以使用其他流體，例如一氧化二 氮、具有兩個至四個碳原子的輕烴、醚和某些齒代烴。
應注意的是，通常7乂僅極微溶于常用的處于超臨界壓力的流體和液化氣中，
特別是在處于高壓力下的二氧化碳中，在25-50'C下水在其中溶解的量僅為
l-3g/kg。然而，盡管溶解度很低，但此溶解度會對因itbJc合的液體的性質產生很
大影響，并且當弓l入的流體不包含水時，會導致用該流體處理的材料脫ZR。
接下來為了簡鵬見，壓縮流j桐各表示倒可處于實質性地(substantially)大于大 氣壓力的壓力下的流體。處于超臨界壓力下的流i桐各表示處于大于其臨界壓力的 壓力下的流體，即如上定義的嚴格意義上的超臨界流體，或所謂的亞臨界液體。 同樣的，液化氣將表示由在大氣壓力和室溫下為氣態，并處于分別低于其臨界壓 力和溫度的壓力和溫度下的化合物組成的液體。
已知已開發了很多使用壓縮流體，特別是處于超臨界壓力下的二氧化碳的提 取方法并且現已工 用(參11±述Michel PERRUT的文章)。這些方法基于使包 含待提取物質的材料與處于使其可以溶解待提取物質的,和壓力條件下的壓縮 流體接觸。本領域技術人員知道在進行戶，提取方法時可能改變材料的結構。部 分壓縮流f枯戶腐材料內部溶解，然后Mffi(其伴隨著壓縮流體的快速解吸附)，可 能不可逆地改變該材料的結構。
此外，在用壓縮流體，特別是液體或者超臨界二氧化 行提取的最后，材 料將會脫水。而且，已知許多烴，特別是石蠟，在液體鵬臨界二氧化碳中具有 足以使其會詢多進行戶脫旨在回收所述烴的提取方法的溶解度。然而，容易理解使 用所述提取方法可能嚴重損害包埋在固體基質中的生物組織的結構，這會嚴重降 低微觀研究及其由其產生的診斷結果的質量。此外，使用壓縮二氧化碳提取石蠟 后，生物組織將會脫水，這會導致無法用親水染料進很且織學染色。
相反地，用于進行由材料中提取物質的方法的壓縮流體的有利性質使材料的 浸漬成為可能。的確已知f頓壓縮流體，特別是處于超臨界壓力下的二氧化碳的 浸漬方法，其中溶解或分散在壓縮流體中的物質滲入固體基質中，如專利
FR2798863所述。這些方法禾倆了壓縮流體的良好擴散',，以及壓縮流體和固 體基質之間的導致基質結構改變的相互作用，從而使其能夠用物質浸漬。如近期 D. L. TOMASKO等人的綜遞"A review of C02 applications in the Processing of Polymers"公開于Industrial & Engineering Chemistry Research, Volume 42， P. 6431至 6456， 2003)所述，特別^)(寸于聚合物的處理而言，這些方法織艦。近年的專 利和出版物教導使用這些浸漬方法通常導致將被浸漬的基質的微結構的損害。已 知在大量的實例中，借助于壓縮流體的固體基質的浸漬不可避免地伴隨著孔結構 例如膨脹的泡沫或微孔片的形成。
使用超臨界流體制備用于組織學分析的生物樣品的方法也可由專利申請 WO2005/001437獲悉。該方法將生物組織包埋在4腿由石蠟組成的固體基質中。 根據該申請，使生物樣品與包含超臨界流體的組合物接觸，然后通過與熔化的包 埋基質擲蟲細亍浸漬。
本發明的部分目的在于提供如下方法，所述方法可以從包埋在固體基質、特 別是石蠟中的生物組織中提取和除去所述基質，并且使該組織處于水合狀態或者 處于被水溶性物質浸漬的狀態，所述狀態可以使其進行組織學染色，但不會破壞 該組織的結構。
因此本發明的主題是處理由包埋于固體支持基質中的生物組織組成的樣品的 方法，期寺征在于fM方M括下列連續步驟
畫將樣品與第一壓縮流體流接觸，以提取戶皿固體基質，其中所述支持基質可
溶于0f述第一壓縮流體，
-將樣品與第二壓縮流體接觸，戶/M第二M流體可^^^且織被含水或水溶 性物質浸漬，
-以可控的方式逐漸排出所述第二壓縮流體，
-回收樣品。
由于本發明主題的方法在審恪用于微觀研究的生物樣品時可以避免有毒有機 溶劑，特別是甲苯或二甲苯的使用，因此是特別有利的。
此外，本發明主題的方法僅在將樣品在高壓下導入反應器的過程中和在所述 反應器中回收的過程中需要處理樣品。因此由于所述方法可以簡化包括多個處理 步驟(特別是樣品在有機溶齊腋中的遊賣浸漬)的復雜的預處理過程，因此是特別有 利的。
本發明基于一個事實，即出人意料地觀察到將包埋于固體基質中的生物組織 與可溶解所述基質的第一壓縮流體接觸以提取包埋基質，然后將其與含水或水溶
性物質溶解或分散于其中的第二壓縮流體接觸，使得經，漸和受控的減壓后可 以制備結構未受損害并且被所述含水或水溶性物質浸漬的組織，從而使其能夠進 行組織學染色。與使用上述壓縮流體進行提取或浸漬的方法不同，本發明主題的 方法使用不會損害生物組織的結構的壓縮流體組合物、溫度和壓力條件，以及逐 漸的且可控的減壓步驟。此外，出人意料地觀察到所述兩種壓縮流體的某些組合 物可以逐漸地提取疏冰包埋基質，并用含7乂或水溶性物質浸漬組織。
在具體的實施方案中，使用包含二氧化碳和水溶性有機溶劑以及水溶性含水 溶劑的第二壓縮流體可以使組織處于可控的物理化學狀態，所述狀態適合通常為 組織學分析而進行的染色的要求。
具體實駄式
根據本發明的一個實施方案，所述第一壓縮流體包含處于超臨界壓力下的二
氧化碳以及任選的有機溶劑。雌地，戶腿有機溶劑包含具有1-5個碳原子，特 別是2個碳原子的醇，。
在本發明實施方案的另一個變體中，可使用二氧化碳、水溶性有機溶齊訴口含 水溶齊啲混合物作為第一壓縮流體。
才艮據本發明，所述第二壓縮流體有利地包含二氧化碳和水溶性有機溶劑的混 合物，任選地補加含水溶劑。
根據本發明另一W寺別有禾啲實施方案，所述第一和第二壓縮流體相同。
在有利的實施方案中，在所述第一和第二壓縮流體與樣品接觸的過程中，將 其壓力保持在4-70MPa，優選6-30MPa下，將，保持在0-50。C，優選20"40。C 下。
特別是為了改善處理后的組織的質量，確保良好的保存，M^、處理時間，用 能夠進行、制備或傲布染色的試劑浸漬組織，或可代替地，控制包含含水溶劑的 壓縮流體的pH，可向所述兩種壓縮流體中的每一個添加其他化合物o
根據兩種壓縮流體的組合物和方法的參數，包埋基質的提取步驟和用含水物 質浸漬組織的步驟可以有利地同時進行艦后進行。
由于可以使用溫和的操作條件，特別是接近室溫的^來制備用于組織學分 析的生物組織，因此本發明主題的方法瞎別有利。因此，本發明主題的方法特別
適于制備用于進行免疫組織化學、凝集素組織化學(lectinohistochemistiy)、組織酶
學、或原〗立雜交技術的生物組織。
將生物組織切成薄切片形式，li選厚度為1-5 pm的薄切片。 當應用于包埋于石蠟中的組織顯微切片(micrometric section)時，特別是當所述
切片被固定在玻片上時，本發明主題的方法是有利的。
本發明主題的方法可以處理人、動物或植物來源的生物組織樣品，其中可以
提及的有上皮組織，特別是被aJ:皮和腺上皮；結締組織，特別是疏松結締組織、
致密結締組織、骨組織、軟骨組織、淋巴和造血組織；神經組織，特別是中樞神
經系統和外周神經系統的組織；肌肉組織，特別是平滑肌、橫紋骨骼肌或橫紋心
肌組織。
經本發明主題的方法處理的樣品可以進行的染色方法中可以提及的方法是二 色染色(bichromic staining),特別是4OT蘇^(l，h6malun)—曙紅、蘇木精一根皮紅、 蘇木精一赤蘚紅染色；三色染色，特別是4頓蘇木精—曙紅—藏紅花(saffixm)、蘇 木精一根皮紅一藏紅花染色、^ffi亮綠或苯胺藍進行Masson三色染色；全染色， 特別是May-GrtJnwaldGiemsa染色；特殊染色，特別是用過碘酸-Schiff染色、用 蘇丹黑染色、用地衣紅染色，Peri染色；免疫組織化學染色，特別是用于鑒定腫 瘤抗原。還可以提及的是在凝集素組織化學、組織酶學、或原位雜交領域中使用 的樣品制備方法。
附圖簡述


圖1表示能夠進行本發明主題的方法的設備的簡圖。
圖2禾B 4表示在根據如實施例1所述的本發明主題的方法處理的精囊切片的 顯微見察的過程中獲得的照片。
圖3和5表示在根據如實施例1所述的常規標準方法處理的精囊切片的顯微 觀察的過程中獲得的照片。
鄉例
如下戶皿，在設備中進行了大量實施例，所述實施例的目的是說明本發明的 方法，但不限制本發明的方法。
所述設備包括由二氧化碳組成的液化氣的ie存裝置1 ，其出口通過泵2和交換 器3與高壓釜4連接，所述泵2和交換器3可以分別使流經的氣流達到期望的壓 力和溫度。該高壓釜具有可以容納承載薄切片的載玻片，并用來自忙存裝置1的 二氧化碳流沖洗其的裝置(未在圖中表示)。
戶皿高壓釜1包括由壓力調節設備5組成的回收裝置，所述回收裝置與分離 器6連接，在排入排氣口 9之前在分離器6中變為氣態。
所述設備還包括用于添加溶劑的管道，所述管道包 S1過泵8與高壓釜4連 接的儲罐7，其使得有機或含水溶劑以及其他可以與溶劑混合的化合物可以在其中 混合。將可以在分離器6的底部10以液態回收這些不同的組分。
實施例l:精囊薄切片的處理
在此實施例中，將其上置有包埋于石蠟中的1-5 Mm厚的精囊薄切片的載玻片 放入高壓釜4中。關閉高壓釜4，將^Jt設置為35t:。進行方法的下列步驟
a) 在20MPa的壓力，35'C的溫度和4kg/h的箭速下，用通過泵2引入的二 氧化碳流沖洗(flush)高壓釜。將戶;M沖洗保持30併中，
b) 接著在20MPa的壓力，35"C的^Jt和4kg/h的箭速下，用由泵2和8 iif共的混合物流沖i^f述高壓釜，戶腐混合物包含75質量％的二氧化碳，22.5% 的乙醇和2.5%的水，將戶jf^^洗保持15併中，
c) 停ih^^述壓縮流體，逐漸將高壓釜內的壓力降低至大氣壓力，同時 將鵬呆持在35。C。,過程為30分鐘。
d) 高壓釜達到大氣壓力后立即打開，回收載玻片。
可以注意的是，^^;玻片的外觀都是相同的。在這些載玻片的顯微研究中
未觀察到石蠟的繊。然后將玻片進行染色。使用Masson三色染色(^^錄變體)， 所述Masson三色染色組合了蘇木精核染色，酸性著色劑混合物(Fuchsine-Ponceau) 細胞質染色，禾口用另一種酸性著色劑亮綠的"選擇性"膠原染色。4頓R^actifsR. A. L.公司銷售的試齊U盒"Trichrome de Masson variante au vert lumi6re -編碼 36] 350-0000 (Masson三色試劑盒，亮綠變體一編碼361350-000)根據如下步驟染 色在Mayer蘇木精中將載玻片染色10併中，在水中漂洗；在Fuchsine-Ponceau
溶液中染色5射中；在水中漂洗；在磷f臓浴中媒染3辦中；不經沖洗，在亮綠 溶液中染色5併中；在1%的醋酸水中漂洗兩次(tWO baths);依次在濃度增加的
醇浴中分化；轉移到甲苯浴中，最后固定戶脫載玻片。
當染色時，借助于顯微鏡，使用x20和x40鏡頭在白光下檢查載玻片。作為 參考，在進行同樣的染色之前，將從相同組織中獲得的切片除去石蠟，然后通過 標準方銜臥甲苯浴中，然后^A濃度遞減的乙醇浴中，接著臥水中)進行水合。
染色后，《頓本發明主題的方法處理的載玻片的外觀(圖2和4)被證明與參考 載玻片(圖3和5)相同。未觀察到組織損壞，且組織成分保存良好，具有特征染色 質。在兩種情況下都可以以綠色分辨腔內的精液分泌。所述腔的輪廓由染成紅色 的被覆上皮(ep他elial covering)組成，其排列不佳的細胞是精囊的特征。由淀粉狀 蛋白沉積物組成的透明蛋白物質被染成粉紅色。細胞核(包括一些精子)顯示被染成 紫藍色。紅細胞被染成亮紅色。位于所述囊的周圍及內部的平滑肌呈現暗紅色。 最后，可以清楚分辨出所述切片的*局部解剖圖。因此所述組織處于使其可以 成功i，行染色步驟的物理化學狀態，特別是水合狀態。
因此本發明主題的方法可以代替標準方法，并且無須使用有毒的有機溶劑就 可以獲得相同的樣品質量。
實施例2:本發明，的方法的，的變體
此實施例闡述了本發明主題的方法的一個特別簡單的實施方案，即在用純二 氧化碳提取石蠟后，將給定體積的含水或親7jC物質如乙醇和水的混合物由高壓釜4 的底部加入。然后使組織與由此被乙醇和水飽和的流體撤蟲。
將其上置有包埋在石蠟中的精囊的薄切片的載玻片^A高壓釜4，并借助支撐 物(圖中未示出將所述載玻片保持在高壓釜4的頂部。關閉高壓釜，餘驢設為 35°C。進行下列步驟
a) 在20MPa的壓力，35。C的溫度，4kg/h的流速下，用通過泵2引入的二氧 化碳流沖洗高壓釜，將臓沖洗麟30她
b) 然后停ih^l壓縮流體，將50ml的乙醇/水混合物(體積比1/1)通過泵8引 入高壓釜4的底部，通過使流^^出高壓釜的壓力控制閥5將壓力保持在20MPa。 使樣品與由乙醇和水溶于其中的二氧化碳構成的第二壓縮流4機觸15分鐘，
c) 逐漸將高壓釜內的壓力降低至大氣壓力，將驢保持在35t:，減壓過程為 30燥。
d) 達到大氣壓力后立即打開高壓釜，回收載玻片。Masson三色染色法后，根據與實施例1中所述的方案相同的方案，包括在通 過浸入甲苯浴來除去石蠟后將參比載玻片同時染色，觀察到經本發明主題的方法 處理的載玻片的顯微形態與參比載玻片的形態相同。
鄉例3:用液態zm化微理
用與實施例2的描述相同的處理方式處理小腸薄切片，不同之處在于高壓釜 和流體的溫度保持在25。C，且高壓釜內的壓力設為8MPa。因此二氧化碳為液態。 此外，a)歩驟(提取石蠟)的時間為180併中。
蘇木精 一 曙紅 一藏紅花染色后(包括通過浸入甲苯浴來除去石蠟后將參比載 玻片同時染色)觀察到經本發明主題的方法處理的載玻片的形態與參比載玻片的 形態相同。這兩種情況下，染色質均為特征性的，組織學成分均保存及分化良好。
權利要求
1.處理樣品的方法，所述樣品包含包埋于固體支持基質中的生物組織，其特征在于所述方法包括下列步驟-將樣品與第一壓縮流體流接觸，以提取所述固體基質，其中所述支持基質可溶于所述第一壓縮流體，-將樣品與第二壓縮流體接觸，所述第二壓縮流體可使所述組織被含水或水溶性物質浸漬，-以可控的方式逐漸排出所述第二壓縮流體，-回收樣品。
2. 如權禾腰求1所述的方法，其特征在于卩腿第一壓縮流體包含處于超臨界壓力的二氧化碳。
3. 如權利要求2戶脫的方法，期寺征在于戶腿第一壓縮流體還包含有機溶劑。
4. 如權利要求3戶腿的方法，期寺征在于戶腿第一壓縮流體還包含含ZR溶劑。
5. 如前述權利要&一所述的方法，其特征在于所述第二壓縮流體包含二氧 化碳和水溶性有機翻的混合物。
6. 如權利要求5戶腿的方法，期寺征在于戶腿第二壓縮流體還包含含水溶劑。
7. 如權利要求3-5之一所述的方法，其特征在于戶;M有機溶劑包含具有1-5 個碳原子、優選2個碳原子的醇。
8. 如前述權利要粒一戶腿的方法，其特征在于戶脫第一和第二壓縮流體相同。
9. 如前述權禾腰^t一所述的方法，其特征在于在與樣品接觸的過程中，將 所述第一和第二壓縮流體的壓力保持在4-70MPa，優選6-30MPa，溫度保持在 驄0-50。C，雌20-40。C。
10. 如前述權禾腰fe—戶腿的方法，其特征在于提取固體基質的步驟和用含 水物質浸漬組織的步驟同時進行。
11. 如前述權利要fe—所述的方法，其4寺征在于使用石蠟作為固體基質。
12. 如前述權利要&一所述的方法，其特征在于將生物組織切成薄切片的形 式，"琉厚度為1-5網。
13. 如前述權禾腰粒一戶脫的方法，^m正在于將戶腐生物組織的薄切片置于載玻片上。
全文摘要
本發明涉及制備樣品的方法，所述樣品包含處于固體基質中的生物組織。所述方法的特征在于包括以下步驟將所述樣品與第一壓縮流體流接觸，以提取所述固體基質，其中所述基質可溶于所述第一壓縮流體；將樣品與第二壓縮流體接觸，所述第二壓縮流體可使所述組織被含水或水溶性物質浸漬；以可控方式逐漸排出所述第二壓縮流體；回收樣品。
文檔編號G01N1/30GK101351692SQ200680043398
公開日2009年1月21日 申請日期2006年9月20日 優先權日2005年9月21日
發明者F·安布斯, F·德尚, M·佩魯特 申請人:西斯托萊克斯公司