專利名稱：中國地生蘭花原生細胞胚消化酶干預培養法的制作方法
技術領域：
本發明是一種中國地生蘭花原生細胞胚消化酶干預培養法。
背景技術：
中國地生蘭花種子極細，細如塵埃，種子內僅有一個發育不完全的胚， 沒有胚芽和胚乳，不具備種子的基本結構，沒有供其萌發的營養物質，還不能稱其為種子， 只能稱其為原生細胞胚，加之有一層翅羽狀種皮，種皮不易吸收水分，如蓮瓣蘭種子泡在水中三年以上也不能吸收到水分和外部提供的營養物質，在自然界中必須靠某種真菌菌絲穿透其種皮為其提供營養才能誘發根狀莖龍根，不同的蘭花所需的真菌各不相同，人們至今未能分離到能作用于中國蘭花的真菌，各科研機構經過多年研究，僅僅分離到可供腐生蘭天麻萌發的小菇真菌，和供其生長所需的密環菌。所以，人工繁殖天麻得以成功，其他蘭花還不能自然繁殖。用常規方法播種不能萌發，故需要人工突破種皮后再由培養基來供給養份才能使原生細胞胚萌發，突破種皮現有技術是用氫氧化鈉溶液或酸溶液來浸泡腐蝕種皮，破皮后氫氧化鈉溶液或酸溶液同時也腐蝕了細胞胚，使其失活，難以控制得恰到好處， 成功率極低，在加上中國地生蘭花不能誘導產生原球莖，而是在未知真菌作用下偶然產生根狀莖龍根，龍根在底下潛伏生長多年后形成龍根蛋或龍根球后，才分化出蘭花實生苗，人工誘導根狀莖龍根目前是個技術難題，此技術以前一直以日本、臺灣領先，經數十年研究， 國內外有個別成功啟動的報道但很難實現重復成功啟動，再加上啟動根狀莖龍根成功率極低，一直以來未能達到批量生產目的，洋蘭(如大花蕙蘭和蝴蝶蘭)不產生根狀莖，直接由莖尖組織或種子產生原球莖，即可分化出從生芽，培養比較簡單所以日本、臺灣早已實現產業化生產，出口至世界各地賺取了大量外匯，而幽香高潔、號稱“王者之香”的中國地生蘭花至今不能產業化生產，因此在物以稀為貴的原因下，前幾年有人將國蘭炒到了幾十萬、甚至幾百萬一苗的天價，損害蘭花愛好者的利益。本發明旨在突破國蘭產業化的技術瓶頸，并取得了成功。發明內容本發明的目的是提出一種中國地生蘭花原生細胞胚消化酶干預培養法，該方法能夠有效破解中國地生蘭花果實中細胞胚的種皮，同時又不損傷細胞胚本身，使細胞胚能吸收到周圍營養和水分，細胞能分化發育成種苗，并且有高的細胞胚啟動率，以此解決現有技術的難題。本發明提出的這種中國地生蘭花原生細胞胚消化酶干預培養法，其特征在于它有如下步驟(1)蝸牛酶消化酶的提取從田間收集活的大蝸牛，饑餓兩天后用水沖洗干凈，輕輕敲碎，并小心剝去外殼，順消化道剪開體壁，剝離出消化道，從嗉囊和胃里抽取棕色消化液，用離心機以離心分層后，留上清液，棄掉沉淀物，用無菌濾膜注射器過濾純凈上清液待用；(2)細胞胚預處理選用尚未開裂的蘭花果實，表面用75%的酒精滅菌后，用10% 次氯酸鈉浸泡5 10分鐘，用無菌水沖洗3次完成表面消毒后，在無菌操作臺上切開果子， 將其中的原生細胞胚粉粒倒入置于100毫升消化酶溶液中25°C度浸泡30-50分鐘，用滴管吸取少量含有細胞胚粉粒的液體在相差顯微鏡下觀察，在顯微鏡下觀察到翅羽狀種皮開始降解時，立即停止浸泡并用無菌水沖洗至少3次，用濾紙過濾原生細胞胚粉粒；
(3)稀釋將過濾出的細胞胚粉粒放入啟動有絲分離液體營養液中稀釋；(4)接種將第C3)步含有細胞胚粉粒的液體培養液接種于試管中的基礎固體營
養基上；(5)暗培養接種好的試管在25°C恒溫狀態下在旋轉床上震蕩暗培養，直到可觀察到細胞胚粉粒開始膨大，細胞胚有絲分離開始；(6)光照培養此時轉為在1300LX光強下每天照射12h光照培養，恒溫25°C條件下靜置培養，直到可觀察到白色細胞團膨大至l_3mm，顏色轉綠，在下部長出白色生長點 1-6個，逐漸向下鉆入固體營養基，此時已完成了試管內蘭花根狀莖(又名“龍根”)啟動過程；(7)分化將根狀莖轉接于分化固體營養基中生長點朝下插入營養基，25°C光強 2000LX條件下，培養60d左右生長點開始不斷向下生長至2-3cm，根狀莖開始轉向折頭向上生長，直至鉆出固體營養基表面，這時生長點分化為芽點并長出子葉；(8)生根將根狀莖轉接于壯苗生根固體營養基上，芽點朝上根狀莖朝下，25°C光強2500LX條件下培養60d，根狀莖與子葉交界處長出肉質氣生蘭根，子葉中心長出完整蘭花苗；(9)煉苗移栽將蘭花苗連龍根一起從試管中移出，洗凈根部附著的營養基，用 1/1000濃度的多菌靈消毒后，晾干至氣生根發白時，移栽至經高溫消毒的腐質基質中。第(1)步的消化酶上清液，現取現用，間隔不超過一天，以保持其活性。第⑵步有消化酶溶液配比組成是蝸牛消化酶上清液30ml，山梨醇0. lg, pH值調至5. 8，無菌水稀釋至100ml。第(3)步的啟動有絲分離液體培養基配方是N6+蔗糖20g+6BA2. Omg+NAAO. 2mg+ 香蕉提取液IOOml+活性碳2g。第⑷步的基礎固體營養基配方是1/4MS+馬鈴薯泥50g+活性碳3g+強度為1300 的瓊脂粉3. 2g。第(7)步的分化固體營養基配方是1/4MS+6BA0. 5mg+NAA0. 5mg+馬鈴薯泥IOOg+ 活性碳3g+強度為1300的瓊脂粉3. 7g。第(8)步的壯苗生根固體營養基配方1/2MS+6BA0. 2mg+IBA2. 5mg+馬鈴薯泥 IOOg+香蕉泥IOOg+活性碳3g+強度為1300的瓊脂粉3. 7g。第(5)步暗培養的時間為70-90天，一般以80天為宜。第(6)步的培養天數為40-60天，以50天為宜。本發明采用大蝸牛的消化酶，作用于地生蘭花原生細胞胚翅羽狀種皮，在不使用腐蝕性液體的條件下通過酶的作用降解了蘭花種皮，同時對中國地生蘭花原生細胞胚幾乎沒有損傷，極大提高了培養的成功率，甚至可實現有菌自然播種。發明人用此方法，實現了所有蘭科植物的原生細胞胚啟動根狀莖的無菌培養，甚至連豆瓣系蘭花這樣的被日本臺灣科學家稱為“單向基因，不太可能組培”的植物原生細胞胚啟動根狀莖的無菌培養成功率達到100%，其中蓮瓣蘭，豆瓣蘭，兜蘭，春蘭，寒蘭，綠蘭，秋枝，墨蘭，劍葉蘭等品系中，共實驗 91個品種，所有受試品種達到驚人的100%培養成功，為此打開了號稱“王者之香”的中國地生蘭花的大批量人工培養的技術瓶頸，解決了這個世界性難題。應用該方法，我們在多年的培養過程中，培養出了蓮瓣蘭、豆瓣蘭、兜蘭、春劍、春
5蘭、寒蘭、綠蘭、秋枝、墨蘭、劍葉蘭等品系。所有受試蘭花品系中共實驗91個品種全部啟動了根狀莖龍根的生成，細胞胚啟動率可達75%以上，全部分化出了完整的植株，平均每個蘭花果蓀可培養出3000-5000苗蘭花成苗，增加根狀莖龍根分化轉接次數可實現無限量中國地生蘭花種苗周年生產。中國蘭花是世界瀕危野生珍稀植物，其花香高雅、尊貴，國蘭精油是唯一無法人工合成的香料，價格是黃金的數十倍。更由于國蘭花種苗難育，傳統方式僅靠分株繁殖，數量十分稀缺，使得蘭花精油的價格逐年快速攀升。本發明從根本上解決了中國蘭花人工育苗的世界性難題，誰優先知曉、掌握本發明誰就擁有巨大商機，形成壟斷，形成巨大產業。因此，本發明可能涉及國家重大經濟利益。
圖1是蓮瓣蘭細胞胚經消化酶處理后培養180天，啟動形成根狀莖向下生長實況圖。圖2蓮瓣蘭根狀莖轉瓶后180天形成龍根蛋實況圖。圖3是蓮瓣蘭龍根在分化培養基中培養120天后分化出完整小苗實況圖。圖4是出瓶移栽60天成活的蓮瓣蘭實況圖。
具體實施方式
下面是實施本發明的具體實例1、蝸牛酶消化酶的提取(1)從田間收集足夠多的活大蝸牛；(2)活蝸牛饑餓兩天后；(3)用水沖洗干凈，輕輕敲碎，并小心剝去外殼；(4)順消化道剪開體壁，剝離出消化道，從嗉囊和胃里抽取棕色消化液。每只大蝸牛平均可得到IML的消化液；(5)用離心機10000轉/分，離心10分鐘，留上清液，棄掉沉淀物；(6)用無菌濾膜漏斗過濾，收集的濾液呈棕褐色，只能現提取現用，否則會很快失去活性。2、預處理選用尚未開裂的蘭花果實，表面用75%的酒精滅菌后，用10%次氯酸鈉浸泡5 10分鐘，取出再用無菌水沖洗3次完成表面消毒后，在無菌操作臺上切開果子，將其中的原生細胞胚粉粒倒入置于100毫升消化酶(配方見附配-1)溶液中25度浸泡30-50分鐘，用滴管吸取少量含有細胞胚粉粒的液體在相差顯微鏡下觀察，發現翅羽狀種皮開始降解時， 立即停止處理，用無菌水沖洗至少3次，用濾紙過濾原生細胞胚粉粒，準備接種，整個操作過程必須嚴格在無菌環境中進行。3、稀釋將過濾出的細胞胚粉粒放入啟動有絲分離液體配養基(配方見附配- 中稀釋到 50粒/ml濃度。4、接種將上述含有細胞胚粉粒的液體培養液按aiil/瓶的接種量接種于基礎固體營養基上(配方見附配_3)，5、暗培養接種好的試管在25°C恒溫狀態下在旋轉床上震蕩暗培養80d，可觀察到細胞胚粉粒開始膨大，色白，細胞胚有絲分離開始。6、光照培養此時轉為在1300LX光強下每天照射1 光照培養，恒溫25°C條件下靜置培養 50d，可觀察到0. Imm以下的白色細胞團繼續膨大至l_3mm，顏色轉綠，在下部長出白色生長點1-6個，逐漸向下鉆入固體營養基，此時已完成了試管內國蘭根狀莖(又名“龍根”)啟動過程，7、分化在超凈工作臺上將根狀莖轉接于分化固體營養基(配方見附配-4)中生長點朝下插入營養基，25°C光強2000LX條件下，培養60d左右生長點開始不斷向下生長至2-3cm時， 出現有趣的現象，根狀莖開始轉向折頭向上生長，直至鉆出固體營養基表面，這時生長點分化為芽點并長出子葉。8、生根在超凈工作臺上將根狀莖轉接于壯苗生根固體營養基(配方見附配巧)上，芽點朝上根狀莖朝下，25°C光強2500LX條件下培養60d根狀莖與子葉交界處長出肉質氣生蘭根，子葉中心長出完整蘭花苗。9、煉苗移栽將蘭花苗連龍根一起從試管中移出，洗凈根部附著的營養基，用1/1000濃度的多菌靈消毒后，晾干至氣生根發白時，移栽至經高溫消毒的腐質基質中。附配-1 消化酶液配方蝸牛消化酶上清液30ml，山梨醇0. lg, pH值調至5. 8，無菌水稀釋至IOOml備用。附配-2 啟動有絲分離液體配養基配方N6+ 蔗糖 20g+6BA2. Omg+NAAO. 2mg+ 香蕉提取液 IOOml+ 活性碳 2g 的附配-3 基礎固體營養基配方1/4MS+馬鈴薯泥50g+活性碳3g+強度為1300的瓊脂粉3. 2g附配-4 分化固體營養基1/4MS+6BA0. 5mg+NAA0. 5mg+馬鈴薯泥IOOg+活性碳3g+強度為1300的瓊脂粉 3. 7g附配-5 壯苗生根固體營養基1/2MS+6BA0. 2mg+IBA2. 5mg+馬鈴薯泥 IOOg+香蕉泥 IOOg+活性碳 3g+強度為 1300 的瓊脂粉3. 7g。利用本例的方法培養出來的蓮瓣蘭、豆瓣蘭、兜蘭、春劍、春蘭、寒蘭、綠蘭、秋枝、 墨蘭、劍葉蘭、蘭花細胞胚的具體啟動率如下表。
權利要求
1.一種中國地生蘭花原生細胞胚消化酶干預培養法，其特征在于它有如下步驟(1)蝸牛酶消化酶的提取從田間收集活的大蝸牛，饑餓兩天用水沖洗干凈，敲碎，小心剝去外殼，順消化道剪開體壁，剝離出消化道，從嗉囊和胃里抽取棕色消化液，用離心機離心分層，留上清液，棄掉沉淀物，過濾純凈上清液待用；(2)細胞胚預處理選用未開裂的蘭花果實，表面用75%的酒精滅菌，用10%次氯酸鈉浸泡5 10分鐘，取出用無菌水沖洗3次完成表面消毒，切開果子，將其中的原生細胞胚粉粒倒入消化酶溶液中25°C度浸泡30-50分鐘，翅羽狀種皮開始降解時，停止浸泡，用無菌水沖洗至少3次，用濾紙過濾原生細胞胚粉粒；(3)稀釋將過濾出的細胞胚粉粒放入啟動有絲分離液體培養基中稀釋；(4)接種將第C3)步含有細胞胚粉粒的液體培養液接種于試管中的基礎固體營養基上(5)暗培養接種好的試管在25°C恒溫狀態下，在旋轉床上震蕩暗培養，直至可觀察到細胞胚粉粒開始膨大，細胞胚有絲分離開始；(6)光照培養接上步，此時轉為在1300LX光強下，每天照射12h光照培養，恒溫25°C 條件下靜置培養，直到試管內蘭花根狀莖(龍根)啟動；(7)分化將根狀莖轉接于分化固體營養基中，生長點朝下插入營養基，25°C光強 2000LX條件下，培養60d左右生長點開始不斷向下生長至2-3cm，根狀莖開始轉向折頭向上生長，直至鉆出固體營養基表面，這時生長點分化為芽點并長出子葉；(8)生根將根狀莖轉接于壯苗生根固體營養基上，芽點朝上根狀莖朝下，25°C光強 2500LX條件下培養60d，根狀莖與子葉交界處長出肉質氣生蘭根，子葉中心長出完整蘭花苗；(9)煉苗移栽將蘭花苗連龍根一起從試管中移出，洗凈根部附著的營養基，用1/1000 濃度的多菌靈消毒后，晾干至氣生根發白時，移栽至經高溫消毒的腐質基質中。
2.根據權利要求1所述中國地生蘭花原生細胞胚消化酶干預培養法，其特征在于第(1)步的消化酶上清液，現取現用，間隔不超過一天，以保持其活性。
3.根據權利要求1所述中國地生蘭花原生細胞胚消化酶干預培養法，其特征在于第(2)步的消化酶溶液配方是蝸牛消化酶上清液30ml，山梨醇0.lg, pH值調至5. 8，無菌水稀釋至100ml。
4.根據權利要求1所述中國地生蘭花原生細胞胚消化酶干預培養法，其特征在于第(3)步的啟動有絲分離液體培養基配方是N6+蔗糖20g+6BA2.Omg+NAAO. 2mg+香蕉提取液 IOOml+活性碳2g。
5.根據權利要求1所述中國地生蘭花原生細胞胚消化酶干預培養法，其特征在于第(4)步的基礎固體營養基配方是1/4MS+馬鈴薯泥50g+活性碳3g+強度為1300的瓊脂粉 3. 2go
6.根據權利要求1所述中國地生蘭花原生細胞胚消化酶干預培養法，其特征在于第(7)步的分化固體營養基配方是1/4MS+6BA0.5mg+NAA0. 5mg+馬鈴薯泥IOOg+活性碳3g+ 強度為1300的瓊脂粉3. 7g。
7.根據權利要求1所述中國地生蘭花原生細胞胚消化酶干預培養法，其特征在于第(8)步的壯苗生根固體營養基配方1/2MS+6BA0.2mg+IBA2. 5mg+馬鈴薯泥IOOg+香蕉泥IOOg+活性碳3g+強度為1300的瓊脂粉3. 7g。
8.根據權利要求1所述中國地生蘭花原生細胞胚消化酶干預培養法，其特征在于第(5)步暗培養的時間為70-90天，一般以80天為宜。
9.根據權利要求1所述中國地生蘭花原生細胞胚消化酶干預培養法，其特征在于第(6)步的培養天數為40-60天，以50天為宜。
全文摘要
本發明涉及中國地生蘭花原生細胞胚消化酶干預培養法，步驟是將饑餓兩天活蝸牛敲碎，剝離出消化道，從嗉囊和胃里抽取消化液并作凈化處理得上清液，配備成消化酶溶液；選用蘭花果實作消毒處理，取出種子粉粒，將其中的原生細胞胚粉粒倒入消化酶溶液浸泡到翅羽狀種皮開始降解時過濾原生細胞胚粉粒；將過濾出的細胞胚粉粒放入啟動有絲分離液體培養基中，稀釋并接種于試管中的基礎固體營養基上；試管25℃恒溫在旋轉床上震蕩暗培養，讓細胞胚分離；在1300LX光強下每天照射12h，恒溫25℃條件下靜置培養，直到下部長出生長點；分化生根；煉苗移栽得種苗。本發明首開利用動物消化酶降解蘭花原生細胞胚種皮先河，成功培育出了90余種珍稀國蘭品種，細胞胚啟動成功率達到75％，受試品種全部啟動，解決了瀕危珍貴物種人工育種的世界難題。
文檔編號A01H4/00GK102334450SQ20111026118
公開日2012年2月1日 申請日期2011年8月30日 優先權日2011年8月30日
發明者張笑逸 申請人:張笑逸