專利名稱：利用水牛eg樣細胞生產轉基因胚胎的方法
技術領域：
本發明屬動物生物技術、特別是利用水牛胚胎生殖(Embryonic Germ, EG) EG樣細胞 生產轉基因胚胎的方法。.
背景技術：
水牛是我國南方的一種極具開發前景的重要家畜，因其具有適應性強、耐高溫高濕、抗 病力強、耐粗詞、易詞養、使用年限長和乳品營養價值高等特性，倍受人們關注與重視。然 而，目前我國水牛的產奶量和繁殖率均普遍較低，嚴重制約了水牛奶業的發展，急需應用基 因工程技術對其進行改良。干細胞具有多能性和無限分裂增殖的特性，非常適合在體外進行 遺傳操作，可以通過胚胎嵌合或核移植獲得轉基因動物。但由于水牛體細胞的活力低，通過 基因轉染和培養篩選后，再進行核移植很難獲得轉基因胚胎。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種利用水牛EG樣細胞生產轉基因胚胎的方法，以適 應水牛品種改良的需要。
本發明以如下技術方案解決上述技術問題 本發明方法的主要步驟為-
首先對水牛EG樣細胞轉染與篩選傳代培養兩代的水牛EG樣細胞用線性質粒DNA (pCE-EGFP-IRES-Neo-dNdB)經脂質體(LipofectamineTM2000)介導轉染。細胞轉染后， 用杜貝科斯最低成分培養液(DMEM) +10%胎牛血清+200 y g/ml抗生素G418的培養液 篩選培養6 8天，獲得G418抗性的轉基因細胞。將G418抗性的轉基因細胞在不含G418 的培養液中進行擴增培養，并在熒光顯微鏡下檢測細胞的綠色熒光蛋白(GFP)表達情況， 將表達GFP的EG樣細胞用于轉基因胚胎的生產。
當制作水牛轉基因嵌合胚胎時，體外受精的卵母細胞受精后第三天，將10 15個表達 GFP的EG樣細胞顯微注射到8 16細胞階段的水牛體外受精胚胎中，然后與顆粒細胞的單 層細胞共培養4 5天，將培養獲得的囊胚在熒光顯微鏡下檢測GFP表達情況，篩選獲得水 牛轉基因嵌合胚胎。
當制作水牛轉基因克隆胚胎時，將表達GFP的EG樣細胞血清饑餓培養1~2天，然后 移植到去核的體外成熟水牛卵母細胞中構建核移植胚胎。重構胚經孤雌激活和與顆粒細胞的單層細胞共培養6 7天后，將獲得的核移植囊胚在熒光顯微鏡下檢測GFP表達情況，篩選 獲得水牛轉基因克隆胚胎。
用本發明的方法，成功獲得了一批水牛轉基因嵌合囊胚和轉基因克隆囊胚，且證明約 60%的囊胚能表達外源基因，嵌合法的轉基因胚胎陽性率達到62.6°/。，核移植法的轉基因克 隆胚胎陽性率達到58.3%，為下一步生產轉基因水牛邁出了重要的一步。
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圖1是用本發明的方法獲得的表達GFP的轉基因水牛EG細胞的顯微照片。
圖2.是用本發明的方法獲得的水牛轉基因嵌合囊胚顯微照片。
圖3.是用本發明的方法獲得的水牛轉基因克隆囊胚顯微照片。
具體實施例方式
本發明是一種利用已獲得的水牛胚胎生殖(Embryonic Germ, EG)樣細胞，通過胚胎嵌 合或核移植建立一種生產水牛轉基因胚胎的方法。
從屠宰場收集水牛卵巢，在實驗室用注射器回收卵母細胞，然后進行體外成熟和體外受 精。體外成熟20小時的卵母細胞去核后用于制作轉基因克隆胚胎；體外成熟24小時的卵母 細胞體外受精和體外培養3天后，將8 16細胞階段的體外受精胚胎用于制作轉基因嵌合胚 胎。
從屠宰場收集30 60日齡的水牛胎兒，將胎牛的生殖脊或生殖腺用解剖器械分離出來, 放到平皿中。用杜貝科斯磷酸緩沖液(PBS)洗3次后,轉移到另一平皿。利用1 mL注射器 的針頭將其機械分離成單個細胞或細胞團，然后將分離出來的細胞接種到預鋪了飼養層(IO ng/mL絲裂霉素C處理2h)的35 mm培養皿中，添加1. 5 mL用DMEM+20X胎牛血清 +0.1 mM非必需氨基酸+0.1 mM P —巰基乙醇+1 mM丙酮酸鈉+ 10 20 ng / ml小鼠 重組白血病抑制因子mrLIF+20 40 ng / ml人重組堿性成纖維細胞生長因子hrbFGF和 20 40 ng /ml小鼠重組干細胞因子mrCSF的培養基，置于37 'C 、 5% C02的培養箱中培養。 培養6 8天后，將形成的EG樣細胞克隆挑出，用lmL注射器的針頭將其分成單個細胞或 細胞團，繼續接種到飼養層培養進行傳代培養。EG樣細胞克隆傳代培養2代后，用線性質 粒DNA (pCE-EGFP-IRES-Neo-dNdB)經脂質體(LipofectamineTM 2000)介導轉染。細胞 轉染后，用DMEM+10W胎牛血清+200 y g/mlG418的培養液篩選培養6 8天，獲得G418 抗性的轉基因細胞。然后，將G418抗性的轉基因細胞在不含G418的培養液中進行擴增培 養，并在熒光顯微鏡下檢測細胞的綠色熒光蛋白GFP表達情況，將表達GFP的細胞用于轉 基因胚胎的生產。
水牛卵母細胞體外受精后第三天，將10 15個表達GFP的EG樣細胞顯微注射到8 16細胞階段的水牛體外受精胚胎中，然后與顆粒細胞的單層細胞共培養4 5天，將培養獲 得的囊胚在熒光顯微鏡下檢測GFP表達情況，篩選獲得轉基因嵌合胚胎。
將表達GFP的EG樣細胞血清饑餓培養1 2天，然后移植到去核的體外成熟水牛卵母 細胞中構建核移植胚胎。重構胚經孤雌激活和與顆粒細胞的單層細胞共培養6 7天后，將 獲得的核移植囊胚在熒光顯微鏡下檢測GFP表達情況，篩選獲得轉基因克隆胚胎。
實施例1
2006至2007年間，我們對104枚8-細胞階段的水牛體外受精胚胎，分別注入10 15 個轉染GFP基因的陽性水牛EG樣細胞，有37枚(占所有受注胚胎的35.6%)進入發育囊 胚階段，其中23枚囊胚(占囊胚總數的62.2%)表達GFP。證明可通過注射轉基因EG樣 細胞到8 16細胞階段的體外受精胚胎的轉基因胚胎制作方法，可有效生產轉基因水牛胚 胎。
實施例2
2007至200S年間，我們將138個轉染GFP基因的陽性水牛EG樣細胞移植到138枚去 核的水牛卵母細胞中，其中109枚融合(占去核的水牛卵母細胞總數的79.0°/。)形成重構胚， 其中68枚重構胚(占融合細胞總數的62.4°/。)分裂，11枚(占分裂重構胚的11.8°/。)發育 成囊胚，囊胚中的7枚(占囊胚總數的58.3%)表達GFP。這一實施例證明，本發明的通過 核移植轉基因EG樣細胞生產轉基因水牛胚胎的方法是可行的。
權利要求
1.一種利用水牛EG樣細胞生產轉基因嵌合胚胎的方法，其特征是制作水牛轉基因嵌合胚胎的主要步驟是(1)水牛EG樣細胞的轉染與篩選傳代培養兩代的水牛EG樣細胞用線性質粒DNA經脂質體介導轉染后，用DMEM+10％胎牛血清+200μg/ml G418的培養液篩選培養6～8天，獲得G418抗性的轉基因細胞；然后，將G418抗性的轉基因細胞在不含G418的培養液中進行擴增培養，并在熒光顯微鏡下檢測細胞的綠色熒光蛋白GFP表達情況，將表達GFP的細胞用于轉基因胚胎的生產；(2)制作水牛轉基因嵌合胚胎體外受精后第三天，將10～15個表達GFP的EG樣細胞顯微注射到8～16細胞階段的水牛體外受精胚胎中，然后與顆粒細胞的單層細胞共培養4～5天，將培養獲得的囊胚在熒光顯微鏡下檢測GFP表達情況，篩選獲得水牛轉基因嵌合胚胎。
2. —種利用水牛EG樣細胞生產轉基因克隆胚胎的方法，其特征是制作水牛轉基因克隆 胚胎的主要步驛是-(1) 水牛EG樣細胞的轉染與篩選傳代培養兩代的水牛EG樣細胞用線性質粒DNA 經脂質體介導轉染后，用DMEM+10X胎牛血清+200 n g/ml G418的培養液篩選培養6 8 天，獲得G418抗性的轉基因細胞；然后，將G418抗性的轉基因細胞在不含G418的培養液 中進行擴增培養，并在熒光顯微鏡下檢測細胞的綠色熒光蛋白GFP表達情況，將表達GFP 的細胞用于轉基因胚胎的生產；(2) 制作水牛轉基因克隆胚胎將表達GFP的EG樣細胞血清饑餓培養1 2天，然后 移植到去核的體外成熟水牛卵母細胞中構建核移植胚胎；重構胚經孤雌激活和與顆粒細胞的 單層細胞共培養6 7天后，將獲得的核移植囊胚在熒光顯微鏡下檢測GFP表達情況，篩選 獲得水牛轉基因克隆胚胎。
全文摘要
一種利用水牛EG樣細胞生產轉基因胚胎的方法，其工藝步驟為先對水牛EG樣細胞轉染與篩選，再分別制作水牛轉基因嵌合胚胎或水牛轉基因克隆胚胎。用本發明的方法，成功獲得了轉基因水牛嵌合囊胚和轉基因克隆囊胚，且證明60％左右的囊胚能表達外源基因，為下一步生產轉基因水牛邁出了重要的一步。
文檔編號C12N15/85GK101591673SQ20091011418
公開日2009年12月2日 申請日期2009年6月30日 優先權日2009年6月30日
發明者劉慶友, 石德順, 陸鳳花, 奔 黃 申請人:廣西大學