用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆及其制備方法和用途的制作方法

專利名稱：用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥技術領域，具體地說涉及用于篩選單克隆抗體的克隆及其制備方法及其用途，更具體地說涉及用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆及其制備方法及其用途。
背景技術：
腫瘤的分子靶向治療是近年來最具活力、倍受關注的領域，是根本意義上的腫瘤特異性治療手段，其技術核心是靶向分子，人們可以選擇任一種殺瘤物質與靶向分子結合。理想的靶向分子應具有以下特點①高特異的靶抗原結合性；②在適當的分子量范圍，以便于靶向分子在瘤組織內通透；③與靶分子結合時，呈高親合力；④分子的化學結構有利用于穩定，減少清除；⑤與治療對象有生物同源性，能最大限度地避免宿主的異種蛋白反應等。從目前的研究情況看，抗體是最佳靶向分子，抗腫瘤抗體的有效性取決于靶抗原的特異性與表達狀態，而腫瘤特異性抗原、高表達膜抗原在腫瘤中卻甚為少見，尋找新的瘤細胞特異的表面分子作為靶點是非常困難的，也是非常有限的，這恰恰是分子靶向治療的瓶頸所在。此外，作為臨床治療用抗體，人源抗體自然是最佳選擇，鼠源抗體的人源化還是一項比較繁雜的技術，但全人源抗體的制備相對于鼠源抗體而言有更大的難度和更高的技術要求。
腫瘤壞死靶向(Tumor Necrosis Targeting，簡稱TNT)治療是分子靶向治療的重要方法之一，其技術核心是靶向分子—核抗原特異性抗體。
TNT的基本原理早在50多年前，人們就發現相對于正常細胞，腫瘤細胞呈現極高的增殖特征，并伴有異常分化和中心部位的壞死；同時，腫瘤組織內的微血管也因快速增長和瘤細胞某些分泌成分的作用，呈現結構和功能上存在的滲漏缺陷(Leaky)，這種缺陷原本是有利于瘤組織的血流和營養灌輸的，但這一“Leaky”特征也為靶向分子的通透與靶點結合提供了條件(Dvorak HF，Nagy JA，Dvorak JT，et alIdentification and characterizationof the blood vessels of solid tumors that are leaky to circulating macromolecules.Am J Pathol1988，13395-109)。利用腫瘤組織的微血管和細胞膜的“Leaky”特點，應用能與細胞內核抗原成份結合的靶向分子攜帶殺瘤物質，滯留或定位于腫瘤組織內，造成腫瘤的特異性殺傷。這些靶向分子主要是抗細胞核內某些組份的抗體，殺瘤物質為核素、生物酶、前體藥物或某些抗瘤細胞因子等。瘤細胞被殺傷后釋出的靶向分子又可進入相鄰的瘤組織造成進一步的殺傷，如此使殺瘤范圍不斷擴大，直至正常組織細胞。鑒于TNT靶向分子在正常組織中的高清除、低滯留，因而在達到較好殺瘤效果的同時，對周圍正常組織的損傷卻很小。
因此，TNT雖然屬分子靶向治療，但與其他分子靶向治療有根本的不同，基點是其針對的靶點是細胞核的成分，這些成分本身是無腫瘤特異性，但由于其在細胞內，非靶向分子常規可及之處。而瘤組織的毛細血管和瘤細胞膜具有較高的通透特性(Sharifi J，KhawliLA，Hu P，King S，Epstein AL.Characterization of a phage display-derived human monoclonalantibody(NHS76)counterpart to chimeric TNT-1 directed against necrotic regions of solidtumors.Hybrid Hybridomics.2001；20(5-6)305-12)，對腫瘤細胞而言，核內成分抗原就成了瘤細胞的特異性靶分子。從理論上講，TNT靶向分子可適用于包括實體瘤在內的各種腫瘤，臨床實驗結果也表明，TNT制劑確有治療上的廣譜性，為腫瘤的特異治療提供了一條可行、有效的新思路、新途徑。
靶向分子是TNT技術的關鍵所在。目前已有眾多報道充分肯定了TNT的治療效果(Mizokarni MM，Hu P，Khawli LA，Li J，Epstein AL.Chimeric TNT-3 antibody/murineinterferon-gamma fusion protein for the immunotherapy of solid malignancies.HybridHybridomics.2003；22(4)197-207和Li J，Hu P，Khawli LA，Epstein AL.Complete regressionof experimental solid tumors by combination LEC/chTNT-3 immunotherapy and CD25(+)T-celldepletion.Cancer Res.2003 Dec 1；63(23)8384-92)，Peregrine制備的chTNT-3已與多種殺瘤物質復合，在肺癌、結腸癌、等做到了I、II期臨床并取得了極佳效果(Jack Gaddy.Innovative administration of radiolabeled TNT successfully treats inoperative lung cancer.2002，619.49th Annual Meeting of Nuclear Medicine.http//www.peregrineinc.com/prelease.asp？id＝6190271436和Jack Gaddy.CHINESE REPORT SUCCESS IN TREATING 8 BRAINCANCERS WITH TNT.BIOWORLD Today，By David N.Leff，Science Editor 5/20/1997)。而且，該公司正與Oakwood和Biopharm等諸家公司合作，將TNT治療向更廣泛的領域推進。
但是，迄今為止，尚未見新的用于篩選TNT抗體的克隆及其制備方法方面的報道。

發明內容
本發明的目的之一在于提供用于篩選TNT抗體的克隆，目的之二在于提供該克隆的制備方法，目的之三在于提供該克隆的用途即用該克隆篩選出新的TNT抗體，目的之四在于提供TNT抗體的制備方法。
本發明的技術構思如下1.本發明采用噬菌體表面展示文庫(Phage Surface Display)技術構建人源自身抗體噬菌體表面呈現文庫。構建噬菌體抗體文庫已是一項成熟的技術，已有大量應用該技術成功制備針對不同抗原的抗體或片段抗體的報道(Sharifi J，Khawli LA，Hu P，King S，Epstein AL.Characterization of a phage display-derived human monoclonal antibody(NHS76)counterpart tochimeric TNT-1 directed against necrotic regions of solid tumors.Hybrid Hybridomics.2001；20(5-6)305-12)。該項技術的優勢為一是從人的抗體基因的克隆開始，得到的完全是人源性抗體，無需進行人源化處理；二是在供體選擇恰當的情況下，獲得陽性克隆的幾率高，而且可以同時獲取多個克隆；三是在陽性株選定后，由陽性克隆到表達、修飾的過程簡單，便于產品的開發。
2.本發明采用自身免疫病患者的B淋巴細胞的抗體基因構建噬菌體表面呈現文庫。多種自身免疫病患者的B淋巴細胞和漿細胞高表達自身抗體，其中以抗DNA、抗組蛋白、抗核膜抗體等為多見，而且有些患者自身抗體呈高效價(＞1∶10,000)、高親和力特征，為在該類患者的抗體文庫中篩檢出理想抗體提供了極佳條件。
本發明對以上的構思進行了逐一驗證，研究結果均證明本構思的正確性。
本發明應用噬菌體表面展示文庫技術制備用于篩選TNT抗體的克隆，該克隆是用以下方法制備得到的，該方法包括以下兩個主要步驟①構建人源自身抗體噬菌體表面呈現文庫；A.選擇供體與提取RNA選擇的供體是自身免疫病患者，且其自身抗體的效價在1∶1,000以上；提取高表達自身抗體的B淋巴細胞和漿細胞，再按常規方法提取RNA；所述的患者一般是指患有一種自身免疫病的患者，優選患有多種自身免疫病的患者；所述的患者數量一般選擇2～10個自身免疫病患者，優選3～6個自身免疫病患者，進一步優選5個自身免疫病患者；所述患者的自身抗體的效價優選在1∶10,000以上；提取B淋巴細胞和漿細胞有多種途徑與方法，常規方法如如常用的梯密度離心法，具體操作是從外周血中、骨髓液中或淋巴組織中直接提取單個核細胞(主要包括單核細胞、淋巴細胞和少量的其它細胞等)；為得到較特異的抗原特異B淋巴細胞，還能夠在常規方法的基礎上，進一步采用分選方法，如通過抗原包被載體法或免疫磁珠分離細胞法等，優選免疫磁珠分離細胞法；多個自身免疫病患者骨髓的B淋巴細胞和漿細胞高表達自身抗體中，以抗DNA、抗組蛋白、抗核膜抗體等為多見，而且有些患者自身抗體的呈高效價(＞1∶10,000)、高親和力特征，這是實驗的極佳條件，在該類患者的抗體文庫中容易篩檢出理想的TNT抗體；B.擴增與克隆抗體基因按常規方法設計相應引物，分別擴增編碼抗體的重鏈Fv和C1基因以及輕鏈基因(見

圖1)，分步克隆到pComb3載體系統(見圖2)；一般根據自身抗體的常見形式(如IgG1、IgG3)設計相應引物，分別擴增編碼抗體的重鏈Fv和C1基因以及輕鏈基因，分步克隆到pComb3載體系統；C.應用Helper噬菌體(M13OK7)，構建完成表面展示文庫；
②從該文庫中篩選陽性克隆；A.應用固相包被抗原，對文庫進行多輪重復篩選(Bio-panning)；所述的抗原如dsDNA、ssDNA和histone等；所述的多輪重復篩選一般進行3～6輪，優選4輪；B.純化噬粒載體酶切去除gpIII基因片段，重新連接后轉化感受態菌進行可溶性表達；噬菌體表面展示是抗原特異性富集的手段，而后續抗體片段的鑒定則需要個體細胞株的可溶性表達；C.選取單克隆抗體進行增菌表達，按常規方法挑選陽性克隆。
一般選用酶聯免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay，簡稱ELISA)挑選陽性克隆。
本發明采用噬菌體表面展示文庫技術構建人源自身抗體噬菌體表面呈現文庫，能夠得到一種新的人源性抗體，無需進行人源化處理；所選擇供體合適，其自身抗體效價高，為篩檢出理想的TNT抗體提供了極佳條件，獲得陽性克隆的幾率高，并能夠同時獲取多個克隆，使產品TNT抗體的生產成本大幅度降低；在選定陽性株后，由陽性克隆到表達、修飾的過程簡單，便于產品的開發；因此，本發明所述的制備技術操作簡單易用，能夠快速實現產業化。
附圖表說明圖1是本發明抗體片段基因的PCR擴增的瓊脂電泳圖；其中，Fd表示重鏈片段的PCR擴增的瓊脂電泳結果；Lc表示輕鏈片段的PCR擴增的瓊脂電泳結果；M表示標準分子量標志；bp表示堿基對；圖2是本發明抗體基因克隆載體結構模式圖；其中，Lacz表示乳糖啟動子；pelBleader表示引導序列；H表示重鏈；gpIII stop表示胞膜蛋白III與終止序列；L表示輕鏈；stop表示終止序列；圖3是本發明載體轉變后的結構模式圖；其中，pBAD表示阿拉伯糖啟動子；ATG表示翻譯起點；
geneIII SS表示先導序列；H表示重鏈；stop表示終止密碼子；L表示輕鏈；6His表示多聚組氨酸序列；圖4是本發明Fab純化前、后的PAGE結果圖；其中，1、2為純化后的PAGE結果；3、4為純化前的PAGE結果；Kd表示分子量的單位千道爾頓；Fab表示抗體片段；PAGE表示聚丙烯酰胺凝膠電泳。
具體實施例方式
本發明公開的是用于篩選有臨床應用價值的TNT抗體的克隆及其制備方法，以及用該克隆篩選出新的TNT抗體及該抗體的制備方法，以滿足人們疾病治療、科學研究、藥物開發等方面的需要。
使用該克隆制備新的TNT抗體的方法本發明應用噬菌體表面展示文庫技術制備出用于篩選TNT靶向抗體的克隆，使用該克隆制備新的TNT抗體的方法，主要包括以下二個步驟①對陽性克隆進行表達，采用的方法是搖瓶或發酵等常規方法，得到表達產物；②對表達產物進行純化，可以使用現有的各種公知方法，如果離子交換法、分子篩、親和純化法等方法，優選親和純化法；對表達的抗體片段以親和純化法作初步純化后，就能夠進行生物活性與親和力等指標的全面測定。
以上所述的使用該克隆制備新的TNT抗體的方法是常規的方法，所得產品的效率不夠高，在工業化生產上不夠經濟，因此，本發明對此進一步進行了改進，該方法主要包括采用以下二個步驟①對陽性克隆進行載體轉換(見圖3)所述的載體包括常見的pComb3載體系統、自建的pBAD/dpp系統(已申請專利《人源片段抗體的pBAD表達系統》。申請日2003年4月8日，申請號03116231.2，
公開日2003年9月17日)等，優選自建的pBAD/dpp系統；②抗體的表達與純化pBAD/dpp系統載有his-tag，陽性株在誘導表達后應用Qiagen的his-tag純化系統進行親和純化(見圖4)；
TNT抗體采用全面鑒定與標記方法進行抗體質量驗證，以確保產品質量的穩定可靠。
使用該克隆制備得到的TNT抗體的全面鑒定與標記方法如下按常規方法，對TNT抗體作生物活性、抗原親合力、基本結構與序列方面的全面鑒定；用125I標記純化抗體，能夠進行細胞內核抗原結合活性測定與組織內代謝動力學測定。
TNT抗體的全面鑒定與標記，需要通過制備實體瘤荷瘤動物模型，然后再測定抗體生物活性，完成初步藥物動力學的研究，以確證產品，并保證產品質量的穩定與可靠。下面，以兩種實體瘤荷瘤動物模型的具體制備方法及其在抗體生物活性與初步藥物動力學研究的應用為例，進行詳細闡述。
①制備兩種實體瘤荷瘤動物模型實體瘤荷瘤動物模型之一A.材料BALB/c小鼠，6～8周齡；MM45T.Li細胞；B.腫瘤模型的建立對數生長期的腫瘤細胞用生理鹽水重新混懸，制成單細胞懸液，臺盼蘭染色，計數活細胞數＞95％，在BALB/c小鼠背部皮下接種2×106/0.2ml/只。小鼠接種腫瘤細胞后，檢查腫瘤接種點，3次/周，觸摸有無結節形成。在接種腫瘤細胞的小鼠生長腫瘤后第12天可觸及接種位點有腫瘤結節生長，成瘤后，測量腫瘤直徑，3次/周，計算腫瘤體積(按標準球形計算)V＝4π×R3/3(直徑6～7mm腫瘤體積大約100mm3)；對照組小鼠不作疫苗接種，僅在背部皮下注射RPMI-1640培養基0.2ml/只。
實體瘤荷瘤動物模型之二A.材料裸鼠12只，由第二軍醫大學動物實驗中心提供，20克，4～5周齡；Raji細胞1×108/ml，源自上海細胞生物所；B.實腫瘤模型的建立12只裸鼠分別于右臀接種Raji細胞(1×108/ml)100ul，觀察2～3周。腫瘤生長至0.4×0.4cm大小后，每日記錄腫瘤變化。各組情況同時以數據與照片記錄。
②抗體生物活性與初步藥物動力學研究應用已建荷瘤動物模型，通過核素標記抗體片段的瘤內注射、靜脈注射、肌肉注射方式等目前已公開的常規方法，檢測抗體的抗原結合、血液中的半衰期、組織闊清、細胞內滯留、殺瘤活性等。
本發明不但能夠得到了高效、低毒、突變的TNT抗體，并且不增加機體的異源反應，具有廣泛的醫用前景。
下面通過實施例來進一步具體說明本發明的內容，所述的實施例是為了更好地闡述本發明，并不是用來限制本發明的范圍。
實施例1、一種選擇供體與提取RNA1、篩選患者①在住院的自身免疫病患者中，篩選6個自身抗體強陽性的患者，標準是自身抗體效價大于1∶1,000；②行骨穿術，分別抽取骨髓液3ml，磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS)倍比稀釋；2、淋巴細胞分離液分離法常規分離單個核細胞①取淋巴細胞分離液(上海化學試劑廠，分析純)5ml，置無菌離心管；②用吸管將稀釋的骨髓液輕鋪于分離液面之上；③水平離心機離心，2,000rpm(轉/分鐘)，20分鐘；④吸取血清下細胞層細胞，PBS洗3次；⑤調整細胞濃度待用；3、RNA的抽提與cDNA合成①應用RNA抽提試劑盒(Qiagen)按說明制備RNA；②用洗脫液混懸，OD260測定所獲產品的純度和含量；③將3人的全部RNA合并；④以RT試劑(TaKaRa)反轉錄RNA為cDNA(使用抗體片段特異引物)。
實施例2、另一種選擇供體與提取RNA1、篩選患者①在住院的自身免疫病患者中，篩選3個均患有多種自身免疫病、自身抗體強陽性的患者，標準是自身抗體效價大于1∶10,000；②行骨穿術，分別抽取骨髓液3ml，磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS)倍比稀釋；2、免疫磁珠分離細胞法分離單個核細胞①充分混懸免疫磁珠液(無磁場狀態)；②取Tosyl，活化的磁珠0.1ml(M-450，Dynal公司)；③置磁場下靜放4分鐘；④B取出試管，去上清，B緩沖液洗2次；⑤以B緩沖液稀釋抗原(核蛋白組分)至0.1ml(約30微克/ml)；⑥充分混懸磁珠并與抗原液混合，震懸1分鐘；
⑦將試管置室溫旋轉10’，加BSA到0.5％；⑧將試管斜置37℃旋轉24小時；⑨置試管于磁場4分鐘，去上清；⑩洗磁珠4次，分別為緩沖液C 2次 4℃ 5分鐘，緩沖液D 1次 37℃ 4小時，緩沖液C 1次 4℃ 5分鐘；(11)將Ficoll分離的單個核細胞與磁珠混懸，4℃ 2～6小時；(12)置磁場分離靶細胞，PBS洗3次；(13)收集細胞待用；3、RNA的抽提與cDNA合成①應用RNA抽提試劑盒(Qiagen)按說明制備RNA；②用洗脫液混懸，OD260測定所獲產品的純度和含量；③將3人的全部RNA合并；④以RT試劑(TaKaRa)反轉錄RNA為cDNA(使用抗體片段特異引物)。
實施例3、擴增與克隆TNT抗體基因1、抗體基因擴增引物的設計與合成過去的有關文獻報道，自身抗體中IgG1和IgG3的比例最高，因而可以參照常規的實驗手冊等文獻設計引物如下VH+CH1(IgG1)的特異性引物序列為5’端正向引物5’-CAG GTG CAG CTGCTC GAGTCG GG3’端反向引物5’-GCA TGTACT AGTTTT GTC ACA AGA TTT GGGVH+CH1(IgG3)的特異性引物序列為5’端正向引物5’，CAG GTG CAG CTGCTC GAGTCG GG3’端反向引物5’-TGT GTGACT AGTGTC ACC AAG TGG GGT TTTVL+CL(κ)的特異性引物序列為5’端正向引物5’-GAA ATTGAG CTCACG CAG TCT CCA3’端反向引物5’-GCG CCGTCT AGAATT AAC ACT CTC CCC TGT TGAVL+CL(λ)的特異性引物序列為5’端正向引物5’-TCT GAAGAG CTCCAG GAC CCT GTT GTG TCT GTG3’端反向引物5’CG CCGTCT AGAACT ATG AAC ATT CTG TAG G劃線處為設計的與克隆載體相應的酶切位點。
2、TNT抗體編碼基因的PCR擴增以上述制備的cDNA為模版，在試管中分別加入IgG1、IgG3引物，VL+CL(κ)和VL+CL(λ)的引物用PCR試劑(Qiagen)擴增，1.0％的瓊脂糖膠純化擴增產物；PCR(Polymerasa Chain Reaction)，即聚合酶鏈反應，通常又稱之為體外基因擴增技術。
3、PCR純化產物與pMD18-T Vector的連接①連接反應體系pMD18-T Vector 1Insert DNA 1dH2O3Solution I 5Total10μl②16℃連接30min；③全量轉化至JM109感受態細胞中；④在含有X-Gal、IPTG、Amp的瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落；⑤挑選白色菌落于含50ng/mlAmp的10ml LB培養液中培養過夜，以待提取重組質粒；4、重組質粒DNA的抽提按華舜生物技術有限公司的質粒抽提試劑盒抽提上述重組質粒DNA，并于BACKMAN UV600上測定質粒的含量與純度；具體操作如下①在細菌沉淀中加入250μl P1液，振蕩至徹底懸浮；②加入250μl P2液，立即溫和顛倒離心管5～10次以混勻；室溫靜置4分鐘；③加入350μl P3液，立即溫和顛倒離心管5～10次以混勻；④12000rpm離心10分鐘。將上清液小心移入吸附柱，離心15秒；倒掉收集管中的液體；⑤在吸附柱中加入500μl洗滌液，離心15秒。倒掉收集管中的液體；⑥在吸附柱中加入500μl洗滌液，靜置1分鐘后，離心15秒；倒掉收集管中的液體；⑦離心1分鐘；⑧將吸附柱放入一個干凈的1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入50μl洗脫液，室溫靜置1分鐘后，離心1分鐘。將DNA溶液于-20℃保存；5、重組質粒的特異性酶切并膠回收①重鏈(IgG)酶切反應體系重組質粒speI xhoI 10×Buffer ddH2O Total3μg51U210U 10μl 適量 100μl輕鏈(κ，λ)酶切反應體系
重組質粒SacI xbaI 10×Buffer ddH2O Total3μg105U 210U 10μl 適量 100μl②37℃酶切3小時；③膠回收660bp的酶切片段；6、pCombHSS載體的制備于含15ng/ml Tet的10ml LB培養液中加入10μl pCombHSS/XL-1 Blue甘油菌，37℃搖床225rpm增菌過夜；按華舜生物技術有限公司的質粒抽提試劑盒純化pCombHSS質粒，并于BACKMAN UV600上測定質粒的含量與純度；7、pCombHSS質粒的雙酶切和較回收①酶切反應體系pCombHSS產物 speIxhoI 10×Buffer ddH2O Total30μg90U 300U 20μl 適量 200μl②37℃酶切3小時；③膠回收3500bp的酶切片段；8、pCombHSS與IgG(VH+CH1)的連接①連接反應體系pCombHSSIgG T4連接酶10×BufferddH2OTotal2μg0.7μg 5μl10μl 適量 200μl②16℃連接過夜；9、制備XL-1 Blue感受態細胞取XL-1 Blue甘油菌2μl接種于2ml LB培養基(tet)中，37℃，225rpm增菌過夜。取XL-1 Blue過夜菌2ml加到200ml LB中，37℃，225rpm增菌至OD600＝0.8～1.0，冰浴15分鐘，4℃，4000rpm離心20分鐘，棄盡培養基。將細胞懸浮于100ml預冷的10％甘油溶液中，4℃×4000rpm離心20分鐘，棄盡上清。將細胞懸浮于10ml預冷的10％甘油溶液中，4℃×4000rpm離心20分鐘，棄盡上清。用2ml 10％甘油溶液懸浮細胞，300μl/管分裝，-70℃貯存備用；10、連接產物的轉化和擴增100μl連接產電穿孔轉化到300μl感受態細胞中，加入3ml Soc培養基，37℃增菌1小時，轉種于100ml LB(Amp 20μg/ml，Tet 10μg/ml)增菌過夜。
11、重復步驟4～10完成抗體輕鏈基因的克隆；12、應用Help噬菌體(M13K07)完成表面展示文庫的構建；13、應用固相包被抗原(如dsDNA、Nmantigen和histone等)，對文庫進行4輪的重復篩選；14、可溶性表達的轉換純化載體切去gpIII基因片段，重新連接后轉化細胞；15、選取單克隆進行增菌表達，ELISA挑選陽性克隆；16、對陽性克隆進行載體轉換(自建的pBAD/dpp系統，已申請專利《人源片段抗體的pBAD表達系統》。申請日2003年4月8日，申請號03116231.2，
公開日2003年9月17日)；17、抗體的表達與純化pBAD/dpp系統載有his-tag，在表達后進行親和純化；18、抗體的全面鑒定與標記對抗體作生物活性、抗原親合力、基本結構與序列方面的鑒定；19、實體瘤動物模型的制備與抗體的初步藥學、藥物動力學研究應用核素標記抗體作瘤內注射、靜脈注射、肌肉注射，檢測抗體的抗原結合，組織闊清，細胞內滯留，殺瘤活性等；這里所述的全部的數名自身免疫病患者的抗體編碼基因文庫，包括正常與異常的IgG1和IgG3與輕鏈(κ，λ)隨機組合的若干種抗體中的數種抗細胞核組分的抗體。
權利要求
1.一種用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，該克隆是用以下方法制備得到的，該方法包括以下兩個主要步驟①構建人源自身抗體噬菌體表面呈現文庫；A.選擇供體與提取RNA；B.擴增與克隆抗體基因；C.應用Helper噬菌體，構建完成表面展示文庫；②從該文庫中篩選陽性克隆；A.應用固相包被抗原，對文庫進行多輪重復篩選；B.純化噬粒載體酶切去除gpIII基因片段，重新連接后轉化感受態菌進行可溶性表達；C.選取單克隆抗體進行增菌表達，再從中挑選陽性克隆。
2.根據權利要求1所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，所述的選擇的供體是自身免疫病患者，且其自身抗體的效價在1∶1,000以上。
3.根據權利要求2所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，所述的選擇的供體是患有多種自身免疫病的患者。
4.根據權利要求2所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，所述的選擇的供體數量是2～10個自身免疫病患者。
5.根據權利要求4所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，所述的選擇的供體數量是3～6個自身免疫病患者。
6.根據權利要求5所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，所述的選擇的供體數量是5個自身免疫病患者。
7.根據權利要求2～6任一項所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，所述的患者的自身抗體的效價在1∶10,000以上。
8.根據權利要求1所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，所述的提取RNA的方法是先提取高表達自身抗體的B淋巴細胞和漿細胞，再從中提取RNA。
9.根據權利要求8所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，所述的提取B淋巴細胞的方法是包括梯密度離心法中的一種。
10.根據權利要求8所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，所述的提取B淋巴細胞的方法是在梯密度離心法的基礎上，進一步采用分選方法提取B淋巴細胞。
11.根據權利要求10所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，所述的分選方法是包括通過抗原包被載體法或免疫磁珠分離細胞法中的一種。
12.根據權利要求11所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，所述的分選方法是免疫磁珠分離細胞法。
13.根據權利要求1～6、8～12任一項所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，所述的擴增與克隆抗體基因的方法是設計相應引物，分別擴增編碼抗體的重鏈Fv和C1基因以及輕鏈基因，分步克隆到pComb3載體系統。
14.根據權利要求7所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，所述的擴增與克隆抗體基因的方法是設計相應引物，分別擴增編碼抗體的重鏈Fv和C1基因以及輕鏈基因，分步克隆到pComb3載體系統。
15.根據權利要求1～6、8～12任一項所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，所述的重復篩選是3～6輪。
16.根據權利要求7所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，所述的重復篩選是3～6輪。
17.根據權利要求15所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，重復篩選是4輪。
18.根據權利要求16所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，重復篩選是4輪。
19.根據權利要求1～6、8～12任一項所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，所述的挑選陽性克隆的常規方法是包括酶聯免疫吸附分析法中的一種。
20.根據權利要求7所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆，其特征在于，所述的挑選陽性克隆的常規方法是包括酶聯免疫吸附分析法中的一種。
21.根據權利要求1～6、8～12任一項所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用。
22.根據權利要求7所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用。
23.根據權利要求21所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，該腫瘤壞死靶向抗體是用以下方法制備得到的，該方法包括以下兩個主要步驟①表達陽性克隆，得到表達產物；②純化表達產物。
24.根據權利要求22所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，該腫瘤壞死靶向抗體是用以下方法制備得到的，該方法包括以下兩個主要步驟①表達陽性克隆，得到表達產物；②純化表達產物。
25.根據權利要求23所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，所述的表達陽性克隆的方法是包括搖瓶或發酵方法中的一種。
26.根據權利要求24所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，所述的表達陽性克隆的方法是包括搖瓶或發酵方法中的一種。
27.根據權利要求23所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，所述的純化表達產物的方法是包括離子交換法、分子篩或親和純化法中的一種。
28.根據權利要求24所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，所述的純化表達產物的方法是包括離子交換法、分子篩或親和純化法中的一種。
29.根據權利要求27所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，所述的純化表達產物的方法是親和純化法。
30.根據權利要求28所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，所述的純化表達產物的方法是親和純化法。
31.根據權利要求21所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，該腫瘤壞死靶向抗體是用以下方法制備得到的，該方法包括以下兩個主要步驟①載體轉換陽性克隆；②表達與純化抗體。
32.根據權利要求22所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，該腫瘤壞死靶向抗體是用以下方法制備得到的，該方法包括以下兩個主要步驟①載體轉換陽性克隆；②表達與純化抗體。
33.根據權利要求31所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，所述的載體轉換陽性克隆的載體是包括pComb3載體系統或pBAD/dpp系統中的一種。
34.根據權利要求32所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，所述的載體轉換陽性克隆的載體是包括pComb3載體系統或pBAD/dpp系統中的一種。
35.根據權利要求33所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，所述的載體轉換陽性克隆的載體是pBAD/dpp系統。
36.根據權利要求34所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，所述的載體轉換陽性克隆的載體是pBAD/dpp系統。
37.根據權利要求31所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，所述的表達與純化抗體的方法是pBAD/dpp系統載有his-tag，陽性株在誘導表達后應用Qiagen的his-tag純化系統進行親和純化。
38.根據權利要求32所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，所述的表達與純化抗體的方法是pBAD/dpp系統載有his-tag，陽性株在誘導表達后應用Qiagen的his-tag純化系統進行親和純化。
39.根據權利要求21所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，該腫瘤壞死靶向抗體采用全面鑒定與標記方法進行抗體質量的驗證。
40.根據權利要求22所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，該腫瘤壞死靶向抗體采用全面鑒定與標記方法進行抗體質量的驗證。
41.根據權利要求39所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，該腫瘤壞死靶向抗體的全面鑒定與標記方法是包括生物活性、抗原親合力、基本結構與序列方面的全面鑒定，用125I標記純化抗體進行細胞內核抗原結合活性測定與組織內代謝動力學測定。
42.根據權利要求40所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，該腫瘤壞死靶向抗體的全面鑒定與標記方法是包括生物活性、抗原親合力、基本結構與序列方面的全面鑒定，用125I標記純化抗體進行細胞內核抗原結合活性測定與組織內代謝動力學測定。
43.根據權利要求41所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，該腫瘤壞死靶向抗體的生物活性是通過制備實體瘤荷瘤動物模型進行測定的。
44.根據權利要求42所述的用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆在制備腫瘤壞死靶向抗體中的應用，其特征在于，該腫瘤壞死靶向抗體的生物活性是通過制備實體瘤荷瘤動物模型進行測定的。
全文摘要
本發明涉及用于篩選腫瘤壞死靶向抗體的克隆及其制備方法和用途。選擇合適的自身免疫病患者，提取高表達自身抗體的B淋巴細胞和漿細胞，提取RNA，擴增與克隆抗體基因，應用Helper噬菌體構建表面展示文庫，多輪重復篩選該文庫，酶切去除gpIII基因片段，重新連接后轉化感受態菌進行可溶性表達，選取單克隆抗體進行增菌表達，挑選出陽性克隆；該克隆能夠用于篩選腫瘤壞死靶向抗體。本發明所選的供體合適，其自身抗體效價高，獲得陽性克隆的幾率高，且能同時獲取多個克隆；還能進一步得到一種新的人源性抗體，該抗體無需人源化處理，使該抗體的生產成本大幅度降低，是一種操作簡單易用、能快速產業化的實用方法。
文檔編號C12N15/11GK1584028SQ20041002505
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月10日 優先權日2004年6月10日
發明者韓煥興, 倪健, 楊子義, 何瑋 申請人:上海富純中南生物技術有限公司