專利名稱：一種脂肪來源干細胞向脂肪細胞誘導分化的方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體地說是涉及將來自脂肪組織的干細胞在體外向脂肪細胞定向誘導分化，并將誘導分化的細胞作為種子細胞用于組織工程脂肪組織的構建，制備彌補軟組織凹陷、組織修復以及正常組織的填充物。
背景技術：
對于軟組織凹陷、組織修復及正常組織的填充，最初人們利用吸脂術提取出來的脂肪顆粒細胞進行修復移植，但沒有取得理想的效果。植入的脂肪細胞多數很快壞死、液化和吸收(Ellenbogen R.1990)。這是由于成熟的脂肪細胞胞漿中80％～90％是由脂滴組成，容易受機械損傷導致細胞活性的喪失。此外，成熟的脂肪細胞是一種終末分化的細胞，不能夠在體內有效的增殖發育。
近來研究發現，人體組織內具有一類能夠不斷自我更新和增殖，具有多向分化潛能的細胞群體——干細胞。它能夠在體外培養、增殖并且分化成不同的組織細胞。有證據表明(Zuk P.A，2001)分離自經膠原酶處理后的脂肪組織的基質-血管部分含有大量的前脂肪細胞，或傾向于分化為脂肪細胞的干細胞。這些細胞能以較低的頻率自發地分化為脂肪細胞，在脂肪促進劑(如地塞米松，IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)等)的作用下，可提高這些細胞的分化效率。他們很容易從脂肪組織獲取，能夠在體外大規模培養和擴增，性質穩定，機械抵抗力強。它們在體外適當的培養環境或體內固有的微環境下能夠被誘導分化為脂肪和血管內皮等組織。誘導分化的細胞不僅可用于組織工程化脂肪組織的構建，并且與脂肪顆粒相比，在面部皮下凹陷性缺損或畸形的修復、身體其他部位軟組織凹陷的填充、生殖器的改型塑造填充，膨體、硅膠片、人工骨粉填充后殘留部分凹陷的矯正及美容中具有更大的應用前景。
發明內容
本發明提供了來源于脂肪組織的干細胞分化為脂肪細胞的方法和組合物，誘導分化后的細胞群可用于面部皮下凹陷性缺損或畸形的修復、身體其他部位軟組織凹陷的填充、生殖器的改型塑造填充，還可以用于膨體、硅膠片、人工骨粉填充后仍留存少部分凹陷的矯正及美容等。
本發明是通過以下技術方案實現的(1)脂肪組織來源的干細胞的分離培養1)人類脂肪組織可通過任何適當的方法如手術或脂肪抽吸術而獲得。脂肪抽吸術是目前應用最為普遍的方法，因此脂肪抽吸物是本發明細胞的一個特別優選來源。
2)獲取的脂肪組織以生理學相容性溶液諸如磷酸緩沖液沖洗，隨后在脂肪組織中加入緩沖液，攪拌并放置至澄清，以除去損傷組織、血液和紅細胞等。
3)用蛋白水解酶(例如膠原酶、分散酶、胰蛋白酶等)水解方法解離組織，此類酶可減弱或破壞細胞間的結合，從脂肪結締組織基質中釋放出游離的脂肪細胞。由于成熟脂肪細胞的密度較低，通常浮在等滲緩沖溶液的上層，脂肪組織來源的干細胞將沉淀到溶液下層，而中間層則包括結締組織基質和脂肪細胞聚集體。
4)使用平衡密度離心方法分離得到富含脂肪組織來源的干細胞群體的部分(下層)。
5)用磷酸緩沖液懸浮沉淀的細胞，通過加入高張鹽溶液保溫及加入紅細胞裂解液等方法破壞并除去殘留的紅細胞。懸浮的細胞可經過一次或連續多次(2～3次)的洗滌，再離心和重懸浮以獲得更高的純度。或者，這些細胞可通過使用流式細胞儀分選或根據細胞的大小和基粒的有無進行分離，干細胞較小并相對無基粒。
6)最終的分離和重懸浮之后，用標準的細胞培養基進行擴大培養，以增加干細胞的數量。常用的標準培養基如添加5％～15％(例如10％)血清(包括胎牛血清，馬血清等)的DMEM(Dulbeccos modified Eagle medium)或者D/F12培養基。培養傳代的細胞形態如附圖1所示。
(2)脂肪組織來源的干細胞表面標志的鑒定取第5代培養擴增的脂肪組織來源的干細胞，胰酶消化收集細胞，離心。以PBS洗滌細胞2～3次后，用1ml PBS重懸細胞，計數。用PBS調整細胞濃度為1×106個/ml，按5×105個細胞/管將細胞平均分至多個EP管中，分別將PE或FITC標記的多個抗體進行組合，加入各管中，室溫下孵育20～30min，然后用PBS洗2遍，加入0.5ml PBS重懸細胞后，用流式細胞儀對培養擴增細胞的表面標志進行檢測和鑒定。
(3)脂肪組織來源的干細胞的成脂肪誘導分化1)將擴增的脂肪組織來源的干細胞應用誘導分化的限定培養基進行誘導分化。
2)誘導脂肪組織發生的培養基可以是含有糖皮質激素(例如，異丁基-甲基黃嘌呤、地塞米松、氫化可的松、可的松等等)、胰島素、一種提高細胞內cAMP水平的化合物(例如二丁縮醛-cAMP、8-溴-cAMP、毛喉素等)，和/或一種抑制cAMP降解的化合物(例如，一種磷酸二酯酶抑制劑，如甲基異丁基黃嘌呤、消炎痛，及其它類似物)以及其他一些物質。例如一種誘導方案是DMEM，10％FBS，1μM地塞米松，10μM胰島素，200μM引哚美辛，1％鏈霉素/青霉素劑，0.5mM IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)，泛酸鹽，生物素。
應用本發明方法所獲得的含有脂肪干細胞、脂肪細胞的細胞群體可應用于組織工程化脂肪組織的構建，制備彌補軟組織凹陷和組織修復的填充物以及制備用于美容的正常組織填充物。
本發明是將脂肪來源的干細胞在體外向脂肪細胞定向誘導分化后，將誘導分化的細胞群用于組織工程化脂肪組織的構建，面部皮下凹陷性缺損或畸形的修復、身體其他部位軟組織凹陷的填充、生殖器的改型塑造填充，還可以用于膨體、硅膠片、人工骨粉填充后仍留存少部分凹陷的矯正及美容等。因此，市場價值潛力巨大，具有廣闊的應用前景。
圖1第二代脂肪組織來源的干細胞形態學觀察(×100倍)。
圖2脂肪組織來源干細胞的流式分析(1)FITC陰性對照；(2)CD90表達陽性；(3)CD45表達陰性；(4)CD44表達陰性；(5)CD71表達陽性；(6)CD16表達陰性；(7)CD30表達陰性；(8)PE陰性對照；(9)CD34表達陰性；(10)CD29表達陽性；(11)CD3表達陰性；(12)CD11b表達陰性；(13)CD133表達陰性；(14)CD19表達陰性。
圖3脂肪組織來源干細胞的向脂肪細胞分化a成脂誘導培養兩周，細胞內充滿脂質的液泡呈油紅O染色陽性；b成脂誘導一周的細胞中充滿脂質的小滴(×100倍)；c成脂誘導二周細胞充滿脂質的小滴(×200倍)。
具體實施例方式
實施例1脂肪組織來源干細胞的體外分離和培養擴增用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)反復沖洗吸脂手術得到的吸出物，隨后在其中加入PBS，攪拌并放置至澄清，以除去損傷組織、血液和部分紅細胞等，然后加入濃度約為0.1％的膠原酶，輕輕攪拌下37℃消化45分鐘。1500轉離心5分鐘，收集細胞沉淀物，并將沉淀懸浮于紅細胞裂解液(Tris-NH4Cl)中，室溫靜置10分鐘后，再次離心收集細胞。如此反復處理兩次，以盡可能地破碎并除去紅細胞。細胞懸液離心收集下層細胞沉淀物，然后使用溴酚蘭染料排除法檢測細胞的存活率并計數活細胞的比例。
存活細胞在含10％胎牛血清的標準DMEM培養基中37℃、5％CO2培養。當細胞達到約80％匯合時，傳代培養，培養基為含10％胎牛血清的標準DMEM培養基，37℃、5％CO2培養。培養至細胞形成單層后用0.25％的胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化解離單層并收集游離的細胞，準備用于分化培養基中進行干細胞定向分化培養。
實施例2脂肪組織來源干細胞表面標志鑒定取第5代培養擴增的脂肪組織來源的干細胞，0.25％胰酶消化收集細胞，離心。以PBS洗滌細胞2次后，用1ml PBS重懸細胞，計數。用PBS調整細胞濃度為1×106個/ml，按5×105個細胞/管將細胞平均分至多個EP管中，分別將PE或FITC標記的多個抗體(CD90、CD44、CD45、CD71、CD16、CD30、CD34、CD29、CD3、CD11b、CD133和CD19)進行組合，加入各管中，室溫下孵育30min，然后用PBS洗2遍，加入0.5ml PBS重懸細胞后，用流式細胞儀對培養擴增細胞的表面標志進行檢測和鑒定。結果顯示，脂肪組織來源的干細胞，CD90、CD29和CD71表達陽性，說明其是間質來源的一類具有干細胞性質的細胞(見圖2)。
實施例3脂肪組織來源干細胞向脂肪細胞的定向誘導分化及應用使用含有10％FBS，1μM地塞米松，10μM胰島素，200μM引哚美辛，1％青霉素/鏈霉素，0.5mM IBMX的DMEM培養基在常規條件(37℃，5％CO2)下對脂肪組織來源干細胞繼續培養。培養7～15天后，取誘導培養的細胞克降，甲醇固定2min，50％酒精漂洗，加入油紅O染料染色10min，50％酒精漂洗后，用水沖洗，蘇木精復染1min，鏡下觀察染色情況，呈油紅O染色陽性，表明細胞內有脂質小泡存在，根據這一特征可判定干細胞已出現向成熟脂肪細胞分化的趨勢。將未分化的或部分向脂肪細胞分化的脂肪組織來源的干細胞單獨注射或手術方式植入到接受治療的區域如臉頰、嘴唇等部位以除皺和/或美容。還可將未分化的或部分向脂肪細胞分化的脂肪組織來源的干細胞注射植入需要改變的有缺陷的受區內，以改變完善受區的形態。常見的有面部皮下凹陷性缺損或畸形的修復、身體其他部位軟組織凹陷的填充、生殖器的改型塑造填充，還可以用于膨體、硅膠片、人工骨粉填充后仍留存少部分凹陷的矯正。
權利要求
1.一種脂肪來源干細胞向脂肪細胞誘導分化的方法，其特征在于將脂肪來源的干細胞應用成脂分化培養基向脂肪細胞誘導分化。
2.根據權利要求1所述的脂肪來源干細胞向脂肪細胞誘導分化的方法，其特征在于所述的脂肪組織來源的干細胞其分離方法包括以下步驟(1)以磷酸緩沖液沖洗脂肪組織后，加入緩沖液，攪拌并放置至澄清，除去損傷組織、血液和紅細胞；(2)蛋白水解酶水解脂肪組織；(3)平衡密度離心，分離脂肪組織來源的干細胞群；(4)磷酸緩沖液重懸分離的細胞，加入高張鹽溶液保溫及加入紅細胞裂解液，破壞并除去殘留的紅細胞；(5)離心去除上清液，加入磷酸緩沖液重懸及離心洗滌，得到脂肪組織來源的干細胞。
3.根據權利要求1所述的脂肪來源干細胞向脂肪細胞誘導分化的方法，其特征在于用于誘導脂肪來源干細胞向成脂肪細胞分化的培養基可以是含有糖皮質激素(例如，異丁基-甲基黃嘌呤、地塞米松、氫化可的松、可的松等等)、胰島素、一種提高細胞內cAMP水平的化合物(例如二丁縮醛-cAMP、8-溴-cAMP、毛喉素等)，和/或一種抑制cAMP降解的化合物(例如，一種磷酸二酯酶抑制劑，如甲基異丁基黃嘌呤、消炎痛，及其它類似物)以及其他-些物質。
4.根據權利要求1所述的脂肪來源干細胞向脂肪細胞誘導分化的方法，其特征在于用于脂肪來源干細胞向成脂肪細胞分化的一種誘導方案可以是DMEM，10％FBS，1μM地塞米松，10μM胰島素，200μM引哚美辛，1％鏈霉素/青霉素劑，0.5mM IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)，泛酸鹽，生物素。
5.誘導分化后的脂肪細胞群的應用，其特征在于根據權利要求1所述方法得到的誘導分化后的脂肪細胞群可為工程化脂肪組織的制備提供種子細胞。
6.誘導分化后的脂肪細胞群的應用，其特征在于根據權利要求1所述方法得到的誘導分化后的脂肪細胞群可用于制備彌補面部皮下凹陷性缺損或畸形修復的填充物，常見的面部皮下凹陷性缺損或畸形如面部軟組織發育不良，面部手術或外傷導致的凹陷，單側或雙側顏面萎縮，顴、顳、額、眶區的凹陷，上唇過薄或人中過短，鼻唇溝過深，耳垂較小。
7.誘導分化后的脂肪細胞群的應用，其特征在于根據權利要求1所述方法得到的誘導分化后的脂肪細胞群可用于制備彌補身體其他部位軟組織凹陷的填充物，常見的身體其他部位軟組織凹陷如先天性乳房發育不良，哺乳后乳房萎縮，雙側乳房大小不對稱，乳頭凹陷畸形，臀部、大腿、小腿彎曲，吸脂術后的凹陷，手部軟組織萎縮。
8.誘導分化后的脂肪細胞群的應用，其特征在于根據權利要求1所述方法得到的誘導分化后的脂肪細胞群可用于制備生殖器的改型塑造填充物。
9.誘導分化后的脂肪細胞群的應用，其特征在于根據權利要求1所述方法得到的誘導分化后的脂肪細胞群可用于膨體、硅膠片、人工骨粉填充凹陷后，仍留存少部分凹陷的矯正。
10.誘導分化后的脂肪細胞群的應用，其特征在于根據權利要求1所述方法得到的誘導分化后的脂肪細胞群可用于美容，即可填充于正常組織，達到美容的目的。
全文摘要
本發明涉及生物醫學領域，具體地說是涉及將來自脂肪組織的干細胞在體外向脂肪細胞定向誘導分化的方法，利用此方法可提供大量的細胞，用于組織工程脂肪組織的構建，制備彌補軟組織凹陷、組織修復以及正常組織的填充物。應用本方法得到的脂肪細胞群，不僅可以用于面部皮下凹陷性缺損或畸形的修復、身體其他部位軟組織凹陷的填充、生殖器的改型塑造填充，還可以用于膨體、硅膠片、人工骨粉填充后仍留存少部分凹陷的矯正及美容。因此，市場價值潛力巨大，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N5/08GK1912110SQ20051008984
公開日2007年2月14日 申請日期2005年8月9日 優先權日2005年8月9日
發明者裴雪濤, 管利東, 王韞芳, 閆舫, 李紹青, 白慈賢, 岳慧敏, 南雪 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所