專利名稱：一種海洋黑曲霉生產耐鹽纖維素酶的固體發酵方法
技術領域：
本發明涉及一種海洋黑曲霉生產耐鹽纖維素酶的固體發酵方法。
背景技術：
纖維素物質生產生物基產品具有廣闊的前景。自然界存在大量的纖維素物質資 源，如玉米秸稈、稻草秸稈、小麥秸稈、油菜秸稈等。這些物質含有的豐富的纖維素 被降解后可以獲得可發酵的糖類-葡萄糖，利用葡萄糖可以生產大量的生物基產品，如 生物乙醇、丁醇、檸檬酸、乳酸、單細胞蛋白等。特別是利用纖維素物質生產生物能 源-氫氣和乙醇等可以緩解日益緊張的能源壓力，具有非常廣闊的前景。纖維素物質被利用的關鍵步驟是將其轉化為可發酵性的糖類。通常有兩類方法 可以降解纖維素化學裂解法和生物酶法降解法。化學裂解法的主要缺點在于成本高、 污染環境等，而生物酶降解纖維素物質則具有效率高、條件溫和等優勢。纖維素酶除了 擁有生物酶的效率高、條件溫和的特點外，還具有最適宜工業化大規模應用的優勢。生 產纖維素酶的成本較低，是降解纖維素的一個最好的選擇。因此獲得高活力、高穩定 性、耐受性強的纖維素酶成為酶降解纖維素的關鍵。生產纖維素酶的微生物多種多樣，有細菌、真菌、放線菌等，目前基本上均為 陸生微生物。最近有報道稱有人開始已經用海洋細菌和酵母菌來生產纖維素酶，但沒 有見到有用海洋霉菌來生產纖維素酶的報道。用陸生微生物生產的纖維素酶，其穩定性 和環境耐受性一般都不是特別理想，而纖維素植物的降解一般均需要在粗狂的條件下進 行，其纖維素降解效率常受到限制，因此有必要篩選性能更優異的菌株生產出酶活高、 穩定性和環境耐受性好的纖維素酶。海洋微生物由于其環境所致，具有不同于陸生微生物的獨特性能。海洋微生 物的種類繁多，現有的研究已經表明，海洋微生物的種類占了地球微生物種類的80%以 上，遠遠多于已經得到的陸生微生物數量。海洋寡養、高鹽的獨特環境為孕育出顯著不 同于陸生微生物特性的微生物提供了一個特殊的環境。生活在寡養環境的微生物往往具 有降解大分子物質成為自身可利用的營養物質的酶系，纖維素的降解為可利用的糖類是 寡養環境里的微生物采用的有效獲取營養的主要方式，因此海洋微生物是篩選產纖維素 酶的優異菌株的一個理想選擇。已經從海洋中篩選出產纖維素酶的微生物，主要集中于 細菌、酵母菌，而具有酶系豐富、表達量高、分泌能力強的霉菌卻鮮見報道。在我國沿海地帶，有許多植被在近海大量生長繁殖，如水葫蘆、互花米草等， 由于其含有大量的鹽份，不能相其它纖維素物質那樣被廣泛的應用，因此被大量廢棄。 廢棄的物質又腐爛造成環境的惡化和污染速度的急劇增加。鹽堿地的惡化和持續擴大， 在該類型區域內的植被生物量異常豐富，并且含有大量的纖維素。在鹽堿地內生長的植 被富含高鹽分，其有效合理的利用被大大局限，利用效率低下。篩選在高鹽環境下生長 和產生纖維素酶的真菌，是利用富含鹽分的纖維素物質資源的一個有效的方法。固體發酵具有液體發酵沒有的優勢菌絲能有效附著在固體發酵基質表面，提
3高發酵效率，比酶活高，設備單位體積生產能力高。因此固體發酵成為發酵生產工業化 的一個重要方向。該發明利用產酶能力高，分泌能力強的海洋黑曲霉固體發酵生產酶活 非常高的纖維素酶。從海洋中篩選出霉菌來生產纖維素酶，利用其適應高鹽環境的特 點，生產出具有高酶活、高環境耐受性的纖維素酶，以便用于比較粗狂條件下的纖維素 資源的降解。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種海洋黑曲霉生產耐鹽纖維素酶 的固體發酵方法。海洋黑曲霉生產耐鹽纖維素酶的固體發酵的方法包括如下步驟1)從東海近海10 20m深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉 (Aspergillussp),保藏于中國典型培養物保藏中心，地址為中國.武漢.武漢大學，保藏中 心保藏編號為CCTCCNO M201032 ；2)海洋黑曲霉接種于PDA培養基上，40°C下培養90h，得到斜面孢子，斜面孢 子保藏于4°C ；3)斜面孢子接種于PDA-1培養基，在40°C下培養90h，得到活化的孢子；4)60g茄子瓶斜面培養基裝入250ml茄子瓶后壓實成斜面，瓶口用8層紗布封 口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接種于茄子瓶斜面，42°C培養74h，得到擴培的茄子瓶 斜面孢子；5)400ml人工海水裝入500ml容量瓶內，放入滅菌鍋，在121°C，滅菌20min， 得到滅菌的人工海水，擴培得到的茄子瓶斜面孢子用滅菌的人工海水稀釋到108個孢子 /ml,接種于固體發酵產酶培養基，在250ml錐形瓶內，接種量0.1 0.7ml、起始pH 6.0 7.0、溫度42 44°C和發酵8 12天，得到纖維素酶。所述的PDA培養基的組成為葡萄糖20g和馬鈴薯200g添加水煮沸30 min三 層紗布過濾的濾液1L。所述的PDA-1培養基的組成為200g馬鈴薯經人工海水煮沸30min后的濾液 1L,葡萄糖 20g，人工海水的組成為NaC129.8g、MgS04 5.4g、KC1 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。所述的茄子瓶斜面培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgS04 5.4g、KC1 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。所述的固體發酵產酶培養基以質量比計的組成為稻草和麩皮10 25%， NH4C1 0.10 0.15%、NaCl 1.0 3.0%、Na2S04 0.05 1 %、其余為人工海水，稻草 和麩皮的質量比為3 2，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgS04 5.4g、KC10.73g、 MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。本發明與現有技術相比具有有益效果1)該海洋曲霉能在較高鹽濃度下生產纖維素酶，酶活在高鹽環境下較穩定；為 富含鹽的纖維素資源提供新的途徑；2)培養基簡單、價廉；
3)該海洋黑曲霉固體生產纖維素酶，得到適宜海洋微生物的獨有液體發酵工 藝。液體發酵的工藝粗放，酶活非常高；4)培養過程簡單，易于控制和放大；5)設備利用率高，成本較低。
圖1海洋真菌的孢囊在顯微鏡下的照片；圖2海洋真菌的菌絲在顯微鏡下的照片。
具體實施例方式本發明采用的PDA培養基的組成為葡萄糖20g和馬鈴薯200g添加水煮沸 30min三層紗布過濾的濾液1L。PDA-1培養基的組成為200g馬鈴薯經人工海水煮沸30min后的濾液1L，葡萄 糖 20g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgS04 5.4g、KC1 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、 CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。茄子瓶斜面培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液130ml， 葡萄糖7 9g，稻草粉70 90g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgS045.4g、KC1 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。固體發酵產酶培養基以質量比計的組成為稻草和麩皮10 25%，NH4C1 0.10 0.15%、NaCl 1.0 3.0%、Na2S04 0.05 1 %、其余為人工海水，稻草和麩皮的 質量比為 3 2，人工海水的組成為NaC129.8g、MgS04 5.4g、KC1 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。濾紙酶活(FPA)測定取50mg(lX6Cm)新華牌濾紙(杭州特種紙業有限公 司)，加入酶液0.5mL，再加入pH4.8的檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液2.5mL，60°C反應lh， 加入DNS終止反應，沸水浴5min顯色，測定A540。酶活力定義CMCase、BGase及 淀粉酶酶活，在上述反應條件下，每分鐘催化底物水解生成lPmol葡萄糖所需的酶量為 1個酶活力單位U。本發明采用從東海近海10 20m深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉 (Aspergillus sp.ZJUBE2010)，于2010年6月2日，保藏于中國典型培養物保藏中心，地 址為中國.武漢.武漢大學，保藏中心保藏編號為CCTCCNO M2010132 ；以下通過實施例對本發明作進一步的描述實施例11)從東海近海10m深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉；2)海洋黑曲霉接種于PDA培養基上，40°C下培養90h，得到斜面孢子，斜面孢 子保藏于4°C ；3)斜面孢子接種于PDA-1培養基，在40°C下培養90h，得到活化的孢子；4)60g茄子瓶斜面培養基裝入250ml茄子瓶后壓實成斜面，瓶口用8層紗布封 口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接種于茄子瓶斜面，42°C培養74h，得到擴培的茄子瓶 斜面孢子；
5)400ml人工海水裝入500ml容量瓶內，放入滅菌鍋，在121°C，滅菌20min， 得到滅菌的人工海水，擴培得到的茄子瓶斜面孢子用滅菌的人工海水稀釋到108個孢子/ ml,接種于固體發酵產酶培養基，在250ml錐形瓶內，接種量0.6ml、起始pH7.0、溫度 42°C和發酵10天，得到纖維素酶。所述的PDA培養基的組成為葡萄糖20g和馬鈴薯200g添加水煮沸30min三層 紗布過濾的濾液1L。所述的PDA-1培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgS04 5.4g、KC1 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。。所述的茄子瓶斜面培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖7g或9g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgS04 5.4g、 KC1 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。所述的固體發酵產酶培養基以質量比計的組成為稻草和麩皮(3 2)25%， NH4C10.15%, NaCl 3.0%, Na2S040.8%,人工海水(NaCl 29.8，MgS04 5.4，KC10.73， MgCl2.6H20 10.7，CaCl2 0.8306，蒸餾水 1.0L) 71.5%。經過不同茄子瓶斜面培養基擴培后，纖維素酶的濾紙酶活依次為20.5U/g〒a質或
21U/g干基質。以20 1(W/V)量的檸檬酸緩沖液體浸提固體基質中的纖維素酶，浸提的酶 液5000r/m，離心lOmin，上清液經過適當稀釋后得到用于測定的酶液，以上為待測酶液 的制備步驟。取50mg(lX6Cm)新華牌濾紙(杭州特種紙業有限公司)，加入待測酶液 0.5mL,再加入pH 4.8的檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液2.5mL，60°C反應lh，加入DNS終止 反應，沸水浴5min顯色，測定A540。酶活力定義，在上述反應條件下，每分鐘催化底 物水解生成1 P mol葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位U。實施例21)從東海近海10m深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉；2)海洋黑曲霉接種于PDA培養基上，40°C下培養90h，得到斜面孢子，斜面孢 子保藏于4°C ；3)斜面孢子接種于PDA-1培養基，在40°C下培養90h，得到活化的孢子；4)60g茄子瓶斜面培養基裝入250ml茄子瓶后壓實成斜面，瓶口用8層紗布封 口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接種于茄子瓶斜面，42°C培養74h，得到擴培的茄子瓶 斜面孢子；5)400ml人工海水裝入500ml容量瓶內，放入滅菌鍋，在121°C，滅菌20min， 得到滅菌的人工海水，擴培得到的茄子瓶斜面孢子用滅菌的人工海水稀釋到108個孢子/ ml,接種于固體發酵產酶培養基，在250ml錐形瓶內，接種量0.6ml、起始pH7.0、溫度 42°C和發酵10天，得到纖維素酶。所述的PDA培養基的組成為葡萄糖20g和馬鈴薯200g添加水煮沸30min三層 紗布過濾的濾液1L。所述的PDA-1培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgS04 5.4g、KC10.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 l.OL。所 述的茄子瓶斜面培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g或80g或90g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KC10.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0 L。所述的固體發酵產酶培養基以質量比計的組成為稻草和麩皮(3 2)25%， NH4Cl 0.15%, NaCl 3.0%, Na2SO4 0.8%,人工海水(NaCl 29.8，MgSO4 5.4，KC10.73， MgCl2.6H20 10.7，CaCl2 0.8306，蒸餾水l.OL) 71.5%。經過不同茄子瓶斜面培養基擴培 后，纖維素酶的濾紙酶活依次為19.8U/gT_、20.6U/gw> 21U/gTM。酶活測定同實 施例2實施例31)從東海近海IOm深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉；2)海洋黑曲霉接種于PDA培養基上，40°C下培養90h，得到斜面孢子，斜面孢 子保藏于4°C ；3)斜面孢子接種于PDA-I培養基，在40°C下培養90h，得到活化的孢子；4)60g茄子瓶斜面培養基裝入250ml茄子瓶后壓實成斜面，瓶口用8層紗布封 口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接種于茄子瓶斜面，42°C培養74h，得到擴培的茄子瓶 斜面孢子；5)400ml人工海水裝入500ml容量瓶內，放入滅菌鍋，在121°C，滅菌20min， 得到滅菌的人工海水，擴培得到的茄子瓶斜面孢子用滅菌的人工海水稀釋到IO8個孢子/ ml,接種于固體發酵產酶培養基，在250ml錐形瓶內，接種量0.6ml、起始pH7.0、溫度 42°C和發酵10天，得到纖維素酶。所述的PDA培養基的組成為葡萄糖20g和馬鈴薯200g添加水煮沸30min三層 紗布過濾的濾液1L。所述的PDA-I培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 l.OL。。所述的茄子瓶斜面培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 l.OL。所述的固體發酵產酶培養基以質量比計的組成為稻草和麩皮(3 2)10%或 15%或 20%或 25%，NH4Cl 0.15%, NaCl 3.0%, Na2SO4 0.8%,人工海水(NaC129.8， MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H20 10.7，CaCl2 0.8306，蒸餾水 l.OL) 71.5 %。經過不
同茄子瓶斜面培養基擴培后，纖維素酶的濾紙酶活依次為19.2U/gT基質、19.6U/gT基質、 20.2U/g干基質、2lU/g干基。酶活測定同實施例2實施例41)從東海近海IOm深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉；2)海洋黑曲霉接種于PDA培養基上，40°C下培養90h，得到斜面孢子，斜面孢 子保藏于4°C ；3)斜面孢子接種于PDA-I培養基，在40°C下培養90h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面培養基裝入250ml茄子瓶后壓實成斜面，瓶口用8層紗布封 口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接種于茄子瓶斜面，42°C培養74h，得到擴培的茄子瓶 斜面孢子；
5)400ml人工海水裝入500ml容量瓶內，放入滅菌鍋，在121°C，滅菌20min， 得到滅菌的人工海水，擴培得到的茄子瓶斜面孢子用滅菌的人工海水稀釋到IO8個孢子/ ml,接種于固體發酵產酶培養基，在250ml錐形瓶內，接種量0.6ml、起始pH7.0、溫度 42°C和發酵10天，得到纖維素酶。所述的PDA培養基的組成為葡萄糖20g和馬鈴薯200g添加水煮沸30min三層 紗布過濾的濾液1L。所述的PDA-I培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。。所述的茄子瓶斜面培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。所述的固體發酵產酶培養基以質量比計的組成為稻草和麩皮(3 2)25%， NH4Cl 0.05 % 或 0.10 % 或 0.15 %，NaCl 3.0%, Na2SO4 0.8%,人工海水(NaC129.8， MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H20 10.7，CaCl2 0.8306，蒸餾水 1.0L) 71.5 %。經過不
同茄子瓶斜面培養基擴培后，纖維素酶的濾紙酶活依次為17.2U/gT基質、18.3U/gT基質、 20.0U/g干基質、2lU/g干基質。酶活測定同實施例2實施例51)從東海近海IOm深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉；2)海洋黑曲霉接種于PDA培養基上，40°C下培養90h，得到斜面孢子，斜面孢 子保藏于4°C ；3)斜面孢子接種于PDA-I培養基，在40°C下培養90h，得到活化的孢子；4)60g茄子瓶斜面培養基裝入250ml茄子瓶后壓實成斜面，瓶口用8層紗布封 口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接種于茄子瓶斜面，42°C培養74h，得到擴培的茄子瓶 斜面孢子；5)400ml人工海水裝入500ml容量瓶內，放入滅菌鍋，在121°C，滅菌20min， 得到滅菌的人工海水，擴培得到的茄子瓶斜面孢子用滅菌的人工海水稀釋到IO8個孢子/ ml,接種于固體發酵產酶培養基，在250ml錐形瓶內，接種量0.6ml、起始pH7.0、溫度 42°C和發酵10天，得到纖維素酶。所述的PDA培養基的組成為葡萄糖20g和馬鈴薯200g添加水煮沸30min三層 紗布過濾的濾液1L。所述的PDA-I培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl20.8306g 和蒸餾水 1.0L。。所述的茄子瓶斜面培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 l.OL。所述的固體發酵產酶培養基以質量比計的組成為稻 草和麩皮(3 2)25%， 0.15%, NaCl 2.0%或 2.5%或 3.0%，Na2SO4 0.8%，人工海水(NaCl 29.8，MgS045.4， KCl 0.73，MgCl2.6H20 10.7，CaCl2 0.8306，蒸餾水 l.OL) 71.5%。經過不同茄子瓶斜面 培養基擴培后，纖維素酶的濾紙酶活依次為17.2U/gT_、17.3U/gT_、19.2U/gT基質、 21U/gWo酶活測定同實施例2實施例61)從東海近海IOm深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉；2)海洋黑曲霉接種于PDA培養基上，40°C下培養90h，得到斜面孢子，斜面孢 子保藏于4°C ；3)斜面孢子接種于PDA-I培養基，在40°C下培養90h，得到活化的孢子；4)60g茄子瓶斜面培養基裝入250ml茄子瓶后壓實成斜面，瓶口用8層紗布封 口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接種于茄子瓶斜面，42°C培養74h，得到擴培的茄子瓶 斜面孢子；5)400ml人工海水裝入500ml容量瓶內，放入滅菌鍋，在121°C，滅菌20min， 得到滅菌的人工海水，擴培得到的茄子瓶斜面孢子用滅菌的人工海水稀釋到IO8個孢子/ ml,接種于固體發酵產酶培養基，在250ml錐形瓶內，接種量0.6ml、起始pH7.0、溫度 42°C和發酵10天，得到纖維素酶。所述的PDA培養基的組成為葡萄糖20g和馬鈴薯200g添加水煮沸30min三層 紗布過濾的濾液1L。所述的PDA-I培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 l.OL。。所述的茄子瓶斜面培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 l.OL。所述的固體發酵產酶培養基以質量比計的組成為稻草和麩皮(3 2)25%， 0.15%, NaCl 3.0%, Na2SO4 0.05%或0.8%或 1.0% (w/w)，人工海水(NaC129.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H20 10.7，CaCl20.8306，蒸餾水 l.OL) 71.5%。經過不同茄子瓶斜 面培養基擴培后，纖維素酶的濾紙酶活依次為18.8U/g干麵、21U/g干麵、20.5U/g干基質。 酶活測定同實施例2實施例71)從東海近海IOm深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉；2)海洋黑曲霉接種于PDA培養基上，40°C下培養90h，得到斜面孢子，斜面孢 子保藏于4°C ；3)斜面孢子接種于PDA-I培養基，在40°C下培養90h，得到活化的孢子；4)60g茄子瓶斜面培養基裝入250ml茄子瓶后壓實成斜面，瓶口用8層紗布封 口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接種于茄子瓶斜面，42°C培養74h，得到擴培的茄子瓶 斜面孢子；
5)400ml人工海水裝入500ml容量瓶內，放入滅菌鍋，在121°C，滅菌20min， 得到滅菌的人工海水，擴培得到的茄子瓶斜面孢子用滅菌的人工海水稀釋到IO8個孢子/ ml,接種于固體發酵產酶培養基，在250ml錐形瓶內，接種量0.6ml、起始pH7.0、溫度 36°C或38°C或40°C或42°C和發酵10天，得到纖維素酶。 所述的PDA培養基的組成為葡萄糖20g和馬鈴薯200g添加水煮沸30min三層 紗布過濾的濾液1L。所述的PDA-I培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。。所述的茄子瓶斜面培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。所述的固體發酵產酶培養基以質量比計的組成為稻草和麩皮(3 2)25%， 0.15%，NaCl 3.0 %, Na2SO4 0.8 % (w/w),人工海水(NaCl 29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H20 10.7，CaCl2 0.8306，蒸餾水 1.0L) 71.5%。經過不同茄子瓶斜面培養 基擴培后，纖維素酶的濾紙酶活依次為18.0U/g干基質、18.8U/g干基質、20.5U/g干基質、2IU/ g^o酶活測定同實施例2實施例81)從東海近海IOm深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉；2)海洋黑曲霉接種于PDA培養基上，40°C下培養90h，得到斜面孢子，斜面孢 子保藏于4°C ；3)斜面孢子接種于PDA-I培養基，在40°C下培養90h，得到活化的孢子；4)60g茄子瓶斜面培養基裝入250ml茄子瓶后壓實成斜面，瓶口用8層紗布封 口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接種于茄子瓶斜面，42°C培養74h，得到擴培的茄子瓶 斜面孢子；5)400ml人工海水裝入500ml容量瓶內，放入滅菌鍋，在121°C，滅菌20min， 得到滅菌的人工海水，擴培得到的茄子瓶斜面孢子用滅菌的人工海水稀釋到IO8個孢子/ ml,接種于固體發酵產酶培養基，在250ml錐形瓶內，接種量分別為0.1ml或0.4ml或 0.6ml或0.7ml，起始pH7.0、溫度42°C，發酵10天，得到纖維素酶。所述的PDA培養基的組成為葡萄糖20g和馬鈴薯200g添加水煮沸30min三層 紗布過濾的濾液1L。所述的PDA-I培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。所述的茄子瓶斜面培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。所述的固體發酵產酶培養基以質量比計的組成為稻草和麩皮(3 2)25% (w/ w)，0.15% (w/w), NaCl 3.0%, Na2SO4 0.8 % (w/w),人工海水(NaC129.8，MgSO45.4，KCl 0.73，MgCl2.6H20 10.7，CaCl2 0.8306，蒸餾水 1.0L) 71.5%。經過不同茄子瓶斜 面培養基擴培后，纖維素酶的濾紙酶活依次為16.0U/g干基質、19.8U/g干基質、21U/g干基質、 20.1U/g^o酶活測定同實施例2實施例91)從東海近海IOm深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉；2)海洋黑曲霉接種于PDA培養基上，40°C下培養90h，得到斜面孢子，斜面孢 子保藏于4°C ；3)斜面孢子接種于PDA-I培養基，在40°C下培養90h，得到活化的孢子；4)60g茄子瓶斜面培養基裝入250ml茄子瓶后壓實成斜面，瓶口用8層紗布封 口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接種于茄子瓶斜面，42°C培養74h，得到擴培的茄子瓶 斜面孢子；5)400ml人工海水裝入500ml容量瓶內，放入滅菌鍋，在121°C，滅菌20min， 得到滅菌的人工海水，擴培得到的茄子瓶斜面孢子用滅菌的人工海水稀釋到IO8個孢子/ ml,接種于固體發酵產酶培養基，在250ml錐形瓶內，接種量0.6ml、起始pH 5.0或6.0 或7.0、溫度42°C和發酵10天，得到纖維素酶。所述的PDA培養基的組成為葡萄糖20g和馬鈴薯200g添加水煮沸30min三層 紗布過濾的濾液1L。所述的PDA-I培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。。所述的茄子瓶斜面培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。所述的固體發酵產酶培養基以質量比計的組成為稻草和麩皮(3 2)25% (w/ w)，0.15% (w/w), NaCl 3.0%, Na2SO4 0.8% (w/w),人工海水(NaC129.8，MgSO4 5.4， KCl 0.73，MgCl2.6H20 10.7，CaCl2 0.8306，蒸餾水 1.0L) 71.5%。經過不同茄子瓶斜面培養 基擴培后，纖維素酶的濾紙酶活依次為17.0U/gT_、19.8U/gT_、21U/gT_。酶活測定 同實施例2實施例101)從東海近海IOm深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉；2)海洋黑曲霉接種于PDA培養基上，40°C下培養90h，得到斜面孢子，斜面孢 子保藏于4°C ；3)斜面孢子接種于PDA-I培養基，在40°C下培養90h，得到活化的孢子；4)60g茄 子瓶斜面培養基裝入250ml茄子瓶后壓實成斜面，瓶口用8層紗布封 口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接種于茄子瓶斜面，42°C培養74h，得到擴培的茄子瓶 斜面孢子；5) 400ml人工海水裝入500ml容量瓶內，放入滅菌鍋，在121°C，滅菌20min， 得到滅菌的人工海水，擴培得到的茄子瓶斜面孢子用滅菌的人工海水稀釋到IO8個孢子/ ml,接種于固體發酵產酶培養基，在250ml錐形瓶內，接種量0.6ml、起始pH7.0、溫度42°C和發酵8天或10天或12天，得到纖維素酶。所述的PDA培養基的組成為葡萄糖20g和馬鈴薯200g添加水煮沸30min三層 紗布過濾的濾液1L。所述的PDA-I培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。。所述的茄子瓶斜面培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。所述的固體發酵產酶培養基以質量比計的組成為稻草和麩皮(3 2)25% (w/ w)，0.15% (w/w), NaCl 3.0%, Na2SO4 0.8% (w/w),人工海水(NaC129.8，MgSO4 5.4， KCl 0.73，MgCl2.6H20 10.7，CaCl2 0.8306，蒸餾水 1.0L) 71.5%。經過不同茄子瓶斜面培養 基擴培后，纖維素酶的濾紙酶活依次為20.0U/g干基質、21U/g干基質、19.8U/g干基質。酶活測 定 同實施例2實施例111)從東海近海IOm深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉；2)海洋黑曲霉接種于PDA培養基上，40°C下培養90h，得到斜面孢子，斜面孢 子保藏于4°C ；3)斜面孢子接種于PDA-I培養基，在40°C下培養90h，得到活化的孢子；4)60g茄子瓶斜面培養基裝入250ml茄子瓶后壓實成斜面，瓶口用8層紗布封 口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接種于茄子瓶斜面，42°C培養74h，得到擴培的茄子瓶 斜面孢子；5)400ml人工海水裝入500ml容量瓶內，放入滅菌鍋，在121°C，滅菌20min， 得到滅菌的人工海水，擴培得到的茄子瓶斜面孢子用滅菌的人工海水稀釋到IO8個孢子/ ml,接種于固體發酵產酶培養基，在250ml錐形瓶內，接種量0.6ml、起始pH7.0、溫度 42°C和發酵8天或10天或12天，得到纖維素酶。6)酶在高鹽環境下的穩定性測定。發酵一定時間的固體發酵產酶培養基加入20 倍的Ph4.5的檸檬酸緩沖液，在30°C浸提2h.浸提的液體濾紙過濾后5000r/m離心lOmin， 上清液為最終的待測酶液。酶液加入NaCl，在含有NaCl濃度為0%、4%, 6%, 8%, 10%的不同鹽濃度環境下，50°C水浴4h后測定濾紙酶活，把測定的4%、6%, 8%, 10%的鹽濃度環境下濾紙酶活與0%鹽濃度環境下的濾紙酶活的比值作為相對酶活。測定 的相對酶活依次為100%、100%, 100%, 100%。所述的PDA培養基的組成為葡萄糖20g和馬鈴薯200g添加水煮沸30min三層 紗布過濾的濾液1L。所述的PDA-I培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。。所述的茄子瓶斜面培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液 130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 l.OL。所述的固體發酵產酶培養基以質量比計的組成為稻草和麩皮(3 2)25% (w/ w)，0.15% (w/w), NaCl 3.0%, Na2SO4 0.8 % (w/w),人工海水(NaC129.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H20 10.7，CaCl2 0.8306，蒸餾水 l.OL) 71.5%。實施例12 1)從東海近海IOm深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉；2)海洋黑曲霉接種于PDA培養基上，40°C下培養90h，得到斜面孢子，斜面孢 子保藏于4°C ；3)斜面孢子接種于PDA-I培養基，在40°C下培養90h，得到活化的孢子；4)菌體海洋特性測定。為測定菌體是否具有典型的海洋特性-生長的最適鹽度 在1 % 3%之間。活化的孢子接入PDA-2培養基，PDA-2培養基的組成200g馬鈴薯 人工海水煮沸30min的濾液130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，蒸餾水1L。然后在去瓊脂 的PDA-I培養基中加入NaCL，使NaCL最終濃度為(W/W)、2% (W/W)、3% (W/ W)、4% (W/W), 250ml的三角瓶裝入去瓊脂的PDA-I培養基50ml，37°C, 150r/m,培 養24h，得到菌絲球的懸浮液5ml，該懸浮液5000r/m離心，去掉上清夜，60°C干燥至恒 重，稱量得到菌體的質量分別為0.128mg、0.148mg、0.203mg、0.156mg。
權利要求
1.一種海洋黑曲霉生產耐鹽纖維素酶的固體發酵方法，其特征在于包括如下步驟1)從東海近海10 20m深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉(Aspergillussp), 保藏于中國典型培養物保藏中心，地址為中國.武漢.武漢大學，保藏中心保藏編號為 CCTCC NO M2010132 ；2)海洋黑曲霉接種于PDA培養基上，40°C下培養90h，得到斜面孢子，斜面孢子保 藏于4°C ；3)斜面孢子接種于PDA-I培養基，在40°C下培養90h，得到活化的孢子；4)60g茄子瓶斜面培養基裝入250ml茄子瓶后壓實成斜面，瓶口用8層紗布封口，得 到茄子瓶斜面，活化的孢子接種于茄子瓶斜面，42°C培養74h，得到擴培的茄子瓶斜面孢 子；5)400ml人工海水裝入500ml容量瓶內，放入滅菌鍋，在121°C，滅菌20min，得到 滅菌的人工海水，擴培得到的茄子瓶斜面孢子用滅菌的人工海水稀釋到IO8個孢子/ml， 接種于固體發酵產酶培養基，在250ml錐形瓶內，接種量0.1 0.7ml、起始pH 6.0 7.0、溫度42 44°C和發酵8 12天，得到纖維素酶。
2.根據權利要求1所述的一種海洋黑曲霉生產耐鹽纖維素酶的固體發酵方法，其特征 在于所述的PDA培養基的組成為葡萄糖20g和馬鈴薯200g添加水煮沸30min三層紗布 過濾的濾液1L。
3.根據權利要求1所述的一種海洋黑曲霉生產耐鹽纖維素酶的固體發酵方法，其特征 在于所述的PDA-I培養基的組成為200g馬鈴薯經人工海水煮沸30min后的濾液1L， 葡萄糖 20g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。
4.根據權利要求1所述的一種海洋黑曲霉生產耐鹽纖維素酶的固體發酵方法，其特征 在于所述的茄子瓶斜面培養基的組成為200g馬鈴薯人工海水煮沸30min的濾液130ml， 葡萄糖7 9g，稻草粉70 90g，人工海水的組成為NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。
5.根據權利要求1所述的一種海洋黑曲霉生產耐鹽纖維素酶的固體發酵方法，其特 征在于所述的固體發酵產酶培養基以質量比計的組成為稻草和麩皮10 25%，NH4Cl 0.10 0.15%、NaCl 1.0 3.0%、Na2SO4 0.05 1 %、其余為人工海水，稻草和麩皮的 質量比為 3 2，人工海水的組成為NaC129.8g、MgS045.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H20 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸餾水 1.0L。
全文摘要
本發明公開了一種海洋黑曲霉生產耐鹽纖維素酶的固體發酵方法。包括如下步驟1)從東海近海10～20m深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉；2)海洋黑曲霉接種于PDA培養基上培養，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；3)斜面孢子接種于PDA-1培養基上培養，得到活化的孢子；4)活化的孢子接種于茄子瓶斜面，42℃培養74h，得到擴培的茄子瓶斜面孢子；5)擴培得到的茄子瓶斜面孢子用滅菌的人工海水稀釋到108個孢子/ml，接種于固體發酵產酶培養基，發酵8～12天，得到纖維素酶。本發明具有培養基粗狂、來源廣泛和價廉等特點，生產的纖維素酶可以在較高鹽含量的條件下降解纖維素，并且在高鹽環境下酶異常穩定，為該水解物的后續應用打下基礎。
文檔編號C12N9/42GK102010856SQ20101024226
公開日2011年4月13日 申請日期2010年7月30日 優先權日2010年7月30日
發明者劉杰鳳, 姚善涇, 林東強, 薛棟升 申請人:浙江大學