人aurka基因治療腫瘤的用途及其相關藥物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，具體公開了單獨的人AURKA基因；以及人AURKA基因與人EGFR基因作為協同施藥靶標，在制備或篩選腫瘤治療藥物中的用途。本發明還進一步構建了AURKA基因小干擾RNA、AURKA基因干擾慢病毒載體、AURKA基因干擾慢病毒，并公開了他們在與EGFR基因協同治療腫瘤中的用途。本發明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的慢病毒載體、慢病毒能夠特異性抑制人AURKA基因和/或人EGFR基因的表達，尤其是慢病毒，本發明的AURKA基因干擾慢病毒能單獨、或者與EGFR基因干擾慢病毒協同抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
【專利說明】人AURKA基因治療腫瘤的用途及其相關藥物
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體地涉及單獨的人AURKA基因；以及人AURKA基因和 人EGFR基因協同治療腫瘤的用途及其相關藥物。
【背景技術】
[0002] 目前腫瘤的基因治療已經取得了蓬勃快速的發展，但是迄今為止，仍然存在很多 需要解決的問題。目前用于腫瘤基因治療的基因太少，能抑制腫瘤生長的基因為數不多，急 需提供更多可利用的基因。另外，由于腫瘤的發生、發展、轉移等過程是一個多基因參與、涉 及多條信號通路的復雜網絡系統，因此單個基因治療或單一治療方法往往療效有限。因此， 未來基因治療發展的重點將在于挖掘并鑒定在臨床上有重要價值的基因，探索多個具有不 同抗腫瘤作用機理的基因聯合治療以及將多基因靶向藥物聯合治療等。
[0003] AURKA基因編碼一個進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是Aurora激酶家 族成員之一。在有絲分裂中，AURKA通過參與中心體的分離和成熟以及紡錘體兩極的 建立，確保有絲分裂中染色體的正確分離和胞質分裂的順利完成，在細胞周期中起著 重要作用。AURKA的異常擴增和/或高表達常見于多種人類腫瘤（KamadaK，Yamada Y， Hirao T, et al. Amplification/overexpression of Aurora-A in human gastric careinoma:Potential role in differentiated tyPe gastric eareinogenesis. Oncol Rep. 2004:12(3):593-599.)。近年來的研究表明，AURKA可參與多條重要的細胞信號通路， 作為激酶直接或間接地激活多種致癌蛋白、或使多種抑癌蛋白失活，從而推動腫瘤的發生 發展。有研究發現AURKA siRNA抑制HEP-2細胞中AURKA基因表達后，喉癌HEP-2細胞移植 瘤在裸鼠皮下的生長速度較對照組顯著下降，腫瘤接種后28天，腫瘤的平均重量也較對照 組顯著降低，說明AURKA基因沉默能抑制喉癌細胞在體內的生長。Hata和Tanaka的研究發 現，抑制胰腺癌和食管癌細胞株中的AURKA基因后，接種至裸鼠后形成的腫瘤明顯縮小甚 至完全抑制（Hata T，FurukawaT，Sunamura M，etal. RNA interference targeting aurora kinase a suppresses tumor growth and enhanees the taxane chemosensitivity in human Pancreatic cancer cells. Caneer Res. 2005;65(7) :2899-905. Tanaka E， Hashimoto Y，Ito T, etal. The suPPression of aurora-A/STK15/BTAK expression enhances chemosensitivity to docetaxel in human esophageal squamous cell carcinoma. Clin Caneer Res. 2007; 13 (4) : 1331-40.)，這些結果均提不 AURKA 高表達與體 內的成瘤能力顯著相關。因此，AURKA是腫瘤治療潛在的理想靶標。
[0004] 表皮生長因子受體（epidermalgrowth factor receptor，EGFR) EGFR 是一種跨膜 蛋白質，屬于ErbB受體家族成員，其配體（EGF、TGF-a等）與EGFR胞外段結合使之二聚 化，由此導致胞內段酪氨酸激酶活化以及一系列信號轉導的級聯反應，促進細胞增殖，血管 生成，轉移并抑制細胞凋亡(梁后杰，鄒嵐.EGFR靶向藥物治療晚期結直腸癌最新進展.中 國處方藥2009;84:58-61.)，從而導致腫瘤的發生。大量研究發現EGFR基因在多種腫瘤組 織中過表達或異常活化，從而使腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移能力增強。EGFR已成為經臨床 驗證的多種類型腫瘤的治療祀點（Ciardiello F, Tortora G. EGFR antagonists in cancer treatment. N Engl J Med2008;358:1160-1174. )〇
[0005] RNAi是利用雙鏈RNA介導的序列特異性的轉錄后基因沉默現象，已成為研究 基因功能的一種新興的有效手段，并有望成為腫瘤等疾病基因治療的工具（Izquierdo M.Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy.Cancer Gene Ther. 2005; 12(3) :217-27.)。慢病毒（Ientivirus)載體是高效的基因轉導工具，主要用于 感染對常規方法轉染效率較低的細胞，如原代細胞等。慢病毒顆粒可同時感染增殖和非增 殖的細胞，且感染比較穩定、持久。運用慢病毒載體，可實現特定基因的高表達，也可以表 達發夾結構 RNA (short hairpin RNA，shRNA)以 RNA 干擾（RNA interference，RNAi)方式 下調某基因的表達。本發明擬采用慢病毒介導的RNAi技術研究AURKA基因在與EGFR基因 協同抑制腫瘤細胞增殖中的功能，為惡性腫瘤的非手術臨床治療提供理論依據。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于公開了 AURKA基因作為癌癥治療的靶標，治療腫瘤的用途及其 相關藥物；以及將AURKA基因和EGFR基因共同作為癌癥治療的靶標，通過同時沉默AURKA 基因和EGFR基因的表達，實現協同治療腫瘤的用途，及其腫瘤治療藥物。
[0007] 本發明以RNA干擾為手段，研究了單獨的AURKA基因在腫瘤發生和發展中的作用， 以及，AURKA基因與EGFR基因在腫瘤發生和發展中的協同作用，公開了一種抑制或降低腫 瘤細胞生長、增殖、分化和/或存活的方法，該方法包括：向腫瘤細胞施用一種能夠特異性 抑制AURKA基因和/或EGFR基因的轉錄、翻譯，或能夠特異性抑制AURKA蛋白和/或EGFR 蛋白表達的活性的物質，以此來抑制腫瘤細胞的生長、增殖、分化或存活。
[0008] 本發明第一方面，公開了分離的人AURKA基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者 在制備腫瘤診斷藥物中的用途。
[0009] 本發明中，所述人AURKA基因作為針對腫瘤細胞的作用靶標應用于制備或篩選腫 瘤治療藥物，或者制備腫瘤診斷藥物。進一步的，所述針對腫瘤細胞的作用祀標為RNA干擾 作用靶標。
[0010] 所述將分離的人AURKA基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內容：其 一，將人AURKA基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于制備腫瘤治療藥物； 其二，將人AURKA基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于篩選腫瘤治療藥 物。
[0011] 所述將AURKA基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于制備腫瘤治 療藥物具體是指：將AURKA基因作為RNA干擾作用的靶標，來研制針對腫瘤細胞的藥物或制 齊U，從而提高或降低腫瘤細胞內AURKA基因的表達水平。
[0012] 所述將AURKA基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于篩選腫瘤治 療藥物具體是指：將AURKA基因作為作用對象，對藥物或制劑進行篩選，以找到可以抑制或 促進人AURKA基因表達的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如本發明所述的AURKA基因小分子 干擾RNA (SiRNA)即是以人AURKA基因為作用對象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細胞 增殖作用的藥物。除此之外，諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將AURKA基因及其蛋白作為 作用對象。
[0013] 所述將AURKA基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將AURKA基因表達產物作為一項 腫瘤診斷指標應用于腫瘤診斷藥物的制備。
[0014] 所述腫瘤治療藥物為能夠特異性抑制AURKA基因的轉錄或翻譯，或能夠特異性抑 制AURKA蛋白的表達或活性的分子，從而降低腫瘤細胞中AURKA基因的表達水平，達到抑制 腫瘤細胞的增殖、生長、分化和/或存活的目的。
[0015] 所述的腫瘤可以為其腫瘤細胞的增殖與人AURKA基因的表達相關的任意一種腫 瘤；更進一步的，為一種惡性腫瘤，例如選自：肺癌或結腸癌。
[0016] 本發明第一方面，還公開了分離的人AURKA基因和人EGFR基因在制備或篩選腫瘤 治療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中的用途。
[0017] 本發明中，所述人AURKA基因和人EGFR基因作為針對腫瘤細胞的作用靶標應用于 制備或篩選腫瘤治療藥物，或者制備腫瘤診斷藥物。進一步的，所述針對腫瘤細胞的作用靶 標為RNA干擾作用靶標。
[0018] 所述將分離的人AURKA基因和人EGFR基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩 方面的內容：其一，將人AURKA基因和人EGFR基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶 標應用于制備腫瘤治療藥物；其二，將人AURKA基因和人EGFR基因作為藥物或制劑針對腫 瘤細胞的作用靶標應用于篩選腫瘤治療藥物。
[0019] 所述將人AURKA基因和人EGFR基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應 用于制備腫瘤治療藥物具體是指：將AURKA基因和人EGFR基因共同作為RNA干擾作用的 靶標，研制能同時針對兩種基因的腫瘤治療藥物或制劑，從而提高或降低腫瘤細胞內AURKA 基因和人EGFR基因的表達水平；或者，將AURKA基因和人EGFR基因分別作為RNA干擾作 用的靶標，來研制分別針對兩種基因的腫瘤治療藥物，從而獲得能提高或降低腫瘤細胞內 AURKA基因和人EGFR基因表達水平的腫瘤治療藥物或制劑。
[0020] 所述將人AURKA基因和人EGFR基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應 用于篩選腫瘤治療藥物具體是指：將人AURKA基因和人EGFR基因同時作為作用對象，對藥 物進行篩選，以找到可以分別影響(抑制或促進)人AURKA基因表達的藥物和影響(抑制或促 進）人EGFR基因表達的藥物，然后作為腫瘤治療備選組合物藥物；或者找到可以同時影響 (抑制或促進）人AURKA基因和人EGFR基因表達的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如本發明 所述的AURKA基因小分子干擾RNA (siRNA)、基因干擾核酸構建體、慢病毒，以及EGFR基因 小分子干擾RNA (siRNA)、基因干擾核酸構建體、慢病毒，均是以AURKA基因和EGFR基因分 別為作用對象篩選獲得的；當它們共同使用時，存在協同作用的效果，比單一一種物質的使 用效果更好；可用作具有抑制腫瘤細胞增殖作用的藥物。除此之外，諸如抗體藥物，小分子 藥物等也可將人AURKA基因和人EGFR基因及其蛋白作為作用對象。
[0021] 所述將人AURKA基因和人EGFR基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將AURKA基因表 達產物和人EGFR基因表達產物作為腫瘤診斷指標應用于腫瘤診斷試劑的制備。
[0022] 本發明的所述腫瘤治療藥物為能夠特異性抑制人AURKA基因和/或人EGFR基因 的轉錄或翻譯，或能夠特異性抑制人AURKA基因和/或人EGFR基因的表達或活性的分子， 從而降低腫瘤細胞人AURKA基因和/或人EGFR基因的表達水平，達到抑制腫瘤細胞的增 殖、生長、分化、存活的目的。
[0023] 本發明制備或篩選的腫瘤治療藥物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂類、 小分子化學藥(例如抑制劑)、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。
[0024] 所述核酸分子包括但不限于：反義寡核苷酸、雙鏈RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸內 切酶ΠΙ制備的小干擾RNA (esiRNA)或者短發夾RNA (shRNA)。
[0025] 所述腫瘤治療藥物的施用量為足夠降低人AURKA基因和人EGFR基因的轉錄或翻 譯，或者足夠降低人AURKA蛋白和人EGFR蛋白的表達或活性的劑量。以使人AURKA基因和 人EGFR基因的表達至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
[0026] 本發明中，當人AURKA基因和人EGFR基因作為協同施藥靶標進行腫瘤治療和藥物 篩選時，是通過RNA干擾的方法，以人AURKA基因和EGFR基因作為RAN干擾的靶基因，降低 這兩個基因的表達水平。
[0027] 所述的腫瘤可以為其腫瘤細胞的增殖與人AURKA基因和人EGFR基因的表達相關 的任一種腫瘤；更進一步的，為一種惡性腫瘤，例如選自：肺癌或結腸癌。
[0028] 采用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法是通過單獨降低人AURKA基因的表達水 平抑制腫瘤細胞的增殖來達到治療的目的，或者通過同時降低人AURKA基因和人EGFR基 因的表達水平抑制腫瘤細胞的增殖來達到治療的目的。具體的，治療時，將能有效降低人 AURKA基因表達水平的物質；或者，將能有效降低人AURKA基因和人EGFR基因表達水平的 物質給藥于患者。
[0029] 本發明第二方面公開了一種降低腫瘤細胞中AURKA基因表達的分離的核酸分子， 所述核酸分子包含：
[0030] b) AURKA基因雙鏈RNA，所述AURKA基因雙鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與 AURKA基因雜交的核苷酸序列；或者
[0031] c) AURKA基因 shRNA，所述AURKA基因 shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與AURKA基 因雜交的核苷酸序列。
[0032] 較優的，所述AURKA基因雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈 互補共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列與AURKA基因的靶序列基本相同。
[0033] 較優的，所述AURKA基因 shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義 鏈片段和反義鏈片段的莖環結構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，并且所 述正義鏈片段的序列與AURKA基因的靶序列基本相同。
[0034] 更優的，所述shRNA的莖環結構的序列可選自以下任一 ：UUCAAGAGA、AUG、CCC、 UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0035] 更優的，所述AURKA基因的靶序列，為SEQ ID NO: 1所示序列。
[0036] 所述AURKA基因的靶序列即為siRNA用于特異性沉默AURKA基因表達時，與所述 siRNA互補結合的mRNA片段所對應的AURKA基因中的片段。
[0037] 所述雙鏈RNA第一鏈和第二鏈的長度均為15-27個核苷酸；較佳的，長度均為 19-23個核苷酸；最佳的，長度均為19、20或者21個核苷酸。
[0038] 進一步的，所述雙鏈RNA為小干擾RNA (siRNA)。
[0039] 最優的，AURKA基因小干擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID N0:9所示，具體為 5' -GAAAGCUCCACAUCAAUAA-3'。SEQ ID NO :9 所示的 AURKA 基因 siRNA 的第一鏈為以 SEQ ID NO: 1所示的序列為RNA干擾靶序列設計的針對人AURKA基因的小干擾RNA中的一條鏈， 該第一鏈與第二鏈組成的siRNA能夠起到特異性沉默腫瘤細胞中內源AURKA基因表達的作 用。
[0040] 最優的，所述AURKA基因 ShRNA的序列如SEQ ID NO: 11所示，具體為： 5, -caGAAAGCUCCACAUCAAUAA CUCGAGUUAUUGAUGUGGAGCUUUCUG-3，。
[0041] 本發明第三方面，公開了一種AURKA基因干擾核酸構建體，含有編碼前述分離的 核酸分子中的AURKA基因 shRNA的基因片段，能表達所述AURKA基因 shRNA。
[0042] 更優的，所述AURKA基因干擾核酸構建體為AURKA基因干擾慢病毒載體。
[0043] 所述AURKA基因干擾慢病毒載體是將編碼前述AURKA基因 shRNA的DNA片段克隆 入已知載體獲得，所述已知載體多為慢病毒載體，所述AURKA基因干擾慢病毒載體經過病 毒包裝成為有感染力的病毒顆粒后，感染腫瘤細胞，進而轉錄出所述shRNA，通過酶切加工 等步驟，最終獲得所述AURKA基因小干擾RNA，用于特異性沉默AURKA基因的表達。
[0044] 編碼所述AURKA基因 shRNA基因片段的DNA序列含有SEQ ID NO: 1所示序列及其 互補序列。
[0045] 進一步的，所述AURKA基因干擾慢病毒載體還含有啟動子序列和/或編碼腫瘤 細胞中可被檢測的標記物的核苷酸序列；較優的，所述可被檢測的標記物如綠色熒光蛋白 (GFP) 0
[0046] 進一步的，所述慢病毒載體可以選自：pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.1-CMV-Ne。、 pLKO.1-Ne。、 pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagYFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagRFP、 pLKO. l-pur〇-CMV-TagFP635、pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO. l-pur〇-UbC-TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-pur〇-IPTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAL 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-GW/lacZ 中的任一。
[0047] 本發明第四方面，公開了一種AURKA基因干擾慢病毒，由前述AURKA基因干擾核酸 構建體中的AURKA基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包 裝而成。
[0048] 本發明的慢病毒藥物可感染腫瘤細胞并產生針對AURKA基因的小分子干擾RNA， 從而抑制腫瘤細胞的增殖。該AURKA基因干擾慢病毒可用于制備預防或治療腫瘤的藥物。 [0049] 本發明第五方面，公開了一種用于治療肺癌或結腸癌的藥物組合物，其有效物質 含有前述降低腫瘤細胞中AURKA基因表達的分離的核酸分子、AURKA基因干擾核酸構建體、 AURKA基因干擾慢病毒中的至少一種。
[0050] 較優的，所述治療肺癌或結腸癌的藥物組合物，其有效成分還包括降低腫瘤細胞 中EGFR基因表達的分離的核酸分子、EGFR基因干擾核酸構建體、以及EGFR基因干擾慢病 毒中的至少一種。
[0051] 更優的，所述AURKA基因干擾核酸構建體為AURKA基因干擾慢病毒載體。
[0052] 進一步的，所述降低腫瘤細胞中EGFR基因表達的分離的核酸分子為：
[0053] I) EGFR基因雙鏈RNA，所述EGFR基因雙鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與EGFR 基因雜交的核苷酸序列；或者
[0054] 2) EGFR基因 shRNA，所述EGFR基因 shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與EGFR基因 雜交的核苷酸序列。
[0055] 優選的，所述EGFR基因雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈 互補共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列與EGFR基因的靶序列基本相同。
[0056] 優選的，所述EGFR基因 ShRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義 鏈片段和反義鏈片段的莖環結構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，并且所 述正義鏈片段的序列與EGFR基因的靶序列基本相同。
[0057] 更優選的，所述shRNA的莖環結構的序列可選自以下任一 ：UUCAAGAGA、AUG、CCC、 UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0058] 更優選的，所述EGFR基因的靶序列，為SEQ ID NO: 2所示序列。
[0059] 所述EGFR基因的靶序列即為siRNA用于特異性沉默EGFR基因表達時，與所述 siRNA互補結合的mRNA片段所對應的EGFR基因中的片段。
[0060] 所述雙鏈RNA第一鏈和第二鏈的長度均為15-27個核苷酸；較佳的，長度均為 19-23個核苷酸；最佳的，長度均為19、20或者21個核苷酸。
[0061] 進一步的，所述雙鏈RNA為小干擾RNA (siRNA)。
[0062] 最優選的，EGFR基因小干擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO :10所示，具體為 5' -GGCUGGUUAUGUCCUCAUU-3'。SEQ ID NO :10 所示的 EGFR 基因 siRNA 的第一鏈為以 SEQ ID NO: 2所示的序列為RNA干擾靶序列設計的針對人EGFR基因的小干擾RNA中的一條鏈， 該第一鏈與第二鏈組成的siRNA能夠起到特異性沉默腫瘤細胞中內源EGFR基因表達的作 用。
[0063] 最優選的，所述EGFR基因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 12所示，具體為： 5, -GUGGCUGGUUAUGUCCUCAUUCUCGAG AAUGAGGACAUAACCAGCCAC-3，。
[0064] 當用作治療腫瘤的藥物時，是將安全有效量的雙鏈RNA、shRNA、或慢病毒施用于哺 乳動物。具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之 內的。
[0065] 較優的，所述EGFR基因干擾核酸構建體為含有編碼前述EGFR基因 shRNA的基因 片段，能表達所述EGFR基因 shRNA。
[0066] 更優的，所述EGFR基因干擾核酸構建體為EGFR基因干擾慢病毒載體。
[0067] 優選的，所述EGFR基因干擾慢病毒由EGFR基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質 粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝而成。
[0068] 更優的，所述EGFR基因干擾慢病毒載體含有編碼前述分EGFR基因 shRNA的基因 片段，能表達所述EGFR基因 shRNA。
[0069] 編碼所述EGFR基因 shRNA基因片段的DNA序列含有SEQ ID NO: 2所示序列及其 互補序列。
[0070] 本發明的藥物組合物中，特異性沉默AURKA基因表達，以及特異性沉默EGFR基因 表達的有效成分發揮了協同治療的作用；本發明實施例記載，雙基因敲減后的癌細胞生長 抑制率明顯大于單基因敲減組的加和，表明特異性沉默AURKA基因表達的物質與特異性沉 默EGFR基因表達的物質協同抑制腫瘤細胞的增殖。
[0071] 進一步的，本發明所述藥物或藥物組合物含有1?99wt%所述小干擾RNA、shRNA、 基因干擾核酸構建體和/或基因干擾慢病毒，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0072] 制備藥物時，通常將有效成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或 藥囊形式存在的載體中。當賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為 賦形劑、載體或活性成分的介質。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅 菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶 纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水等。制劑還可包括：濕潤劑、乳化劑、防腐劑（如羥基苯 甲酸甲酯和丙酯）、甜味劑等。
[0073] 本發明的有益效果為：本發明提供的SiRNA或者包含該小干擾RNA序列的核酸構 建體、慢病毒能夠特異性抑制人AURKA基因的表達，尤其是慢病毒，能單獨，或者與EGFR靶 向慢病毒協同抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。本發 明中的AURKA基因即可以作為單獨的腫瘤治療靶標，也可以作為EGFR基因協同治療靶標， 在腫瘤治療中具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0074] 圖 I :GV115 質粒 DNA 圖譜
[0075] 圖 2 :GV113 質粒 DNA 圖譜
[0076] 圖3 :AURKA shRNA質粒鑒定圖
[0077] 1# :陰性對照（ddH20) ;2# :陰性對照（空載自連對照組）
[0078] 3# :Marker 自上而下依次為 5kb，3kb，2kb，I. 5kb，lKb，750bp，500bp，250bp，IOObp
[0079] 4# ?8# :AURKA shRNAl-5 號轉化子鑒定
[0080] 圖4 :EGFR shRNA質粒鑒定圖
[0081] 1# :陰性對照（ddH20)
[0082] 2# :陰性對照（空載自連對照組）
[0083] 3# :Marker 自上而下依次為 5kb，3kb，2kb，I. 5kb，lKb，750bp，500bp，250bp，IOObp
[0084] 4# ?8# :EGFR shRNAl-5 號轉化子鑒定
[0085] 圖5 :AURKA shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒同時浸染人肺癌H1299細胞5天 后，顯著抑制細胞增殖
[0086] 圖6 :AURKA shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒同時浸染人結腸癌RKO細胞5天 后，顯著抑制細胞增殖
【具體實施方式】
[0087] 下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，實施例僅用于說明本發明，而非限制 本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規條 件，如[美]Sambrook. J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京：科學出版社 2002中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。
[0088] 實施例1針對人AURKA基因和EGFR基因 RNAi慢病毒的制備
[0089] 1.慢病毒載體構建
[0090] 1)構建針對人AURKA基因和EGFR基因的慢病毒載體
[0091] 從 Genbank 調取 AURKA (NM_177990)和 EGFR 基因（NM_201282)信息；利用上海吉 凱基因化學技術有限公司的設計軟件Genechem設計針對AURKA基因和EGFR基因的有效的 siRNA靶點。初步篩選得到具有明顯抑制AURKA基因表達功能的siRNA靶點序列（SEQ ID NO. 1)和明顯抑制EGFR基因表達功能的siRNA靶點序列（SEQ ID NO. 2)。通過Genbank數 據庫進行BLAST分析，確定其不對任何其它基因產生干擾作用。
[0092] 表IsiRNA靶點序列
【權利要求】
1. 分離的人AURKA基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中的用 途。
2. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述人AURKA基因作為針對腫瘤細胞的作用 靶標應用于制備或篩選腫瘤治療藥物，或者制備腫瘤診斷藥物。
3. 如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述針對腫瘤細胞的作用靶標為RNA干擾作 用靶標。
4. 分離的人AURKA基因和人EGFR基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診 斷藥物中的用途。
5. -種降低腫瘤細胞中AURKA基因表達的分離的核酸分子，所述核酸分子包含： a) AURKA基因雙鏈RNA，所述AURKA基因雙鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與AURKA基 因雜交的核苷酸序列；或者 b) AURKA基因 shRNA，所述AURKA基因 shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與AURKA基因雜 交的核苷酸序列。
6. 如權利要求5所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述AURKA基因雙鏈RNA包含第 一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序 列與AURKA基因的靶序列基本相同；所述AURKA基因 shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段， 以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環結構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的 序列互補，并且所述正義鏈片段的序列與AURKA基因的靶序列基本相同。
7. 如權利要求6所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述AURKA基因的靶序列為SEQ ID NO: 1所示序列。
8. 如權利要求5-7任一權利要求所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述雙鏈RNA為 小干擾RNA，并且AURKA基因小干擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO :9所示；所述AURKA基 因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 11所示。
9. 一種AURKA基因干擾核酸構建體，含有編碼權利要求5-8任一權利要求所述分離的 核酸分子中的AURKA基因 shRNA的基因片段，能表達所述AURKA基因 shRNA。
10. 如權利要求9所述的核酸構建體，其特征在于，所述AURKA基因干擾核酸構建體為 AURKA基因干擾慢病毒載體。
11. 一種AURKA基因干擾慢病毒，由權利要求10所述AURKA基因干擾核酸構建體中的 AURKA基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝而成。
12. -種治療肺癌或結腸癌的藥物組合物，其有效成分含有權利要求5-8任一權利要 求所述降低腫瘤細胞中AURKA基因表達的分離的核酸分子、權利要求9-10任一權利要求所 述AURKA基因干擾核酸構建體、以及權利要求11所述AURKA基因干擾慢病毒中的至少一 種。
13. 如權利要求12所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物的有效成分還包 括降低腫瘤細胞中EGFR基因表達的分離的核酸分子、EGFR基因干擾核酸構建體、以及EGFR 基因干擾慢病毒中的至少一種。
14. 如權利要求13所述的藥物組合物，其特征在于，所述降低腫瘤細胞中EGFR基因表 達的分尚的核酸分子為： 1. EGFR基因雙鏈RNA，所述EGFR基因雙鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與EGFR基因 雜交的核苷酸序列；或者 2. EGFR基因 shRNA，所述EGFR基因 shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與EGFR基因雜交 的核苷酸序列； 所述EGFR基因干擾核酸構建體為含有編碼前述EGFR基因 shRNA的基因片段，能表達 所述EGFR基因 shRNA ; 所述EGFR基因干擾慢病毒由EGFR基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系 的輔助下，經過病毒包裝而成；所述EGFR基因干擾慢病毒載體含有編碼前述分EGFR基因 shRNA的基因片段，能表達所述EGFR基因 shRNA。
【文檔編號】C12N15/113GK104225617SQ201310230959
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月9日 優先權日:2013年6月9日
【發明者】瞿紅花, 曹躍瓊, 朱向瑩, 金楊晟 申請人:蘇州吉凱基因科技有限公司