一種半月板組織來源的間充質干細胞及其制備方法和鑒定的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種半月板組織來源的間充質干細胞的分離方法，包括如下步驟：(1)取半月板組織，剪成組織碎塊，用包含I型膠原酶和II型膠原酶的混合膠原酶溶液消化4～6h；(2)終止消化，用100～400目篩網過濾，1000～2000rpm離心4～10min，棄上清，PBS洗滌3次，重懸于間充質干細胞培養基中，置于37℃、5％CO2條件下培養，2～3天后棄去非貼壁細胞和碎片，換液，此后每3天換液一次，在細胞融合度為80％～90％時收獲細胞，即可。本發明分離得到的間充質干細胞，綜合半月板細胞的穩定表型和間充質干細胞“干性”特征兩者的優點，其分化確切，生物活性優良，是未來半月板再生及其轉化醫學研究中較為理想的一種種子細胞來源，臨床應用前景良好。
【專利說明】一種半月板組織來源的間充質干細胞及其制備方法和鑒定
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種半月板組織來源的間充質干細胞及其制備方法和鑒定。
【背景技術】
[0002]半月板在維持膝關節穩態方面發揮非常重要的生物力學和生物化學功能，包括吸收震蕩、傳遞載荷、穩定關節、分散應力及發揮膝關節的本體感覺等。半月板損傷是臨床上非常常見的與運動和年齡相關的病變。解剖結構的損傷將導致關節退變和骨關節炎的發生，并伴有不同程度的關節功能障礙。半月板損傷后的治療一直是骨科及運動醫學基礎研究和臨床實踐面臨的難題。目前臨床針對半月板損傷的處理手段大體包括半月板切除、縫合修復、重建三個方面。半月板部分或全部切除都將導致膝關節不穩，繼而出現逐漸進展的關節退變。臨床上采用縫合修復的指征也相當有限，僅適用于一些單一縱裂的新鮮損傷類型。盡管同種異體半月板移植被認為是半月板缺損或切除后治療的金標準，但長期的隨訪及組織學結果顯示僅有表淺部位少量的宿主細胞長入，再者供體來源不足、組織處理及保存技術、半月板大小的匹配、手術固定技術以及半月板組織存活的細胞分子研究極大地限制其進一步的臨床應用。
[0003]種子細胞為基礎的組織工程及再生醫學策略為半月板的生物學再生帶來新的希望。目前用于半月板再生的種子細胞主要分為分化成熟的半月板細胞和間充質干細胞。
[0004]終末分化成熟的自體半月板細胞來源于損傷的半月板組織，其來源于自體及確切的半月板細胞表型特征，一直被認為是半月板再生最理想的種子細胞；但是其作為種子細胞也存在一些問題:需要兩次手術、病變組織來源的半月板細胞數量非常有限、且缺乏增殖能力和正常半月板細胞的生物活性等。
[0005]中胚層來源的成體間充質干細胞因其來源廣泛、優良的自我更新、多向分化潛能、免疫調節、定向歸巢以及無倫理道德方面爭議等優點被廣泛用于半月板再生醫學領域。在體內外適當的條件下，間充質干細胞能分化為中胚層、甚至內外胚層的組織細胞。但是，另一方面，間充質干細胞在體外培養擴增過程中可能出現轉化、衰老或凋亡現象，常伴隨細胞增殖能力和分化潛能的下降，逐漸失去其“干性”特點。再者，間充質干細胞最傳統經典的來源是骨髓，但其含量非常低(僅占有核細胞的0.01%?0.001% )，且存在供區并發癥等缺點。因此開發其他來源的間充質干細胞用于半月板的修復重建非常有意義。盡管目前有很多其他組織，如脂肪或滑膜組織等來源間充質干細胞用于半月板再生的種子細胞的報道，但是這些組織來源間充質干細胞最大的缺點是其分化為半月板細胞的不確切性，導致修復效果不佳。
[0006]綜上，目前用于半月板組織修復的種子細胞要么“干性”不足，要么難以有效分化為半月板細胞，導致修復效果不佳。
【發明內容】
[0007]為了解決上述問題，本發明提供了一種半月板組織來源的間充質干細胞及其制備方法和鑒定。
[0008]本發明半月板組織來源的間充質干細胞的分離方法，包括如下步驟:
[0009](I)取半月板組織，剪成組織碎塊，用包含I型膠原酶和II型膠原酶的混合膠原酶溶液消化4?6h，其中，混合膠原酶溶液中，I型膠原酶和II型膠原酶的濃度均為0.1%?0.5% (w/v)；
[0010](2)終止消化，用100?400目篩網過濾，1000?2000rpm離心4?lOmin，棄上清，PBS洗滌3次，重懸于間充質干細胞培養基中，置于37°C、5% CO2、條件下培養，2?3天后棄去非貼壁細胞和碎片，換液，此后每3天換液一次,在細胞融合度為80%?90%時收獲細胞，即可。
[0011]步驟(I)中，所述組織碎塊的體積為I?5mm3。
[0012]步驟(I)中，所述消化是在37°C、30?300轉/分條件下振蕩消化。
[0013]步驟(I)中，所述混合膠原酶溶液中，I型膠原酶和II型膠原酶的濃度均為0.2%(w/v);所述I型膠原酶溶液是包含膠原酶的低糖DMEM培養基。
[0014]步驟⑵中，所述終止消化的方法是:加入細胞懸液1/2?3倍體積的含10% FBS的低糖DMEM培養基。
[0015]步驟(2)中，所述篩網為200目篩。
[0016]步驟(2)中，所述離心的轉速為1200rpm,離心時間為5min。
[0017]步驟⑵中，細胞培養時，環境的相對濕度為95%。
[0018]步驟⑵中，所述間充質干細胞培養基是添加有10% FBS, 3.7g/LNaHC03,100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，25ng/ml兩性霉素B，2mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培養基。
[0019]本發明還提供了前述方法分離得到的間充質干細胞。
[0020]FBS:胎牛血清。
[0021]目前，通常認為間充質干細胞存在于骨髓、外周血、臍血、松質骨、脂肪組織、滑膜和臍帶中，但是用這些來源的間充質干細胞用于半月板修復均存在缺陷，如，骨髓間充質干細胞含量非常低(僅占有核細胞的0.01%?0.001% )，且存在供區并發癥等缺點，而其他組織來源的干細胞又不能確切分化為半月板細胞，導致修復效果不好。
[0022]然而，發明人卻從半月板組織分離得到了間充質干細胞，綜合半月板細胞的穩定表型和間充質干細胞“干性”特征兩者的優點，可以克服前述其他來源間充質干細胞用于修復半月板存在的問題。
[0023]本發明半月板組織來源的間充質干細胞，綜合半月板細胞的穩定表型和間充質干細胞“干性”特征兩者的優點，可以制備成為半月板組織修復用種子細胞，用于修復半月板組織，臨床應用前景良好。
[0024]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1半月板損傷的MR1、關節鏡下發現、大體觀察；
[0026]圖2半月板碎片來源的間充質干細胞顯微鏡下的形態；
[0027]圖3半月板碎片來源的組織特異間充質干細胞的表面標記；
[0028]圖4半月板碎片來源的組織特異間充質干細胞的成骨分化；
[0029]圖5半月板碎片來源的組織特異間充質干細胞的成脂分化；
[0030]圖6半月板碎片來源的組織特異間充質干細胞的成軟骨分化。
【具體實施方式】
[0031]實驗材料和試劑:
[0032]磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，I型膠原酶，II型膠原酶，低糖DMEM(含lg/L葡萄糖，購自Gibco)，高糖DMEM (含4.5g/L葡萄糖)，胰酶消化液(0.25%胰酶/0.1 % EDTA)，CD44抗體，CD90抗體，CD105抗體，CD34抗體，CD45抗體，II型膠原抗體，成骨誘導液，成脂誘導液，成脂誘導維持液，成軟骨誘導液，茜素紅染液，油紅O染液，甲苯胺藍染液，阿爾新藍染液。
[0033]實施例1本發明半月板組織來源的間充質干細胞的分離及檢測
[0034]一、分離及檢測方法
[0035]1、半月板碎片的取材
[0036]通過患者的臨床表現、MRI和關節鏡下的陽性發現綜合判斷確診為半月板損傷(詳見圖1)。在關節鏡下用髓核鉗取出半月板碎片(詳見圖1)。在顯微鏡下切除帶血管的組織、周圍附著的滑膜和韌帶，置于含有雙抗的PBS中漂洗3次。
[0037]2、半月板碎片來源的組織特異間充質干細胞的分離培養
[0038]用眼科剪將取材的半月板碎片剪成約I?5mm3大小的組織碎塊，然后在0.2% I型、0.2% II型混合膠原酶(I型、II型膠原酶的濃度均為0.2%)(低糖DMEM配置)中37°C恒溫水浴搖床振蕩(150轉/分)消化4?6h。經顯微鏡觀察，大部分細胞消化下來后用巴氏吸管吹打3min，加入細胞懸液等體積的含10% FBS的低糖DMEM新鮮培養基終止消化，用200目篩網過濾消化后的細胞懸液，1200rpm離心5min，棄上清，PBS洗滌3次，顯微鏡下細胞計數后細胞按I X 16/瓶(25cm2培養瓶)重懸于完全培養基(低糖DMEM，10%FBS，3.7g/L NaHCO3,100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，25ng/ml兩性霉素B，2mM L-谷氨酰胺)中，置于37°C含5% CO2和95%濕度的培養箱中孵育。隔日倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化和生長情況。2?3天后棄去非貼壁細胞和細胞碎片，更換新的完全培養基。此后每3天換液一次。培養大約10?14天，細胞達到80%?90%融合，用0.25%胰酶/0.1 % EDTA按1:2或1:3的比例消化傳代。收集第3代細胞用于后面的實驗。
[0039]實施例2本發明半月板組織來源的間充質干細胞的分離及檢測
[0040]一、分離及檢測方法
[0041]1、半月板碎片的取材
[0042]通過患者的臨床表現、MRI和關節鏡下的陽性發現綜合判斷確診為半月板損傷(詳見圖1)。在關節鏡下用髓核鉗取出半月板碎片(詳見圖1)。在顯微鏡下切除帶血管的組織、周圍附著的滑膜和韌帶，置于含有雙抗的PBS中漂洗3次。
[0043]2、半月板碎片來源的組織特異間充質干細胞的分離培養
[0044]用眼科剪將取材的半月板碎片剪成約I?5mm3大小的組織碎塊，然后在0.1 % I型、0.1% II型混合膠原酶(I型、II型膠原酶的濃度均為0.2%)(低糖DMEM配置)中37°C恒溫水浴搖床振蕩(30轉/分)消化4?6h。經顯微鏡觀察，大部分細胞消化下來后用巴氏吸管吹打3min，加入細胞懸液等1/2體積的含10% FBS的低糖DMEM新鮮培養基終止消化，用100目篩網過濾消化后的細胞懸液，100rpm離心lOmin，棄上清，PBS洗滌3次，顯微鏡下細胞計數后細胞按I X 16/瓶(25cm2培養瓶)重懸于完全培養基(低糖DMEM，10%FBS，3.7g/L 似!10)3，10(^/1111青霉素，10(^8/1111鏈霉素，25叩/1111兩性霉素8，21111 L-谷氨酰胺)中，置于37°C含5% CO2和95%濕度的培養箱中孵育。隔日倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化和生長情況。2?3天后棄去非貼壁細胞和細胞碎片，更換新的完全培養基。此后每3天換液一次。培養大約10?14天，細胞達到80%?90%融合，用0.25%胰酶/0.1%EDTA按1:2或1:3的比例消化傳代。
[0045]實施例3本發明半月板組織來源的間充質干細胞的分離及檢測
[0046]一、分離及檢測方法
[0047]1、半月板碎片的取材
[0048]通過患者的臨床表現、MRI和關節鏡下的陽性發現綜合判斷確診為半月板損傷(詳見圖1)。在關節鏡下用髓核鉗取出半月板碎片(詳見圖1)。在顯微鏡下切除帶血管的組織、周圍附著的滑膜和韌帶，置于含有雙抗的PBS中漂洗3次。
[0049]2、半月板碎片來源的組織特異間充質干細胞的分離培養
[0050]用眼科剪將取材的半月板碎片剪成約I?5mm3大小的組織碎塊，然后在0.5% I型、0.5% II型混合膠原酶(I型、II型膠原酶的濃度均為0.2%)(低糖DMEM配置)中37°C恒溫水浴搖床振蕩(300轉/分)消化4?6h。經顯微鏡觀察，大部分細胞消化下來后用巴氏吸管吹打3min，加入細胞懸液3倍體積的含10% FBS的低糖DMEM新鮮培養基終止消化，用400目篩網過濾消化后的細胞懸液，2000rpm離心4min，棄上清，PBS洗滌3次，顯微鏡下細胞計數后細胞按I X 16/瓶(25cm2培養瓶)重懸于完全培養基(低糖DMEM，10%FBS，
3.7g/L 似!10)3，10(^/1111青霉素，10(^8/1111鏈霉素，25叩/1111兩性霉素8，21111 L-谷氨酰胺)中，置于37°C含5% CO2和95%濕度的培養箱中孵育。隔日倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化和生長情況。2?3天后棄去非貼壁細胞和細胞碎片，更換新的完全培養基。此后每3天換液一次。培養大約10?14天，細胞達到80%?90%融合，用0.25%胰酶/0.1%EDTA按1:2或1:3的比例消化傳代。
[0051]以下用實驗例的方式說明本發明的有益效果:
[0052]實驗例I半月板組織來源的間充質干細胞的特性檢測
[0053]一、檢測方法
[0054]取實施例1制備的半月板組織來源的間充質干細胞，按照如下方法檢測各特性:
[0055]1、半月板碎片來源的組織特異間充質干細胞的表面標記
[0056]通過FCM分析第3代半月板碎片來源的間充質干細胞的免疫表型。選擇⑶44、⑶90和⑶105作為陽性標記，⑶34和⑶45作為陰性標記。收集生長良好的第3代細胞，以I X 16細胞/ml的細胞密度重懸于PBS中，于FITC標記的⑶44或純化⑶90、⑶105、⑶34、⑶45抗體溶液中孵育lh，加入一定體積FITC標記的二抗孵育30min。每管檢測都設計同型抗體IgG對照以消除非特異染色。經洗滌后于流式固定液中固定30min。至少10000個細胞通過流式細胞儀進行分析，上機檢測。
[0057]2、半月板碎片來源的組織特異間充質干細胞的多向分化潛能
[0058]通過成骨、成脂和成軟骨三系分化來評價間充質干細胞的多向分化潛能
[0059]成骨分化:取生長良好的第3代半月板碎片來源的間充質干細胞，以3X103/cm2的密度接種于6孔板中，24小時后棄去培養基，加入2ml成骨誘導液(高糖DMEM，10% FBS,0.1 μ M地塞米松，1mM β-甘油磷酸鈉，50 μ M抗壞血酸，2mM L-谷氨酰胺，I %雙抗)。每3天換液一次，誘導2周。采用茜素紅染色和ALP染色評估成骨礦化和早期特異成骨基質的分泌情況。并通過Real-tine PCR檢測成骨特異基因的表達。
[0060]成脂分化:取生長良好的第3代半月板碎片來源的間充質干細胞，以3X103/cm2的密度接種于6孔板中，24小時后棄去培養基，加入2ml成脂誘導液(高糖DMEM，10% FBS,I μ M地塞米松，0.5mMIBMX, 10g/ml胰島素，10mM吲哚美辛，2mM L-谷氨酰胺，I %雙抗)，3天后換成成脂維持液(高糖DMEM，10% FBS, 10g/ml胰島素，2mM L-谷氨酰胺，I %雙抗)，24h后再換成成脂誘導液，如此循環，至到2周。采用油紅O染色評估細胞質內脂滴形成情況。并通過Real-tine PCR檢測成脂特異基因的表達。
[0061]成軟骨分化:采用三維細胞微團和無血清培養體系評價半月板碎片來源的間充質干細胞的成軟骨能力。收集IX 16生長良好的第3代半月板碎片來源的間充質干細胞，在15毫升的聚丙烯錐形離心管中懸于Iml成軟骨誘導液[100X ITS(6.25 μ g/ml胰島素，6.25 μ g/ml轉鐵蛋白，5.35 μ g/ml亞麻酸，6.25ng/ml牛血清白蛋白，6.25 μ g/ml亞硒酸),lmmol/L丙酮酸鈉,0.17mmol/L抗壞血酸,0.1 μ M地塞米松,0.35mmol/L脯氨酸，10ng/mlTGFβ 3]中，1500rpm/min離心10分鐘，置于37°C含5% CO2的培養箱中培養，每3天換液一次，至到3周。行HE、甲苯胺藍、阿爾新藍、II型膠原免疫組化染色評估微球大體及軟骨特異細胞外基質的分泌情況。并通過Real-tine PCR檢測成軟骨特異基因的表達。
[0062]二、檢測結果
[0063]1、形態特征
[0064]如圖2所示，原代接種4?6天后分離獲得的細胞呈典型的長梭形的成纖維細胞樣形態㈧；10?14天后培養的細胞達到80%?90%融合，呈旋渦狀生長⑶；傳代至第3代后細胞較均一(C)。
[0065]結果證明，本發明分離獲得的細胞呈間充質干細胞形態。
[0066]2、分離細胞的表面標記
[0067]如圖3所示，本發明分離獲得的細胞，表達典型的間充質細胞標記⑶44、⑶90和⑶105 (95 %以上)，而不表達造血系細胞標記⑶34和⑶45 (5 %以下)。
[0068]結果證明，本發明分離獲得的細胞表達間充質干細胞標記。
[0069]3、細胞分化
[0070]如圖4所示，本發明分離獲得的細胞經成骨誘導14天后茜素紅和ALP染色陽性，Real-tine PCR檢測顯示表達成骨特異基因Runx2，OCN, ALP和I型膠原。
[0071]如圖5所示，本發明分離獲得的細胞經成脂誘導14天后光鏡下可見透亮的脂滴形成，油紅O染色陽性，Real-tine PCR檢測顯示表達成脂特異基因PPAR- y , Adiponect1n,LPL，PAS 和 aP2。
[0072]如圖6所示，本發明分離獲得的細胞經在三維細胞微團和無血清條件下成軟骨誘導21天后，HE染色顯示細胞圓形位于微團里面，甲苯胺藍、阿爾新藍和免疫組化染色陽性顯示軟骨特異細胞外基質GAG和II型膠原表達，Real-tine PCR檢測顯示表達成軟骨特異基因S0X-9，II型膠原和GAG。
[0073]結果證明，本發明分離獲得的細胞具有分化成骨、成脂、成軟骨的能力。
[0074]實驗結果說明，本發明分離獲得的細胞貼壁生長，呈典型的長梭形的成纖維細胞樣形態，表達典型的間充質細胞標記⑶44、⑶90和⑶105，而不表達造血系細胞標記⑶34和CD45，在適當的條件下具有分化成骨、成脂、成軟骨的能力，經鑒定為間充質干細胞。
[0075]本發明半月板碎片來源的間充質干細胞綜合半月板細胞的穩定表型和MSC“干性”特征兩者的優點，其分化確切，生物活性優良，是未來半月板再生及其轉化醫學研究中較為理想的一種種子細胞來源，臨床應用前景良好。
【權利要求】
1.一種半月板組織來源的間充質干細胞的分離方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)取半月板組織，剪成組織碎塊，用包含I型膠原酶和II型膠原酶的混合膠原酶溶液消化4?6h，其中，混合膠原酶溶液中，I型膠原酶和11型膠原酶的濃度均為0.1 %?0.5 %(w/v)； (2)終止消化，用100?400目篩網過濾，1000?2000rpm離心4?lOmin，棄上清，PBS洗滌3次，重懸于間充質干細胞培養基中，置于37°C、5% CO2條件下培養，2?3天后棄去非貼壁細胞和碎片，換液，此后每3天換液一次，在細胞融合度為80%?90%時收獲細胞，即可。
2.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(I)中，所述組織碎塊的體積為I ?5mm3。
3.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(I)中，所述消化是在37°C、30?300轉/分條件下振蕩消化。
4.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(I)中，所述混合膠原酶溶液中，I型膠原酶和II型膠原酶的濃度均為0.2% (w/v);所述I型膠原酶溶液是包含膠原酶的低糖DMEM培養基。
5.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(2)中，所述終止消化的方法是:加入細胞懸液1/2?3倍體積的含10% FBS的低糖DMEM培養基。
6.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(2)中，所述篩網為200目篩。
7.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(2)中，所述離心的轉速為1200rpm,離心時間為5min。
8.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(2)中，細胞培養時，環境的相對濕度為95%。
9.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(2)中，所述間充質干細胞培養基是添加有 10% FBS, 3.7g/L NaHCO3,100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 鏈霉素，25ng/ml 兩性霉素B，2mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培養基。
10.權利要求1?9任意一項方法分離得到的間充質干細胞。
【文檔編號】C12N5/0775GK104357385SQ201410654276
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月17日 優先權日:2014年11月17日
【發明者】付維力 申請人:四川大學華西醫院