本發明屬于食品保健領域，涉及一種果蔬酵素的制備方法及應用，具體涉及一種姜黃果蔬酵素的制備方法及應用。
背景技術：
果蔬是人們日常膳食的重要組成部分，無論是鮮食還是加工品在日常生活中都占有重要的地位。果蔬作為植物性原料，富含多種功能活性成分，包括膳食纖維、酚類、類胡蘿卜素、植物固醇等。多酚是植物體內的一種次生代謝產物，現代研究表明具有抗氧化、抗癌、抗輻射、降血壓、預防心腦血管疾病等多種功能活性。多酚類成分一般存在于細胞液泡中或與纖維類成分緊密結合構成細胞壁。因此，要高效的把多酚從果蔬細胞中釋放出來難度較大，傳統的物理破壁、溶劑提取方法效率低下、成本高昂。此外，大部分多酚類物質的天然存在形式都是多聚體，分子量大、難以解聚。對于大分子多酚類物質，由于人體缺乏相應的消化酶系，不能將之降解消化，只能通過腸道中的微生物來降解處理(氧化、還原、水解等反應)，從而產生對機體有益的代謝產物。然而，膳食食物在腸道中停留的時間一般在24-48小時內，意味著腸道中微生物對多酚類成分的降解作用時間是非常有限，產生的有益代謝產物少，未能充分利用多酚類成分的全部益處。因此，將果蔬在體外進行微生物發酵是提高果蔬中多酚類成分的生物學價值的重要方法之一。
肝臟是人體中重要的器官，能夠防御、分解外來和代謝產生的毒素，對維持機體平衡和健康起著至關重要的作用。化學性肝損傷是通過由多種因素造成的，如受污染的空氣、水、食物以及日常生活中藥物、酒精等。近年來，脂肪肝、酒精肝炎、非酒精性肝炎已成為一種常見疾病，嚴重威脅人們的身體健康。流行病學調查表明：肝臟損傷人數在中國已高達1.3億，每年將近50萬人死于肝損傷病癥。其中脂肪肝及酒精肝是國內外僅次于病毒性肝炎的第二大常見肝損傷疾病。因此，開發一種能長期服用、安全性高、對化學性肝損傷有預防和保健作用的產品具有十分重要的意義。
技術實現要素：
為解決現有技術的缺點和不足之處，本發明的首要目的在于提供一種具有護肝作用的姜黃果蔬酵素的制備方法。
本發明的另一目的在于提供一種由上述制備方法制得的姜黃果蔬酵素。
本發明的再一目的在于提供上述姜黃果蔬酵素的用途。
本發明目的通過以下技術方案實現：
一種具有護肝作用的姜黃果蔬酵素的制備方法，包括如下步驟：
(1)將果蔬清洗、晾干，然后粉碎成20～40目，得混合果蔬液；
(2)向步驟(1)制得的混合果蔬液中加入混合果蔬液重量百分比1～8％的糖，接種混合果蔬液重量百分比0.01～0.05％的酵母菌，密封發酵，當pH<4.3時，得一次果蔬發酵液；
(3)向步驟(2)制得的一次果蔬發酵液中按一次果蔬發酵液體積以100～1000CFU/ml接種復合乳酸菌進行二次發酵，所述復合乳酸菌包括植物乳桿菌、干酪乳桿菌和醋酸桿菌；密封發酵，當pH<3.8時，向果蔬發酵液中加入發酵液重量百分比1.0～3.0％的姜黃提取物，繼續發酵10天，得二次發酵液；
(4)將步驟(3)制得的二次發酵液過濾或離心，對濾液或離心上清液進行均質、滅菌后，制得姜黃果蔬酵素制品。
優選的，如上所述的姜黃果蔬酵素制備方法中，在步驟(1)中，所述果蔬包括火龍果、木瓜、桑椹、楊桃、葡萄、蘋果、李子、梅子、山竹、桃、梨、草莓、柑橘、西瓜、洋蔥、花椰菜和甘藍中的多種。果蔬的選擇可根據蔬菜豐收季節。
優選的，在步驟(2)中加入的糖是蔗糖、葡萄糖和果葡糖漿中的一種或幾種。
優選的，在步驟(2)中所述發酵溫度為15～45℃，發酵時間為10～30天。
優選的，在步驟(3)中加入的姜黃提取物是來自姜黃，規格從姜黃素質量含量10％到20％。
優選的，在步驟(3)中所述復合乳酸菌的制備方法是植物乳桿菌、干酪乳桿菌、醋酸桿菌等數量比例混合。
優選的，在步驟(3)中，所述發酵的條件為20～40℃，密閉發酵30～90天。
本發明還提供了上述方法制得的姜黃果蔬酵素在制備保護化學性肝損傷保健食品、功能食品或特殊醫學用途食品中的應用。
通過常規制劑工藝和輔料、食品添加劑，上述姜黃果蔬酵素可以制成保健食品、功能食品和特殊醫學用途食品中的多種劑型/形態：軟膠囊劑、硬膠囊、片劑、粉劑、顆粒劑、口服液、飲料、果凍、糖果或軟糖。
與現有技術相比，本發明具有以下優點及有益效果：
本發明姜黃果蔬酵素的制備方法簡單，制得的姜黃果蔬酵素能長期服用、安全性高、對化學性肝損傷有預防和保健作用。
姜黃素與果蔬發酵產物如蛋白質、氨基酸、有機酸的螯合，可提升姜黃素的水溶性和生物利用率，增強姜黃素的生物活性。
本發明制得的姜黃果蔬酵素能通過常規制劑工藝和輔料、食品添加劑，可以制成保健食品、功能食品和特殊醫學用途中食品的多種劑型/形態(如軟膠囊劑、硬膠囊、片劑、粉劑、顆粒劑、口服液、飲料、果凍、糖果、軟糖等)，服用方便。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
在未作說明的情況下，本發明涉及的原料與方法均為本領域的常規原料和方法。實施例中使用的酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)購自安琪酵母，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)購自上海交大昂立生物，干酪乳桿菌(lactobacillus casei)購自上海交大昂立生物，醋酸桿菌(Acetobacteraceti)購自廣東省微生物研究所。
實施例1
(1)果蔬的清洗、破碎
將火龍果、木瓜、楊桃、梅子、草莓、柑橘、洋蔥、花椰菜、以及甘藍洗凈、去皮、晾干，用剪切式粉碎機破碎至20目，得混合果蔬液。
(2)一次發酵
加入混合果蔬液重量百分比2％的蔗糖和0.02％的酵母菌，混合攪拌均勻后，室溫25～30℃，密封發酵20天，每天攪拌發酵液1小時，取發酵液測得pH為4.2，得一次果蔬發酵液。
(3)二次發酵
向一次果蔬發酵液中按發酵液體積以1000CFU/ml接入復合乳酸菌進行第二發酵，復合乳酸菌由植物乳桿菌、干酪乳桿菌、醋酸桿菌等數量比例混合配制。室溫25～35℃，密封發酵60天，每天攪拌發酵液1小時，取發酵液測得pH為3.7。加入發酵液重量百分比1.0％的姜黃提取物(姜黃素質量含量20％)，繼續發酵10天，得二次發酵液。
(4)姜黃果蔬酵素獲得
將二次發酵液用離心機分離，以1000g離心力離心10分鐘，取上清液均質、500ml玻璃瓶罐裝滅菌后，制得姜黃果蔬酵素制品。
實施例2
(1)果蔬的清洗、破碎
將火龍果、木瓜、桑椹、楊桃、葡萄、蘋果、李子、山竹、桃、梨、草莓、柑橘、西瓜、洋蔥、花椰菜、甘藍洗凈、去皮和核、晾干，用剪切式粉碎機破碎至30目，得混合果蔬液。
(2)一次發酵
加入混合果蔬液重量百分比8％的葡萄糖和0.05％的酵母菌，混合攪拌均勻后，室溫25～35℃，密封發酵15天，取發酵液測得pH為4.2，得一次果蔬發酵液。
(3)二次發酵
向一次果蔬發酵液中按發酵液體積以100CFU/ml接入復合乳酸菌進行第二發酵，復合乳酸菌由植物乳桿菌、干酪乳桿菌、醋酸桿菌等數量比例混合配制。保溫在25～37℃，密封發酵60天，每天攪拌一小時，取發酵液測得pH為3.5。隨后，加入發酵液重量百分比2.0％的姜黃提取物(姜黃素質量含量15％)，繼續發酵10天，得二次發酵液。
(4)姜黃果蔬酵素獲得
將二次發酵液用離心機分離，以1000g離心力離心10分鐘，取上清液過均質機、500ml玻璃瓶罐裝滅菌后，制得姜黃果蔬酵素制品。
實施例3
(1)果蔬的清洗、破碎
將葡萄、蘋果、李子、山竹、桃、梨、草莓、柑橘、西瓜、洋蔥、甘藍洗凈、晾干，用剪切式粉碎機破碎至20目，得混合果蔬液。
(2)一次發酵
加入混合果蔬液重量百分比8％的果葡糖漿和0.04％的酵母菌，混合攪拌均勻后，室溫20～35℃，密封發酵15天，每天攪拌發酵液1小時，取發酵液測得pH為4.2，得一次果蔬發酵液。
(3)二次發酵
向一次果蔬發酵液中按發酵液體積以600CFU/ml接入復合乳酸菌進行第二發酵，復合乳酸菌由植物乳桿菌、干酪乳桿菌、醋酸桿菌等數量比例混合配制。保溫25～35℃，密封發酵80天，每天攪拌發酵液1小時，取發酵液測得pH為3.3。隨后加入發酵液重量百分比3.0％的姜黃提取物(姜黃素質量含量20％)，繼續發酵10天，得二次發酵液。
(4)姜黃果蔬酵素制得
將二次發酵液用離心機分離，以1000g離心力離心10分鐘，取上清液均質、500ml玻璃瓶罐裝滅菌后，制得姜黃果蔬酵素制品。
實施例4
(1)果蔬的清洗、破碎
將葡萄、蘋果、李子、山竹、桃、梨、草莓、柑橘、西瓜、洋蔥、甘藍洗凈、去皮和核后，晾干，用剪切式粉碎機破碎至40目，得混合果蔬液。
(2)一次發酵
加入混合果蔬液重量百分比5％的果葡糖漿和0.02％的酵母菌，混合攪拌均勻后，室溫20～35℃，密封發酵10天，每天攪拌發酵液1小時，取發酵液測得pH為4.2，得一次果蔬發酵液。
(3)二次發酵
向一次果蔬發酵液中按發酵液體積以1000CFU/ml接入復合乳酸菌進行第二發酵，復合乳酸菌由植物乳桿菌、干酪乳桿菌、醋酸桿菌等數量比例混合配制。室溫25～35℃，密封發酵50天，每天攪拌發酵液1小時，取發酵液測得pH為3.5。隨后，加入發酵液重量百分比1.5％的姜黃提取物(姜黃素質量含量10％)，繼續發酵10天，得二次發酵液。
(4)姜黃果蔬酵素獲得
將二次發酵液用100目板框過濾機過濾，取濾液均質、500ml玻璃瓶罐裝滅菌后，制得姜黃果蔬酵素制品。
實施例5
(1)果蔬的清洗、破碎
將梅子、火龍果、木瓜、楊桃、洋蔥、花椰菜、甘藍洗凈、晾干，用剪切式粉碎機破碎至20目，得混合果蔬液。
(2)一次發酵
加入混合果蔬液重量百分比3％的蔗糖和2％的葡萄糖，接種混合果蔬液重量百分比0.04％的酵母菌，混合攪拌均勻后，室溫25～40℃，密封發酵15天，每天攪拌發酵液1小時，取發酵液測得pH為4.1，得一次果蔬發酵液。
(3)二次發酵
向一次果蔬發酵液中按發酵液體積以600CFU/ml接入復合乳酸菌進行第二發酵，復合乳酸菌由植物乳桿菌、干酪乳桿菌、醋酸桿菌等數量比例混合配制。室溫25～35℃，密封發酵60天，每天攪拌發酵液1小時，60天后取發酵液測得pH為3.4。隨后，再加入發酵液重量百分比2.0％的姜黃提取物(姜黃素質量含量20％)，繼續發酵10天，得二次發酵液。
(4)姜黃果蔬酵素獲得
將二次發酵液用100目板框過濾機過濾，取濾液均質、500ml玻璃瓶罐裝滅菌后，制得姜黃果蔬酵素制品。
姜黃果蔬酵素的護肝效果驗證實驗：
實驗方法：參照《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)中化學性肝損傷的方法。分組及操作：將80只小鼠適應性喂養2周后，分正常組、模型組、姜黃素組、S1、S2、S3、S4、S5組，其中S1-5分別代表實施例1-5。除正常組和模型組外，其余組用50％的食用酒精12ml/kg·day灌胃連續4周，姜黃素組灌胃姜黃素50mg/kg·day。S1-S5組灌胃各實施例配方姜黃果蔬酵素液6ml/kg·day。每天1次共4周，正常組和模型灌胃同體積蒸餾水。最后1d灌胃給酒精后，禁食不禁水12h，各組動物稱重，眼球取血，靜置1h后，分離血清，用于檢測ALT、AST。動物脫頸椎處死后，取肝臟組織約1g制備成10％肝臟勻漿用于檢測MDA、GSH、SOD。用試劑盒檢測相關指標。
結果處理：采用SPSS統計軟件對數據進行處理，計量資料結果均以x±s表示，多組間均數比較首先采用方差齊性檢驗后用單因素方差分析進行統計學分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。
結果：對酒精性肝損傷小鼠血清中轉氨酶的影響，如表1和表2所示。
由表1中數據可知，模型組小鼠血清中ALT、AST水平明顯升高，與正常組比較有顯著性差異(P<0.05)，提示造模成功。與模型組相比，姜黃素組有降低ALT、AST的趨勢，而S1-S5五個組別均能顯著降低小鼠血清中ALT、AST的水平，與模型組相比具有統計學意義，表明S1、S2、S3、S4、S5具有保護肝細胞的作用。
表1對酒精性肝損傷小鼠血清轉氨酶的影響x±s
ΔΔp<0.01,*P<0.05,**p<0.01
由表2可知，與模型組相比，姜黃素組具有降低肝組織中MDA的含量及升高組織SOD和GSH的趨勢，而S1-S5組能明顯的降低組織中MDA的含量及升高組織SOD和GSH的水平(P<0.05-0.01)，由此提示各實施例樣品對肝臟的氧化損傷有保護作用。
表2對酒精性肝損傷小鼠肝組織中SOD、MDA和GSH活性的影響(x±s)
ΔΔp<0.01,*P<0.05,**p<0.01
綜上所述，姜黃果蔬酵素對化學性肝損傷具有保護作用，且比姜黃素的護肝作用效果好。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。