專利名稱：制備6-羥基含氮六元環化合物的方法
技術領域：
本發明涉及制備6-羥基含氮六元環化合物的方法。更具體地說，本發明涉及制備6-羥基吡啶衍生物及6-羥基吡嗪衍生物的方法，它們利用微生物反應，作為制備藥物、農藥、染料或其類似物的中間體是有用的。
各種含氮六元環化合物如二氫吡啶、煙酸等，可以作為制備藥物、農藥、染料或其類似物的重要合成中間體。例如，最近研究了一種作用于煙酸受體的新型殺蟲劑，和由下面通式所表示的Imidacloprid(NipponTokushuNoyakuCo.)是這種新殺蟲劑其中之一
作為制備Imidacloprid的中間體，3-氯甲基-6-氯吡啶是非常重要的。
迄今制備在3-及6-位上有取代基的吡啶的各種合成路線已被深入研究，然而，沒有方法是采用有機化學方法在3-取代吡啶上選擇性地引入6-位取代基。另一方面，采用屬于假單胞菌屬、芽孢桿菌屬或無色桿菌屬的微生物，在煙酸6-位上引入羥基基團的方法-該方法可以分解煙酸，已在日本專利公開(KOKAI)Nos.60-196193及60-196194中有敘述。然而，在上述方法應用于實際用途中時，有必要更有效率地表示活性。對于其它3-取代含氮六元環化合物沒有報導。
本發明目的在于制備具有下面通式(Ⅱ)的6-羥基含氮六元環化合物的方法
其中R1表示羧基、氨基甲酰基、氰基、甲酰基、C1-C5羥烷基、C2-C6烷氧羰基、羧乙烯基、羧甲基或肟基;R2表示氫原子或羧基;A表示碳原子或氮原子，條件是當R2是氫原子而A是碳原子時，R1不為羧基。該方法包括使具有下面通式(Ⅰ)的含氮6-元環化合物
其中R1、R2及A的定義如通式(Ⅱ)在含水介質中與微生物或物理化學處理過的微生物反應。
本發明將詳述如下。
按本發明制備的6-羥基含氮六元環化合物由上面的通式(Ⅱ)表示。R1所定義的C1-C5羥烷基舉例包括羥甲基、1-羥乙基、2-羥乙基、3-羥乙基、3-羥丙基、4-羥丁基等;而C2-C6烷氧羰基包括甲氧羰基、乙氧羰基、正丙氧羰基、異丙氧羰基、正丁氧羰基等。
通式(Ⅰ)的起始含氮六元環化合物包括煙酰胺、3-氰基吡啶、喹啉酸、煙堿醛、吡嗪酰胺等。所對應的6-羥基含氮六元環化合物可以按照本發明的方法制備。
本發明采用的優選的微生物舉例包括選自屬于土壤桿菌屬(GenusAgrobacterium)、節桿菌屬(GenusArthrobacter)、博代氏(桿)菌屬(GenusBordetella)、短桿菌屬(GenusBrevibacterium)、假單胞菌屬(GenusPseudomonas)、無色桿菌屬(GenusAchromobacter)、Comamonas菌屬、歐文氏菌屬(GenusErwinia)、無芽胞桿菌屬(GenusBacterium)、棒狀桿菌屬(GenusCorynebacterium)、沙雷菌屬(GenusSerratia)、八疊球菌屬(GenusSarcina)、黃色桿菌屬(GenusXanthobacter)、辛堿菌屬(GenusAlcaligenes)、辛黃菌屬(GenusFlavobacterium)及小球菌屬(GenusMicrococcus)的微生物。這些微生物經物理化學處理過的也可采用。本發明上述方法中使用的微生物不應局限于上面列出的有機體，只要它們具有向通式(Ⅰ)的含氮六元環化合物6-位選擇性地引入羥基的能力就可以。
屬于土壤桿菌屬的微生物舉例包括放射形土壤桿菌、根癌病土壤桿菌、AgrobacteriumViscosum等。更具體地舉例放射形土壤桿菌NRRLB-11291(AgriculturalResearchServiceCultureCollection)，根癌病土壤桿菌IAM13129(ResearchInstituteofAppliedMicrobiology，TokyoUniversity)，A.viscosumIFO13652(InstituteforFermentation，Osaka)等。
屬于節桿菌屬的微生物舉例包括Arthrobacterglobiformis，Arthrobacterfragilis等。更具體地舉例A.globiformisIFO12137(InstituteforFermentation，Osaka)，A.fragilisFERMP-4350(FermentationResearchInstitute，AgencyofIndustralScienceandTechnology)等。
屬于博代氏(桿)菌屬的微生物舉例包括支氣管敗血性博代氏(桿)菌等。更具體地舉例支氣管敗血性博代氏(桿)菌ATCC4617(AmericanTypeCultureCollection)等。
屬于短桿菌屬的微生物舉例包括Brevibacteriumbutanicum，Brevibacteriumketoglutamicum等。更具體地舉例B.butanicumATCC21196(AmericanTypeCultureCollection)，B.KetoglutamicumATCC15587(AmericanTypeCultureCollection)等。
屬于假單胞菌屬的微生物舉例包括Pseudomonasdacunhae，嗜麥芽假單胞菌，Pseudomonaschlororaphis，Pseudomonashydantoinophilum，惡臭假單胞菌、瑩光假單胞菌等。更具體地舉例P.dacunhaeATCC13261(AmericanTypeCultureCollection)，嗜麥芽假單胞菌ATCC13637(AmericanTypeCultureCollection)，P.chlororaphisIFO3904(InstituteforFermentation，Osaka)，P.hydantoinophilumFERMP-4347(FermentationResearchInstitute，AgencyofIndustrialScienceandTehnology)，惡臭假單胞菌ATCC21244(AmericanTypeCultureCollection)，瑩光假單胞菌IFO3903(InstituteforFermentation，Osaka)等。
屬于無色桿菌屬的微生物舉例包括AchromobacterXerosis等。更具體地舉例A.xerosisIFO12668(InstituteforFermentation，Osaka)等。
屬于Comamonas屬的微生物舉例包括Comamonasacidovorans，Comamonastestosteroni等。更具體地舉例C.acidovoransNCIMB9289(NationalCollectionofIndustrialAndMarineBacteriaLtd.)，C.testosteroniATCC11996(AmericanTypeCultureCollection)等。
屬于歐文氏菌屬的微生物舉例包括草生歐文氏菌等。更具體地舉例草生歐文氏菌ATCC21434(AmericanTypeCultureCollection)等。
屬于無芽胞桿菌屬的微生物舉例包括Bacteriumcyclo-oxydans等。更具體地舉例B.cyclo-oxydansATCC12673(AmericanTypeCultureCollection)等。
屬于棒狀桿菌屬的微生物舉例包括干燥棒狀桿菌等。更具體地舉例干燥棒狀桿菌NCTC9755(NationalCollectionofTypeCultures)等。
屬于沙雷菌屬的微生物舉例包括Serratialiquefaciens，粘質沙雷菌等。更具體地舉例S.liquefaciensIFO12979(InstituteforFermentation，Osaka)，粘氏沙雷菌IFO3054(InstituteforFermentation，Osaka)，粘質沙雷菌IFO12648(InstitureforFermentation，Osaka)等。
屬于八疊球菌屬的微生物舉例包括Sarcinalutea等。更具體地舉例S.luteaATCC9341(AmericanTypeCultureCollection)等。
屬于黃色桿菌屬的微生物舉例包括Xanthobacterflavus等。更具體地舉例X，flavusNCIMB10071(NationalCollectionsofIndustrialAndMarineBacteriaLtd.)等。
屬于辛堿菌屬的微生物舉例包括Alcaligeneseutrophus、Alcaligenesaquamarinus、糞辛堿菌等。更具體地舉例A.eutrophusATCC17699(AmericanTypeCultureCollection)、A.aquamarinusFERMP-4229(FermentationResearchInstitute，AqencyofIndustrialScienceandTechnology)、糞辛堿菌IFO13111(InstituteforFermentation，Osaka)等。
屬于辛黃菌屬的微生物舉例包括FlavobacteriumSuaveolens、Flavobacteriumaminogenes、Flavobacteriumarborescens，Flavobacteriumdehydrogenans，Flavobacteriumheparinum等。更具體地舉例F.suaveolensIFO3752(InstituteforFermentation，Osaka)、F.aminogenesFERMP-3134(FermentationResesrchInstitute，AgencyofIndustrialScienceandTechnology)、F.arborescensIFO3750(InstituteforFermentation，Osaka)、F.dehydtogenansATCC13930(AmericanTypeCultureCollection)、F.heparinumIFO12017(InstituteforFermentation、Osaka)等。
屬于小球菌屬的微生物舉例包括Micrococcusvarians、Micrococcusmorrhuae等。更具體地舉例M.variansIAM1314(InstituteofAppliedMicrobiology，TheUniversityofTokyo)、M.morrhuaeIAM1711(InstituteofAppliedMicrobiology，TheUniversityofTokyo)等。
對培養這些微生物的營養必需品沒有限制，用于微生物的常規的營養必需品就可以使用。例如，碳源包括糖如葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、山梨(糖)醇、糖蜜、淀粉水解液或類似物，而有機酸比如乙酸、富馬酸或類似物;氮源包括硝酸鹽、銨鹽、玉米漿、酵母抽提物、肉提取物、酵母粉、大豆水解產物、棉籽粉、多胨(polypeptone)、Benton等;礦物質包括磷酸鉀、磷酸鈣、磷酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈉等。礦物質如鐵離子、鈷離子、銅離子或其類似物源加到培養物中對誘導酶的產生是有利的。
培養在需氧條件20-40℃溫度下，優選在30-35℃，pH 4.0-9.0，優選pH 5.0-7.0時進行是有利的，經過20-24小時一段時間直到微生物種群增加到約OD6605到OD66040。
用物理化學處理過的微生物在本發明中是指微生物提取物、粉碎的微生物及它們們的純化產品。該純化產品通過已知的方法得到，如用硫酸銨分離、離子交換色譜、硅膠過濾或類似方法。在本發明方法中，含氮六元環化合物(Ⅰ)可與微生物本身(活細胞或干細胞)或物理化學處理過的微生物反應。
通過培養得到的微生物或物理化學處理過的微生物可固定于凝膠上，如聚丙烯酰胺凝膠、光致交聯樹脂、carrageenan或類似物，然后可以與含氮六元環化合物(Ⅰ)反應。
當化合物(Ⅰ)與微生物自身可以反應時，化合物(Ⅰ)可以加到已充分生長的微生物中。含氮六元環化合物(Ⅰ)的合適的濃度在0.1%重量及飽和濃度之間，優選1.0到5.0%重量。反應在20-50℃、優選30-40℃，pH4.0-9.0、優選5.0-7.0，在2-24小時通常20-24小時一段時間內、在需氧條件和攪拌下進行。
當化合物(Ⅰ)可以與物理化學處理過的微生物反應時，化合物加到水溶液中，如含約2-15mg(蛋白質重量)微生物提取物或粉碎的微生物的0.01到1M磷酸鹽緩沖液(pH6-9)。
當微生物自身或處理過的微生物固定后，含氮六元環化合物(Ⅰ)在上述條件下，在一裝有攪拌器的反應器中，與被固定的微生物反應。或者，含有含氮六元環化合物的液體通過裝填著被固定微生物的柱。
羥基化的效率在本發明中可通過在吩嗪甲硫酸酯(phenazinemethosulfate)的存在下進行反應來提高。在這種情況下，吩嗪甲硫酸酯(N-甲基吩嗪鎓甲硫酸酯或5-甲基吩嗪鎓甲基硫酸酯)需要存在于反應混合物中。更具體地說，吩嗪甲硫酸酯可與化合物(Ⅰ)一起、在與微生物自身或處理過的微生物反應時同時加入。在反應混合物中合適的吩嗪甲硫酸酯的濃度為1-100mM，優選5-100mM。
本發明中使用的含水介質可為水或緩沖液如醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液等。對于化合物(Ⅰ)過量的所說的含水介質作為底物是優選的。
這樣得到的6-羥基含氮六元環化合物可由反應混合物中、采用常規的方式萃取，所用的溶劑如甲醇、水或類似物，并可通過裝有ODS樹脂或類似物的柱色譜純化。
得自本發明的6-羥基含氮六元環化合物(Ⅱ)如3-氰基-6-羥基吡啶，作為制備藥物、農藥、染料或類似物的中間體是有用的。例如，3-氰基-6-羥基吡啶采用常規的方法可以很容易地轉化成3-氯甲基-6-羥基吡啶，它是農藥的中間體。
提出下面詳細的實施例說明本發明某些特定的內容。這些實施例只是代表性的而不應作為任何方面的限制。
實施例1向裝備有臍(navels)的錐形燒瓶中，加入含1g酵母抽提物、1g葡萄糖、0.3g K2HPO4、0.1g KH2PO4、1mg FeSO4、50mg MgSO4、1mg MnSO4及100ml水的營養液，所得的混合物在120℃消毒20分鐘，冷卻到30℃后，混合物加入各自消毒的1mg CuSO4及0.2g 3-氰基吡啶作為誘導劑。表1中所列的微生物之一在營養瓊脂介質中孵育24小時后，用鉑環接種到上述混合物中，采用160rpm的旋轉搖動器使混合物在30℃孵育24小時。24小時后、肉湯回收并離心。分離的細胞懸浮并用0.02mol醋酸鹽緩沖液(pH 5.5)洗滌，再離心得到剩余細胞。向100ml反應器中加入20ml1.0% 3-氰基吡啶(pH 5.5)，混合物加熱到30℃并與上面得到的剩余細胞混合。所得的混合物充分攪拌24小時得到3-氰基-6-羥基吡啶。產物通過HPLC、IR及1H-NMR鑒定。表Ⅰ給出了結果。
表1所用微生物產量(mg)Achromobacter xerosis (IFO 12668)2.0Agrobacterium radiobacter(NRRL B-11291)1.0Alcaligenes eutrophus(ATCC 17699)3.0Alcaligenes aquamarinus(FERM P-4229)2.0Alcaligenes faecalis (IFO 13111) 2.0Arthrobacter globiformis(IFO 12137)3.0Arthrobacter fragilils(FERM P-4350)2.0Bacterium cyclo-oxydans(ATCC 12673) 13.0Bordetella bronchiseptica(ATCC 4617)10.0Brevibacterium butanicum(ATCC 21196)12.0Brevibacterium ketoglutamicum(ATCC 15587)2.0Corynebacterium xerosis(NCTC 9755)19.0Erwinia herbicola(ATCC 21434)2.0Flavobacterium suaveolens(IFO 3752)1.0Micrococcus varians(IAM 1314)1.0Micrococcus morrhuae (IAM 1711)1.0Comamonas acidoyorans(NCIMB 9289) 72.0Comamonas testosteroni(ATCC 11996)24.0Pseudomonas dacunhae(ATCC 13261)12.0Pseudomonas maltophila(ATCC 13637)19.0Pseudomonas chlororaphis(IFO 3904)1.0Pseudomonas hydantoinophilum(FERMP-4347)5.0Pseudomonas putida(ATCC 21244)1.0Sarcina lutea (ATCC 9341) 3.0Serratia liquefaciens(IFO 12979)1.0Serratia marcescens(IFO 3054) 1.0Serratia marcescens(IFO 12648)2.0Xanthobacter flavus(NCIMB 10071)1.0
1H-NMR(DMSO-d6)δ6.42(1H，d，J4.5＝9.9Hz，H-5)，7.67(1H，dd，J4.5＝9.9Hz，J2.4＝2.4Hz，H-4)，8.26(1H，d，J2，4＝2.4Hz，H-2)，12.40(1H，bs，OH)實施例2將含1g肉提取物、1g蘋果酸、0.1g K2HPO4、1g煙酸、500mg MgSO4·7H2O及100ml水的營養溶液(pH 7.0)加到Sakaguchi燒瓶中，內容物在120℃消毒20分鐘。冷卻到30℃后，加入2ml消毒的金屬溶液(如表2所示)。在營養瓊脂介質中孵育24小時后，粘質沙雷菌(IFO 12648)及瑩光假單胞菌(IFO 3903)各自用鉑環接種，在一往復振動器中于30℃孵育36小時。回收培養的產物后，細胞離心。分離的細胞懸浮并用0.1mol磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌并離心得到細胞。所得的細胞通過超聲波磨成粉狀并采用超離心。所得沉淀混合并懸浮于置于冰上的0.3% Triton X及0.1%十六(烷)基吡啶鎓氯化物中1小時，再超離心。上清液作為粗酶溶液使用。沉淀再經過同樣的步驟，并將上清液加到粗酶溶液中。粗酶溶液通過在DEAE Sephacel，Phenyl Sepharose，Butyl Toyopearl或類似物上的柱色譜純化。
反應由100μl酶溶液與1.5mMDCIP(2，6-二氯靛酚)、2.0ml0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)、100μl3.0mMPMS(吩嗪甲硫酸酯)及500μl2mM-5mM如表2所示的底物溶液混合而開始。30℃完成該反應1分鐘后，通過測量600nm處吸光度的變化測定活性。表3表示出試驗結果。
表2.金屬溶液的組成金屬/L of DWCaCl2·2H2O 400mgH3BO3500mgCuSO4·5H2O 40mgKI100mgFeSO4·7H2O 200mgMnSO4·7H2O 400mgZnSO4·7H2O 400mgH2MoO4·2H2O 200mgHCl20ml
表3.
底物粘質沙雷菌瑩光假單胞菌IFO 12648IFO 3903μMμM煙堿酰胺213701吡嗪2,3-二羧酸193煙堿醛463825吡啶基甲醇72857吡啶基丙醇N.D7煙酸乙酯461539喹啉酸3915反-3-(3-吡啶基)丙烯酸2060.33-吡啶基乙酸9147酰氨基吡嗪17143-吡啶乙醛肟2933333-氰基吡啶3311N.D.不確定從實施例1及2的結果可以發現，通過所采用的微生物的作用，可以在含氮六元環化合物的6-位選擇性地引入羥基。
權利要求
1.制備通式(Ⅱ)的6-羥基含氮六元環化合物的方法
其中R1表示羧基、氨基甲酰基、氰基、甲酰基、C1-C5羥烷基、C2-C6烷氧羰基、羧乙烯基、羧甲基或肟基，R2表示氫原子或羧基；A表示碳原子或氮原子，條件是當R2為氫原子和A為碳原子時，R1不為羧基，該方法包括使通式(Ⅰ)的含氮六元環化合物
其中R1、R2及A定義如上與微生物或物理化學處理過的微生物在含水介質中反應。
2.按權利要求1的方法，其中反應是在吩嗪甲硫酸酯的存在下進行的。
3.按權利要求1或2的方法，其中R1是氰基或R2為氫原子。
4.按權利要求1的方法，其中的微生物選自屬于土壤桿菌屬、節桿菌屬、博代氏(桿)菌屬、短桿菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、Comamonas菌屬、歐文氏菌屬、無芽胞桿菌屬、棒狀桿菌屬、沙雷菌屬、八疊球菌屬、黃色桿菌屬、辛堿桿菌屬、產黃菌屬、小球菌屬的微生物。
全文摘要
通式(II)的6-羥基含氮六元環化合物，其中R
文檔編號C12P17/06GK1079991SQ9310348
公開日1993年12月29日 申請日期1993年2月26日 優先權日1992年2月26日
發明者安田磨理, 大岸治行, 佐藤勝利, 森本裕紀, 長澤透 申請人:三菱化成株式會社