作為病原體滅活劑的二元醇的制作方法

作為病原體滅活劑的二元醇的制作方法
【專利摘要】本發明涉及生物成分中病原體滅活的用途、方法和成分，其中將二元醇用作病原體滅活劑。
【專利說明】作為病原體滅活劑的二元醇
發明領域
[0001]本發明涉及生物成分中病原體滅活的用途、方法以及成分。
[0002]發明背景
[0003]生物成分的使用對于開發和生產治療劑(例如，重組蛋白的生產)來說是很重要的。生物成分，諸如血液成分，通過輸血挽救了許多生命，例如挽救了患有血液病、大出血或經歷外科手術的病人。然而，生物成分中病原體的存在產生了嚴重的健康危險。
[0004]已經開發了生物成分中病原體滅活的方法。經典的病原體滅活方法包括基于熱處理、溶劑和/或清潔劑處理、伽馬射線、UV處理和白細胞去除(Ieukodepletion)的方法。然而，由于病原體的不同的敏感性以及一些方法與具體的生物成分的不相容性，所述方法的效率和有效性有所不同。
[0005]需要新的病原體滅活方法和滅活劑。
[0006]發明概述
[0007]本發明涉及生物成分中病原體滅活的用途、方法、試劑以及成分。
[0008]在一個方面中，本發明涉及二元醇作為病原體滅活劑的用途。在一些實施方式中，所述二元醇是丙二醇。`
[0009]在一個方面中，本發明涉及生物成分中病原體滅活的方法，所述方法包括用二元醇接觸所述生物成分。在生物成分中病原體滅活的一些實施方式中，所述二元醇是丙二醇。在生物成分中病原體滅活的一些實施方式中，所述生物成分是血液成分或奶成分。在生物成分中病原體滅活的一些實施方式中，所述病原體選自病毒、細菌、真菌、原生動物、寄生蟲以及朊病毒。在一些實施方式中，所述病毒選自X-MuLV、PRV、BVDV和TGEV病毒。在生物成分中病原體滅活的一些實施方式中，所述方法導致病原體清除等于或高于4Logl JCID (TissueCulture Infective Dose,組織培養感染劑量)，其根據卡伯(KSlber)和/或斯皮爾曼-卡
伯(Spearman-Kmter)的方法測定。在生物成分中病原體滅活的一些實施方式中，在所述
接觸步驟之后，所述二元醇濃度為所述生物成分的40至50%(w/w)。在生物成分中病原體滅活的一些實施方式中，在所述接觸步驟之后，所述二元醇濃度為所述生物成分的40至50%(v/v)。在生物成分中病原體滅活的一些實施方式中，所述方法在15至25°C的溫度進行。在生物成分中病原體滅活的一些實施方式中，所述方法在PH值為7.0至8.0時進行。
[0010]在一個方面中，本發明涉及包含二元醇的生物成分，其中所述生物成分通過這里所描述的任意方法獲得。在一些實施方式中，所述二兀醇濃度為40至50%。在一些實施方式中，所述生物成分是奶成分或血液成分。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]附圖構成了本說明書的一部分，且用于對本發明某些方面作進一步說明。通過參考一個或多個這些附圖，結合這里所提出的【具體實施方式】的詳細說明，會更好地理解本發明。附圖僅僅是說明性的，并非實施本發明所必需。[0012]附圖1顯示了在包含45%的丙二醇的親和色譜洗脫液中TEGV的滅活作用。
[0013]附圖2顯示了在包含45%的丙二醇的親和色譜洗脫液中BVDV的滅活作用。
[0014]發明詳述
[0015]在一個方面中，本發明涉及二元醇作為病原體滅活劑的用途。在一個方面中，本發明涉及生物成分中滅活病原體的方法，所述方法包括用二元醇接觸所述生物成分。在一個方面中，本發明涉及包含二元醇的生物成分。在一些實施方式中，所述包含二元醇的生物成分通過這里所描述的任意方法獲得。
[0016]在這里所描述的用途、方法和成分的一些實施方式中，所述二元醇是鄰位二元醇。在一些實施方式中所述鄰位二元醇是丙二醇或乙二醇。
[0017]術語“二元醇”(或“二醇”)是指包含兩個羥基基團(-0H)的化合物。術語“鄰位二元醇”是指具有連接到相鄰原子(例如，在相鄰位置)上的兩個羥基基團的二元醇。
[0018]在一些實施方式中，用于這里所描述的方法和成分中的所述二元醇是鄰位二元醇，其包括2到6個碳原子且化學式為R1R2-(C-OH)2-R3R4，其中R1, R2, R3和R4可以相同也可以不同，并且每一個或者是氫原子或者是烷基，其中R1, R2, &和R4的組合包含最多兩個碳原子。鄰位二元醇的例子有丙二醇、乙二醇、1，2-丁二醇和1，2-戊二醇。
[0019]在這里所描述的用途、方法以及成分的一些實施方式中，所述二元醇是丙二醇或乙二醇。
[0020]所述術語“丙二醇”，也稱為“1，2_ 二羥基丙烷”或“甲基乙二醇”，是指丙烷-1，2-二醇且具有下面所列的結構式(I )。
[0021]所述術語“乙二醇 ”，也稱為“ 1，2- 二羥基乙烷”，是指乙烷-1，2- 二醇以及具有下面所列的結構式(II )。
[0022]
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丙二醇乙二醇
[0023]在這里所描述的用途、方法以及成分的一些實施方式中，所述二元醇是偕二醇。偕二醇具有連接到相同碳原子上的兩個羥基基團且包括1，2-甲烷二醇、1，2-乙烷二醇和1，2-丙烷二醇。在這里所描述的用途、方法以及成分的一些實施方式中，所述二元醇是二醇，其中所述羥基基團不在相同或相鄰的碳原子上。這樣的二元醇的例子有1，3_ 丁二醇、
I,4-戊二醇以及1，3-苯二酚。
[0024]在一個方面中，本發明涉及病原體滅活劑、包括這樣滅活劑的成分及其用途。
[0025]所述術語“病原體”是指能對哺乳動物(比如人類)致病的任何生物物質(例如，任何包含核酸的物質或諸如朊粒的蛋白感染粒子)。術語病原體包括單細胞和多細胞微生物，其具有單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA作為遺傳物質。所述術語特別包括病毒、細菌、真菌、原生動物以及朊病毒。細菌的例子包括但不限于鏈球菌、埃希氏菌和桿菌類；病毒的例子包括但不限于人類免疫缺陷病毒(HIV)和其它逆轉錄病毒、皰疹病毒、副粘病毒、痘病毒、披膜病毒、巨細胞病毒以及肝炎病毒(HAV、HBV、HCV);寄生蟲的例子包括但不限于瘧疾寄生蟲(瘧原蟲類)和錐蟲類寄生蟲。
[0026]在本發明的一些實施方式中，要被滅活的所述病原體選自病毒、細菌、真菌、原生動物、寄生蟲以及朊病毒。
[0027]在一些實施方式中,所述病原體是病毒。
[0028]在一些實施方式中,所述病毒是包膜病毒或非包膜病毒。
[0029]包膜病毒是具有類似于宿主細胞的“包膜”的病毒，例如包括但不限于哺乳動物類或禽類白血病病毒、皰疹病毒、痘病毒、嗜肝病毒、黃病毒、披膜病毒、冠狀病毒、肝炎病毒、逆轉錄病毒、正粘病毒、副粘病毒、彈狀病毒(Rhadovirus)、布尼亞病毒、線狀病毒以及呼腸孤病毒。非包膜病毒，也稱為裸病毒，已為本領域眾所周知且包括但不限于腺病毒、諾瓦克病毒(Norovirus)、輪狀病毒以及人乳頭瘤病毒。
[0030]在一些實施方式中，所述病毒是X-MuLV、PRV、TGEV或BVDV。用于表示“嗜異性鼠白血病病毒相關病毒”的術語“X-MuLV”是指一種Y逆轉錄病毒。術語“PRV”是指假狂犬病病毒。用于表示“傳染性胃腸炎冠狀病毒”的術語“TGEV”是指一種屬于冠狀病毒家族的動物病毒。用于表示“牛病毒性腹瀉病毒”的術語“BVDV”是出自黃病毒家族的瘟病毒。
[0031]在一個方面中，本發明涉及生物成分中病原體滅活的方法，所述方法包括用二元醇接觸所述生物成分。
[0032]如這里所用，所述術語“接觸”是指使至少兩個不同的成分或組分接觸以使它們能夠相互作用的過程。
[0033]所述術語“生物成分”是指源自生物有機體(包括哺乳動物)的組合物(或材料)。生物成分的例子包括但不限于血液成分、奶(諸如來自轉基因哺乳動物的奶)、臨床樣本(諸如尿、汗、痰、糞便和 脊髓液、細胞和組織提取物)、細胞培養基等等。如這里所用，生物成分還包括能夠像生物成分那樣起作用的合成成分，比如血液代用品和經過一個或多個提純或分離步驟的成分。
[0034]根據本發明的血液成分包括但不限于全血和血產品。所述術語“血產品”是指一或多種可以從全血中分離出來的組份，并包括血細胞組份(諸如紅細胞或紅血球、血小板、白細胞及其濃縮物)、血蛋白(諸如血凝因子、酶、白蛋白、血纖維蛋白溶酶原、免疫球蛋白)以及血液流體組份(諸如血衆、血衆級分(fraction)和血清)。在一些實施方式中所述血液成分為白細胞去除(例如白細胞排除)。
[0035]在一些實施方式中，要處理的所述血液成分選自全血、紅細胞濃縮物、血小板濃縮物、血漿和血漿的級分。
[0036]在一些實施方式中，所述生物成分是奶成分。在一些實施方式中，要處理的所述奶成分來自轉基因動物的奶，所述轉基因動物產生目的蛋白并分泌于所述奶中。
[0037]在一些實施方式中，所述方法在生物成分(諸如奶成份)的提純過程(諸如通過親和色譜提純)中的洗脫液中進行。
[0038]所述術語“病原體滅活”或“滅活病原體”，如這里所使用，是指抑制或阻止所述病原體的復制(或繁殖)，和/或病原體的破壞或消除。典型地，病原體滅活劑嚴重地或至少基本上妨礙了在適當的條件下病原體復制或繁殖的能力。
[0039]確定特定的方法是否抑制或阻止了病原體復制方法已為本領域眾所周知。典型地，這樣的方法包括在用病原體滅活劑處理之前確定(活性)病原體的數量以及在處理之后確定(活性)病原體數量的步驟。所述確定活性病原體數量的具體方法取決于所述病原體的性質，并且包括集落形成分析(用于確定活性細菌的數量)和感染性分析(用于確定“活性”病毒的數量)。活性病毒的數量的一項指標是組織培養有效劑量(TCID)，例如其可通過卡伯和/或斯皮爾曼-卡伯方法確定。(參見例如Karber, G.(1931).Arch.J.Exper.Path.u.pharmakol.，162，480;斯皮爾曼(1908).Brit.J.Psychol.，2:227-242)
[0040]在一些實施方式中，本發明的方法導致病原體清除高于或等于4LoglOTCID。如實施例中所解釋，所述病原體清除可以根據卡伯和/或斯皮爾曼-卡伯的方法計算。
[0041]在一些實施方式中，所述生物成分，在所述接觸步驟后，會包含一定量的二元醇，其足以滅活、清除或降低病原體的數量，例如，使之低于期望的水平。在一些實施方式中，在接觸步驟之后所述生物成分中的二元醇濃度為所述成分的10%至75%(w/w)，15%至70%(w/w)，20% 至 65% ( w/w)，25% 至 60% (w/w)，30% 至 60% (w/w)，35% 至 55% (w/w)，或 40% 至 50% (w/W)。在一些實施方式中，在接觸步驟之后所述生物成分中的二元醇濃度為所述成分的10%至 75%(v/v)，15% 至 70%(v/v)，20% 至 65%(v/v)，25% 至 60%(v/v)，30% 至 60%(v/v)，35% 至55%(v/v)，或 40% 至 50%(v/v)。
[0042]雖然并不要求，然而一般來說，期望通過將包含病原體的生物成分暴露給二元醇的時間長度的延長來提高所述病原體滅活作用。在一些實施方式中，將所述生物成分與所述二元醇持續接觸一段時間，其使得病原體的清除大于或等于4LogTCID(組織培養感染
量)O
[0043]在一些實施方式中，所述生物成分與所述二元醇接觸至少10分鐘，至少20分鐘，至少30分鐘，至少40分鐘，至少50分鐘，至少60分鐘，至少70分鐘，至少80分鐘，至少90分鐘，至少1200分鐘，至少150分鐘，至少180分鐘，至少210分鐘，至少240分鐘，至少300分鐘，至少360分鐘，至少2500分鐘，至少1000分鐘或更多。在一些實施方式中，所述生物成分與所述二元醇接觸15至360分鐘，60至240分鐘或90至180分鐘的一段持續的時間。在一些實施方式中，在達到具體量的病原體滅活之后所述二元醇從所述生物成分移除。在一些實施方式中，在所述病原體滅活之后所述二元醇保持在所述生物成分中。
[0044]在一些實施方式中，這里所描述的方法在10至30°C，12至28°C或15至25°C的溫度進行。
[0045]在一些實施方式中，這里所描述的方法在pH值為4至11，5至10，6至9，6.5至
8.5或7至8時進行。在一些實施方式中，這里所描述的方法在pH值為約7.5時進行。在一些實施方式中，這里所描述的方法在PH值為7.5時進行。本領域普通技術人員可以根據現有文獻確定對于具體生物成分來說什么樣的PH值范圍可以接受。
[0046]在一些實施方式中，所述方法進一步包括病毒清除步驟，諸如納米過濾。
[0047]在一些實施方式中，所述方法在生物成分提純(諸如親和色譜)過程中的洗脫階段進行。在一些實施方式中，將所述二元醇加入到親和洗脫緩沖液中。在一些實施方式中，親和洗脫緩沖液包含50mM tris,45%(w/w/)丙二醇和1.5M氯化鈉，且pH值為7.5。在一些實施方式中，親和洗脫緩沖液包含50mM tris,45%(v/v/)丙二醇和1.5M氯化鈉，且pH值為
7.5。
[0048]在一些實施方式中，這里所描述的方法不包括用大量的十字花植物油(cruciferous oil)或精氨酸接觸所述生物成分的步驟。[0049]在所述接觸步驟之后，如這里所用的大量的精氨酸，對應精氨酸濃度為至少0.2M，至少0.0lM或至少0.0OlM0
[0050]在所述接觸步驟之后，如這里所用的大量的十字花植物油，對應十字花植物油的濃度為至少0.1%，至少0.01%或至少0.001%。
[0051]在一個方面中，本發明涉及用于滅活病原體的包含二元醇的生物成分，其中所述生物成分通過用二元醇接觸生物成分獲得，例如通過這里所描述的任意方法。
[0052]在一些實施方式中，所述二元醇是丙二醇或乙二醇。
[0053]在一些實施方式中，所述生物成分中的二元醇濃度為所述成分的10%至75%(w/w)，15% 至 70% (w/w)，20% 至 65% (w/w)，25% 至 60% (w/w)，30% 至 60% (w/w)，35% 至 55% (w/w)，或40%至50%(w/w)。在一些實施方式中，所述生物成分中的二元醇濃度為所述成分的10%至 75%(v/v)，15% 至 70%(v/v)，20% 至 65%(v/v)，25% 至 60%(v/v)，30% 至 60%(v/v)，35% 至55%(v/v)，或 40% 至 50%(v/v)。
[0054]在一些實施方式中，所述生物成分還包含清潔劑(detergent),諸如TWEEN20或TWEEN80。在一些實施方式中，所述生物成分還包含溶劑，諸如TNBP (磷酸三-N- 丁基酯(Tr1-N-butyl Phosphate))。在一些實施方式中，所述生物成分在與二元醇接觸之前包含清潔劑。在一些實施方式中，所述生物成分在與二元醇接觸之前與清潔劑接觸。在一些實施方式中，所述生物成分在與二元醇接觸的同時與清潔劑接觸。在一些實施方式中，所述生物成分在與二元醇接觸之后與清潔劑接觸。
[0055]在一些實施方式中，所述生物成分不包含大量的精氨酸。
[0056]在一些實施方式中,所述生物成分不包含大`量的十字花植物油。
[0057]在一些實施方式中，所述生物成分不包括大量的精氨酸或十字花植物油。
實施例
[0058]下面的實施例描述了本發明的方法和成分的制備和實施的一些實施方式。然而，應當理解，所述實施例僅僅是為了說明的目的而并非是要限制本發明的范圍。貫穿本申請所引用的全部參考(包括參考文獻、授權專利、公開的專利申請以及同時待審的專利申請(co-pending patent applications))的全部內容通過引用的方式在此引入。
[0059]材料和方法
[0060]通過在親和色譜洗脫液中以45%(v/v)存在的丙二醇(PG)對兩種包膜病毒(TGEV和BVDV)的滅活作用進行評估。所述洗脫液在目標轉基因蛋白(transgenic protein ofinterest)的生產過程中產生(該目標蛋白存在于奶成分中，所述奶成分源自生產所述蛋白的轉基因動物，所述蛋白是在其奶中分泌的)。
[0061]細胞毒性,病毒干擾和淬滅(quenching)
[0062]培養實驗之前，在PG存在下測定所述初始材料(所述洗脫液)的細胞病毒、病毒干擾和淬滅參數。所述測定細胞毒性、病毒干擾和淬滅的實驗在親和色譜的洗脫試樣中完成。
[0063]細胞毒性采用表I中的條件對初始材料的細胞毒性參數進行評估:
[0064]表I用于評估細胞毒性的試樣和所測試的稀釋度
[0065]
【權利要求】
1.二元醇作為病原體滅活劑的用途。
2.權利要求1的用途，其中所述二元醇是丙二醇。
3.生物成分中病原體滅活的方法，所述方法包括用二元醇接觸所述生物成分。
4.權利要求3的方法，其中所述二元醇是丙二醇。
5.權利要求3或4的方法，其中所述生物成分是血液成分或奶成分。
6.權利要求3-5中任一項的方法，其中病原體選自病毒、細菌、真菌、原生動物、寄生蟲以及朊病毒。
7.權利要求6的方法，其中所述病毒選自X-MuLV、PRV、BVDV和TGEV病毒。
8.權利要求3-7中任一項的方法，其中所述方法導致病原體清除等于或高于4Log10TCID (組織培養感染劑量)， 其中所述TCID根據卡伯和/或斯皮爾曼-卡伯的方法確定。
9.權利要求3-8中任一項的方法，其中在接觸步驟之后二元醇的濃度為所述生物成分的 40 至 50%(v/V)ο
10.權利要求3-9中任一項的方法，其中所述方法在15至25°C的溫度進行。
11.權利要求3-10中任一項的方法，其中所述方法在pH值為7.0至8.0時進行。
12.包含二元醇的生物成分，其通過權利要求3-11的任一方法獲得。
13.權利要求12的生物 成分，其中所述二元醇濃度為40至50%(v/v)。
14.權利要求12或13的生物成分，其中所述二元醇是丙二醇。
【文檔編號】A61L2/00GK103429272SQ201180063351
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2011年12月23日 優先權日:2010年12月30日
【發明者】S.科托羅 申請人:法國化學與生物科技實驗室