用于病原體檢測和治療的工程化調理素的制作方法

專利名稱：用于病原體檢測和治療的工程化調理素的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子免疫學、微生物病原體以及用于檢測和/或移除流體(包括體液如血液)中的病原體的系統。更具體而言，例如，本發明提供了可用于結合生物病原體或者識別亞類(subclasses)或特定病原體種的工程化分子調理素，從而用于對患有傳染病、血源性傳染或膿毒癥的患者進行治療和診斷的裝置和系統中。
背景技術：
在美國，膿毒癥是非冠狀I⑶患者中的第二大主要死因，并且總的說來是第十大最常見死因。膿毒癥是一種嚴重的醫學癥狀，其以全身炎癥性狀態(稱為全身性炎癥應答綜合征)和存在已知的或可疑的傳染為特征。膿毒癥一般在菌血癥、病毒血癥或真菌血癥期間出現，并可能起因于由病原體(如金黃色葡萄球菌)所引起的傳染，所述病原體不是典型的血源性病原體。血源性病原體是當通過血液或其它潛在已感染體液從受感染者轉移至另一人時引發疾病的微生物。最常見的疾病包括乙型肝炎、人類免疫缺陷病毒(HIV)、瘧疾、丙型肝炎和梅毒。不幸地是，在通過血培養識別出傳染物之前，全身性炎癥應答綜合征可變得危及生命。這一免疫應答引起急性期蛋白的普遍活化，影響了補體系統和凝集途徑，然后，引起對脈管系統和器官的損害。各種神經內分泌逆調節系統(neuroendocrinecounter-regulatory systems )也得以活化,常常使得問題復雜化。即使是立即且強有力地進行治療，其也可能發展至多器官功能障礙綜合征并最終死亡。因此，仍然需要改進用于對患有傳染病、血源性傳染、膿毒癥或全身性炎癥應答綜合征的患者進行診斷和治療的技術。

發明內容
本發明提供了工程化分子調理素，所述工程化分子調理素可用于結合生物病原體或者識別亞類或特定病原體種，從而用于對患有傳染病、血源性傳染或膿毒癥的患者進行治療和診斷的裝置和系統中，或用于對水源性病原體或食源性病原體進行鑒別。本發明一方面提供了甘露糖結合凝集素(MBL)，所述MBL為豐富的天然血清蛋白，是先天性免疫系統的一部分。這一蛋白凝集素結合至幾乎所有種類生物病原體(病毒、細菌、真菌、原生動物)上的表面分子的能力使得工程化形式的MBL在診斷和治療傳染病和膿毒癥中極其有用。本發明的實施方式提供了一種重組調理素，所述重組調理素包含調理素的碳水化合物識別結構域、基底結合結構域以及連接所述識別結構域至固體表面結合結構域的柔性肽結合域。在本發明的一些方面中，所述碳水化合物識別結構域為凝集素或凝集素的片段。或者，所述碳水化合物識別結構域為膠原凝集素或ficollin、或者它們的局部或片段。在特定的方面中，所述碳水化合物識別結構域(CRD)包含MBL的局部，所述局部起始于工程化調理素的凝集素部分的N末端的第81位脯氨酸殘基。在另一特定的方面中，所述碳水化合物識別結構域包含MBL的局部，所述局部起始于工程化調理素的凝集素部分的N末端的第111位甘氨酸殘基。在本發明的特定方面中，重組調理素的基底結合結構域包含一個或多個使其化學交聯至固體基底的半胱氨酸殘基。所述固體基底可包括磁性微珠(可包被有蛋白A)、微孔膜、中空纖維反應器或任何其它血液過濾膜或流動裝置。在其它方面中，基底可以為細胞(如免疫細胞(例如，巨噬·細胞))的表面、在免疫系統的組織或器官(例如，淋巴結或脾)排列的細胞的表面、或者免疫系統的組織或器官的胞外基質的表面。在本發明的另一方面中，柔性肽結構域可包含至少一個甘氨酸+絲氨酸節段和/或至少一個脯氨酸+丙氨酸+絲氨酸節段。在本發明的另一方面中，柔性接頭為免疫球蛋白Fe部分，如Fe Y。人IgGlFc與MBL的頸區和CRD區的融合改進了表達和純化以及以活化形式對基底的偶聯。本發明的實施方式提供了一種從流體中收集結合調理素的微生物的方法，所述方法包括使綴合至固體表面的重組調理素與所述流體相接觸；其中，所述重組調理素由調理素的碳水化合物識別結構域、固體基底結合結構域以及連接所述識別結構域至所述固體表面結合結構域的柔性肽結構域組成；使結合所述調理素的微生物結合至所述重組調理素-固體表面綴合物；以及將所述微生物結合的重組調理素-固體表面綴合物與所述流體分離。所述流體可以是從受試者處得到的生物流體，如血液。然后，所述流體可返回至所述受試者。本發明的另一實施方式提供了一種對受試者的血液感染進行治療的方法，所述方法包括向受試者的血液給予重組調理素，其中，所述重組調理素由調理素的碳水化合物識別結構域、基底結合結構域以及連接所述識別結構域至所述基底結合結構域的柔性肽結構域組成，其中，所述碳水化合物識別結構域與結合調理素的微生物相結合，并且，其中所述基底結合結構域與所述免疫系統的細胞、組織或器官相結合；使所述重組調理素與結合調理素的微生物相結合；以及，使所述微生物結合的重組調理素與所述免疫系統的細胞、組織或器官相結合，所述微生物在所述免疫系統中被殺死。受試者可為動物或人。


圖I示出在本發明的實施方式中經工程化為成組的三聚體(聚合物)的甘露糖結合凝集素(MBL)的示意圖。圖2A和圖2B為本發明實施方式的示意圖，其中，人工蛋白(圖2A)包含空間上不受阻的N-末端(任選在N-末端處或接近N-末端處具有半胱氨酸)、隨后是以長的柔性肽節段、接著是處于C-末端的MBL凝集素結構域，所述人工蛋白交聯至圖2B中的示例裝置中的固體基底。圖3示出本發明實施方式的Fc-MBL. 81的草圖形式以及基于Fe與MBL的頸區和碳水化合物識別結構域(CRD)的X射線晶體學模型的模型形式的圖。圖4為本發明的一個方面中編碼Fe的載體的示意圖。圖5示出DynaBead-MBL對白色念珠菌(C. albicans)的I丐依賴性結合,其中，I丐維持結合而EDTA使結合不穩定。圖6不出MBL-磁珠對不同病原體的結合。將病原體通過MBL包被的磁珠(對照無MBL的磁珠)結合、漂洗并洗脫至培養平板上。圖7示出來自將MBL-磁珠結合至微生物并過夜培養試驗的數據。將病原體通過MBL包被的磁珠(對照■ 無MBL的磁珠)結合、漂洗并洗脫至培養平板上，并孵育過夜。圖8表明來自瞬時轉染的FcMBL的高水平表達。圖8A為用轉染有pFUSEFc MBL. 81(和pFUSE Fe)的293細胞的未純化上清液加樣的、用抗_hFc進行探測的還原膠Western印跡。圖8B示出Protein A純化的Fe MBL. 81。圖9示出耗竭試驗(depletion assay)的結果，其中，在結合白色念珠菌(C. albicans)的方面，FcMBL. 81構建體的活性等同于全長的MBL。
具體實施例方式應當理解的是，本發明不限于本文所記載的具體的方法學、方案和試劑等，并因而可以進行變化。本文所使用的術語僅僅是為了描述具體的實施方式，而并不打算限定本發明的范圍，只通過權利要求書對本發明的范圍進行限定。除非上下文明確地另有要求，如本文和權利要求書中所使用的單數術語應包含復數且復數術語應包含單數。除在操作實施例中或是另有指明以外，本文所使用的全部表達成分的量或反應條件的數值在所有實例中都應被理解為由術語“約”修飾。為了描述和公開的目的，以引用的方式將所有的專利和其它已確定的出版物在此明確地并入本文，例如，所述出版物中描述的方法學的使用可能與本發明相關。這些出版物僅因為它們的公開早于本發明的申請日而提供。在這方面的任何內容不應視為承認發明者沒有權利借助于先前的發明或因為任何其它原因而將公開內容的日期提前。所有關于這些文件的日期的聲明或這些文件的內容的表述是基于申請者可得的信息，并且不構成任何關于這些文件的日期或這些文件的內容的正確性的承認。除非本文另有定義，與本申請結合使用的科技術語應具有本領域普通技術人員所共同理解的相同含義。盡管任何已知的方法、裝置和原料可被用于本發明的實際操作或測試中，就這一點而言，本文已對這些方法、裝置和原料進行了描述。從最廣義上看，調理素為結合至顆粒表面的蛋白質。本質上，調理素充當了吞噬過程的結合增強劑(例如，通過在靶病原體膜上包被帶負電的分子)。本發明提供了一種工程化分子調理素，如甘露糖結合凝集素(MBL)，可將所述調理素用于結合生物病原體或者識別亞類或特定病原體種，從而用于對患有傳染病、血源性傳染或膿毒癥的患者進行治療和診斷的裝置和系統中。治療可在體內或體外進行。MBL為結合至許多微生物病原體表面上存在的甘露糖、含N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的碳水化合物和各種其它碳水化合物的血清凝集素調理素。MBL(也稱為甘露糖結合蛋白或甘露聚糖結合蛋白，MBP)為由三個以上32kDa單體組裝成的聚合蛋白。各單體具有N-末端富含半胱氨酸區、膠原樣gly-X-Y區、頸區和碳水化合物識別結構域。從32kDa單體的三聚體的形成開始裝配較高分子量(MW)聚合物；然后，這些三聚體自組裝成3-6組三聚體的更高分子量的聚合物。參見圖I。MBL為微生物病原體的調理作用和補體活化(通過凝集素途徑)及凝集作用中的關鍵組分。調理作用是蛋白質對靶細胞的結合和以這些細胞作為靶標用于通過吞噬細胞(如巨噬細胞和中性粒細胞)進行攝取和破壞。這一調理作用看起來是通過MBL的小的、富含半胱氨酸的N末端結構域以及通過MBL-介導的補體的凝集素途徑活化而在靶細胞表面上沉積的C3b加以介導。在經由凝集素途徑的補體活化中，微生物和特化蛋白(specialized protein)(即，MASP-I (甘露聚糖結合凝集素相關絲氨酸蛋白酶)(Matsushita&Fujita, 176, J. Exp.Med. ,1497 (1992))和 MASP-2 (Thiel 等，386，Nat.，506 (1997)))與結合的 MBL 相互作用并在不存在抗體的情況下活化補體。更高分子量MBL復合物(功能性MBL三聚體的5-6次重復)是補體經由這一凝集素途徑的強力活化劑，其中，看起來MASP2活化補體而MASPl活化凝集作用。較小的復合物(MBL三聚體單位的3-4次重復)是凝集作用的最強力活化劑(Krarup 等，2，PLoS One, e623 (2007))。在某些人群中，處于膠原螺旋中的MBL于第52位、第54位和第57位密碼子處存在高的等位基因突變頻率(Garred等，7，Genes Immun. , 85 (2006))。這些突變妨礙了更高分子量MBL形式的形成并抑制了補體活化。在這些情況下，MBL仍然作為調理素起作用·并激發凝集作用，但并不活化補體。還有一些就膿毒癥而論的雜合子優勢(heterozygoteadvantage)的證據，在膿毒癥中，雜合子具有最佳存活率，純合的“野生型”具有次最佳存活率，而純合的“突變型”具有最差的存活率(參見Sprong等，49，Clin. Infect Dis.，1380(2009))。另外，在獲得性免疫系統開始起作用前，純合的突變型新生兒特別易于感染。已有很多關于MBL作為重組治療蛋白用于傳染病治療的有用性的爭論。當從人血捐獻物中進行純化時，將完整的MBL作為重組蛋白用于I期和II期臨床試驗中。事實上，血漿來源MBL已被用作MBL缺乏(患有化療導致的中性白細胞減少癥的兒科患者)的I期和II期試驗中的治療劑(Frakking等,45, Eur. J. Cancer, 50 (2009))。由于生產重組蛋白和確定功效中的困難，開發MBL的商業努力已經失敗。如本文所使用的，對受試者進行治療可指被提供用于管理、改善或緩解其疾病、病癥或其癥狀的醫療護理。本發明提供了工程化調理素(例如工程化的MBL或MBL聚合物)，從而用于病原體檢測和清除的裝置和系統中。圖5顯示出綴合MBL的磁微珠對酵母白色念珠菌(C. albicans)的鈣依賴性結合。圖6和圖7比較了數種不同病原體(包括革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌(S. aureus);革蘭氏陰性細菌克雷伯氏菌(Klebsiella)和大腸桿菌(E.coli);以及酵母菌白色念珠菌(C. albicans))之間的MBL-磁珠結合。近期的研究表明了使用微磁技術和微流體技術的組合從流動的液體(如生物流體，如血液)中清除活病原體白勺可行性(Xia 等，8, Biomed. Dev. Biomed. Microdev. , 299 (2006) ;Yung 等，Lab on a ChipDOI :10. 1039/b816986a (2009))。在這些微裝置中(包被有分子的磁微珠，所述分子特異性地結合至病原體細胞上的表面標記)，允許結合至人全血中的這些細胞，然后，使用施加的磁場梯度通過微流體通道從血流中自由地吸出(參見W0/2008/130618 ;W0/2007/044642)。除此用途外，這些裝置很有希望快速清理具有產毒素的病原體的膿毒癥患者的血液，并因此極大地增強了對傳統抗菌素療法的響應。使用有可能便宜且易于使用的微裝置快速(在幾分鐘內)結合、檢測和分離在血液中循環或者存在于其它生物流體內的活病原體的能力還規避了目前的病原體檢測和敏感度測試試驗的主要限制(需要在醫院實驗室或商業實驗室中進行多天的微生物培養)。
本發明中可使用的生物流體包括例如血液、腦脊髓液、關節液、尿液、精液、唾液、淚液和由插針收集的液體。另外，液體可收集自用于如本發明所述的快速、通用污染試驗的食物樣品或水樣品可收集并對天然微生物污染或對可能的“生物恐怖主義(bio-terrorism)”污染的此類流體進行分析。進一步而言，這些方法的當前效用利用了期望從血液中清除的特定病原體的現有知識，因為在使用血液凈化裝置前，將病原體的特異性配體(如特異性抗體)放置在了磁珠上。因此，本發明通過提供工程化的通用結合分子(generic binding molecules)來補強目前的方法，所述分子如同生物調理素一樣發揮作用并結合至本應用所需要的特異性的許多類型或全部類型的微生物病原體。就這點而言，本發明具有治療應用。本文所針對的另一需求是專化型病原體類特異性調理素的開發，所述調理素結合例如所有類型的真菌、或者所有的革蘭氏陰性細菌、或者所有的或特定的革蘭氏陽性細菌、或者所有的病毒、或者所有的原生動物，因為在通過傳統方法(通常花費很多天去完成)對抗生素敏感性的種型的完整表征進行識別前，這一認知在醫師選擇抗菌素療法中可以快速 地給予建議。另外，隨著基因工程及定向進化和選擇策略的使用，可將修飾形式的天然調理素(如MBL)進行工程化從而以種特異性的方式結合至病原體。最終，可使用適當的選擇策略完成結合，所述結合對于對不同的抗生素或抗菌素療法敏感的病原體來說是特異性的。因此，本發明提供了對供給這些高價值特性的工程化調理素的開發。MBL是作為用于本文所述目的的通用調理素的出色選擇；然而，一般不在全血存在的情況下使用完整的分子，因為其具有多個促進血液凝固作用的功能域，從而可能會干擾診斷和治療微裝置的功能。可將MBL的這一特征與如本文所提供的其病原體結合功能相分離。更具體而言，MBL從N末端到C末端含有4個部分具有實質上未知功能的小的N末端結構域，可能參與巨噬細胞結合和/或MASP結合；膠原節段，可能也參與MASP結合和更高級的寡聚化；α螺旋“頸”節段，足以用于三聚化；以及介導直接的病原體結合的、位于C-末端的CRD凝集素結構域。該凝集素結構域對于即將到來的應用來說是有用的，其它結構域根據使用者的需要可存在或刪除，并且可通過常規測試來確定。另外，凝集素活性為鈣依賴性的，所以，可通過螯合劑使結合的微生物釋放用于診斷目的。作為用于診斷和治療應用中的通用調理素的工程化構造MBL的一個實施方式包含MBL的凝集素結構域。例如，第111位的甘氨酸(如在結構生物信息學研究中心(RCSB)，蛋白質數據庫結構文件IHUP中所定義的)是方便的N末端點，工程化調理素的凝集素部分起始于該位置。由于MBL對所給定的單體糖的結合很微弱，因此MBL可以柔性方式連接至固體基質，以便表面上的蛋白能夠移動并適應微生物的形狀。例如，如圖2Α中所示，可將柔性肽(如一個或多個甘氨酸+絲氨酸節段或一個或多個脯氨酸+丙氨酸+絲氨酸節段或本領域已知的其它肽接頭)置于MBL的N末端，因為這些節段傾向于不形成折疊結構。作為用于診斷和治療應用中的通用調理素的工程化構造MBL的另一實施方式包含MBL的頸結構域和凝集素結構域。第81位脯氨酸(如，例如，結構生物信息學研究中心，蛋白質數據庫(RCSB TOB)結構文件IHUP中所定義的)是方便的N末端點，用于這一工程化調理素構建體的凝集素序列起始于該位置。MBL的這一局部下游(C末端)融合至人IgG的Fe部分(Fe Y )。所述Fe部分可包含IgG Fe結構域的CH2-CH3交界處，所述CH2-CH3交界處含有大量Fe受體(包括葡萄球菌蛋白A)的結合部位。在使用中，所述Fe部分二聚化并增強了 MBL凝集素對單體糖結合的親合力與親和力(avidity affinity)。另外，當作為診斷劑使用時，可移除重組調理素的N-連接糖基化。例如，在Fe MBL. 81中，可通過將抗體中的編號氨基酸的Kabat系統中的第297位殘基處的氨基酸由天冬酰胺變為天冬氨酸(N297D)來移除糖基化，這對應于這一特定Fe構建體中的第82位氨基酸。糖基化的Fe維持了 Fe介導的抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)和補體介導的細胞毒作用(CDC)的正確取向(correct orientation)。可將工程化Fe MBL調理素用于Fe受體介導的對Fe MBL調理的結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的攝取的活化,而繞過甘露糖受體介導的對結核分枝桿菌(M. tuberculosis)的攝取。近期的出版物(Kang 等，202，J. Exp. Med. , 987 (2005))表明在吞噬過程中，結核分枝桿菌的細胞表面上的脂阿拉伯甘露聚糖(ManLaM)接合巨噬細胞甘露糖受體(MMR)。這指引結核分枝桿菌至其初始的吞卩遼體生態位(phagosomal niche)并抑制吞噬體-溶酶體(P-L)融合，借此增高在人巨噬細胞中的存活率。有趣的是，通過Fe Y受體進入時并不發生P-L融合的抑制。在一個實施方式中，通過Fe受體胞吞作用途徑將細菌 (例如，結核分枝桿菌(M. tuberculosis))攝取至不同的胞內囊泡。如圖2B中所示，本發明的工程化調理素的構造也幫助了融合蛋白使用對N末端氨基基團特異的化學交聯接頭連接至基底(如微孔膜或磁微珠的固體表面)、或連接至已被工程化為靠近蛋白質N末端的游離半胱氨酸殘基(賴氨酸是半胱氨酸的備選物，任選地緊接著移除蛋白質中的剩余的賴氨酸殘基)。在一些實施方式中，與調理素結合的基底為組織或器官的活細胞或胞外基質。例如，基底可為與免疫應答有關的細胞、組織或器官的表面。例如，細胞可為吞噬細胞(巨噬細胞、中性粒細胞和樹突細胞)、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和/或天然殺傷細胞。細胞可為免疫系統的組織或器官(如脾、淋巴結、淋巴管、扁桃體、胸腺、骨髓、派伊爾氏淋巴集結(Peyer’s patches)、結締組織、粘膜、網狀內皮系統等)的細胞。調理素所結合的表面也可為一個或多個這些組織或器官的胞外基質。在一些實施方式中，固體基底可包含磁珠或其它結構材料，然后，將微生物從流體(包括生物流體如血液)中吸出，濃縮和收集微生物(包括活微生物)。這一方法是有利的，因為可對珠進行微生物存在的檢查，或將珠用于將所收集的微生物轉移至傳統的病原體培養和敏感度測試試驗。換句話說，可將工程化調理素用于作為收集潛在病原體以進行鑒別的手段的診斷中；不僅用于疾病的診斷中，而且用于水源性病原體或食源性病原體、微粒或其它污染物的鑒別中。或者，固體基底可包括中空纖維反應器或任何其它血液過濾膜或流動裝置(例如，簡單的滲析管)或選擇性結合并隔離生物病原體的其它樹脂、纖維或片材(sheets)。磁珠可為任何形狀，包括但不限于球形、桿狀、橢圓形、圓柱形和盤狀等。在一些實施方式中，將具有真正的球形形狀和定義的表面化學的磁珠用于最小化化學凝聚和非特異性結合。如本文所使用的術語“磁珠”是指可被磁場梯度吸引或排斥的、或者具有非零磁化率(magnetic susceptibility)的納米或微米尺寸的顆粒。磁珠可以是順磁或超順磁的。在一些實施方式中,磁珠為超順磁的。本文中也將磁珠稱為磁性粒子。在一些實施方式中，將具有聚合物殼的磁珠用來保護病原體免于暴露至鐵。例如，可將聚合物包被的磁珠用于保護病原體免于暴露至鐵。磁珠尺寸可為lnm-lmm。例如，磁珠尺寸為約250nm_約250 μ m。在一些實施方式中，磁珠尺寸為O. I μ m-100 μ m。在一些實施方式中，磁珠尺寸為O. I μ m_50 μ m。在一些實施方式中，磁珠尺寸為O. Iym-IOym0在一些實施方式中，磁珠為磁性納米顆粒或磁性微米顆粒。磁性納米顆粒為可使用磁場或磁場梯度進行操控的一類納米顆粒。此類顆粒通常由磁性元素(如鐵、鎳和鈷以及它們的化學化合物)組成。磁性納米顆粒為眾所周知的，并且它們的制備方法已在本技術領域中有所描述。參見例如，美國專利No. 6，878，445 ；No. 5，543，158 ；Νο. 5，578，325 ；Νο. 6，676，729 ；Νο. 6，045，925 和 No. 7，462，446 ；以及美國專利公開 No. 2005/0025971 ；Νο. 2005/0200438 ；Νο. 2005/0201941 ；Νο. 2005/0271745 ；No. 2006/0228551 ；Νο.2006/0233712 ；Νο.2007/01666232 和 No. 2007/0264199。具有或者不具有能與親和分子相結合的功能基團的磁珠可容易且廣泛地商購得至丨J。合適的磁珠可例如從下處商購得到Dynal Inc. (Lake Success, NY) ；PerSeptiveDiagnostics,Inc. (Cambridge, MA)；Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) ；Cortex BiochemInc. (San Leandro, CA);以及 Bangs Laboratories (Fishers, IN)。在特定的實施方式 中，磁性顆粒為 MyOne Dynabeads⑨磁珠(Dynal Inc.)。所述固體基底可由生物相容材料制造或者包被有生物相容材料。如本文所使用的術語“生物相容材料”是指當植入或放置在鄰近于受試者的生物組織時不會隨時間而發生可察覺的損害和引起顯著的免疫應答或有害的組織反應(例如，毒性反應或顯著的刺激)，或者當與血液接觸時，不引起凝血或血凝的任何材料。合適的生物相容材料包括,例如聚酰亞胺的衍生物和共聚物、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯亞胺和聚乙烯胺、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚酯、聚碳酸鹽/酯以及聚苯乙烯。在一些實施方式中，所述固體基底用選自于由下述材料所組成的組中的材料制造或包被有選自于由下述材料所組成的組中的材料聚二甲基硅氧烷、聚酰亞胺、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨基甲酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯聚砜、聚碳酸鹽/酯、聚甲基戊烯、聚丙烯、聚偏氟乙烯、多晶硅、聚四氟乙烯、聚砜、丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚對苯二甲酸丁二醇酯、聚醚砜、聚醚醚酮、聚乙二醇、苯乙烯-丙烯腈樹脂、聚對苯二甲酸丙二醇酯、聚乙烯醇縮丁醛、聚偏二氟乙烯、聚乙烯吡咯烷酮以及上述材料的任意組合。在本發明的一個方面中，本文所述的重組調理素可通過本領域公知的、用于使肽與其它分子綴合的方法來與固體基底綴合。例如=Hermanson, B10C0N JUGATETECHNIQUES (第 2 版，Academic Press (2008))和 Niemeyr, BioconjugationProtocols:Strategies&Methods,METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (Humana Press,2004),提供了大量的用于使肽綴合至其它分子的方法和技術。de Graaf等,20, BiocojugateChem. ,1281 (2009)提供了將非天然氨基酸位點特異性地引入肽中用于綴合的綜述。或者，可將固體基底的表面進行功能化以包含選擇性地與重組調理素結合的結合分子。本文中也將這些結合分子稱為親和分子。結合分子可共價或非共價地結合于固體基底的表面上。如本文所使用的術語“結合分子”或“親和分子”是指能夠特異性地結合本文所述的重組調理素的任何分子。親和分子的代表性實例包括但不限于抗體、抗原、凝集素、蛋白質、肽、核酸(DNA、RNA、PNA以及作為它們的混合物的核酸、或者包含核苷酸衍生物或類似物的核酸)；受體分子，如胰島素受體；用于受體的配體(例如，用于胰島素受體的胰島素)；以及對另一分子具有親和力的生物、化學或其它分子(如生物素和抗生物素蛋白)。結合分子不需要包含整個天然存在的分子，而可僅由天然存在的分子或非天然存在分子的局部、片段或亞基組成，例如抗體的Fab片段。結合分子還可包含可被檢測到的標記物。可使用本領域技術人員已知的任何方法將結合分子綴合至固體基底的表面。可將結合分子共價或非共價地偶聯至或綴合至固體基底的表面。可通過例如硅烷偶聯完成共價固定。參見例如，Weetall，15，Adv.Mol.Cell Bio. , 161 (2008) ；ffeetall,44, Meths.Enzymol. , 134, (1976)。還可通過接頭介導結合分子和表面之間的共價連接。親和分子和表面之間的非共價連接可基于離子相互作用、范德華力、偶極-偶極相互作用、氫鍵、靜電相互作用和/或形狀識別相互作用。如本文所使用的術語“接頭”意味著連接組合物的兩部分的分子基團。肽接頭可影響所給定的融合蛋白的折疊，并且也可與其它蛋白反應/結合，并且這些特性可通過已知技術進行篩選。除本文所述的以外，示例的接頭還包括成串的組氨酸殘基，例如，His6 ； 由丙氨酸和脯氨酸組成的序列，改變Ala-Pix)對的數目以調整接頭的柔性；以及由帶電氨基酸殘基組成的序列，例如，將Glu和Lys進行混合。可通過接頭中的殘基的類型和數目來控制柔性。參見例如，Perham, 30, Biochem. , 8501 (1991) ；ffriggers 等,80, Biopolymers,736 (2005)。化學接頭可包括直接鍵合或原子(如氧或硫)、單元(如NH、C (O)、C (O) NH、S0、SO2, SO2NH)或者原子的鏈(如取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C6炔基、取代或未取代的C6-C12芳基、取代或未取代的C5-C12雜芳基、取代或未取代的C5-C12雜環基、取代或未取代的C3-C12環烷基，其中，一個或多個亞甲基可由O、S、S (O)、SO2、NH或C (O)中斷或終止)。基于核酸的結合分子包括適體。如本文所使用的術語“適體”意味著能夠通過除Watson-Crick堿基配對或三螺旋形成以外的機制來特異性地識別所選擇的非寡核苷酸分子或分子的基團的單鏈、部分單鏈、部分雙鏈或雙鏈的核苷酸序列。適體可包括而不限于所定義的序列節段和包含如下核苷酸的序列核苷酸；核糖核苷酸；脫氧核糖核苷酸；核苷酸類似物；經修飾的核苷酸；以及包含骨架修飾、分支點和非核苷酸殘基、基團或橋連的核苷酸。選擇用于結合至分子的適體的方法是本領域普遍已知的，并且對本領域普通技術人員來說很容易理解。重組調理素可通過親和結合對綴合至固體基底的表面。術語“親和結合對”或“結合對”是指特異性地相互結合的第一分子和第二分子。結合對的一個成員與固體基底相綴合而第二成員與重組調理素相綴合。如本文所使用的術語“特異性結合”是指比起對其它分子的結合，結合對的第一成員對結合對的第二成員具有更高親和力和特異性的結合。示例性的結合對包括與相應的抗體或其結合部分或其片段相組合的任何半抗原化合物或抗原化合物(例如，地高辛和抗地高辛；小鼠免疫球蛋白和山羊抗小鼠免疫球蛋白)和非免疫結合對(例如，生物素-親和素、生物素-鏈霉親和素)、激素(例如，甲狀腺素和皮質醇-激素結合蛋白)、受體-受體激動劑、受體-受體拮抗劑(例如，乙酰膽堿受體-乙酰膽堿或其類似物)、IgG-蛋白A、凝集素-碳水化合物、酶-酶輔因子、酶-酶抑制劑以及能形成核酸雙螺旋的互補寡核苷酸對等。結合對還可包括帶負電的第一分子和帶正電的第二分子。
使用結合對綴合的一個實例是生物素-夾心法。參見例如，Davis等，103，PNAS,8155(2006)。使待綴合在一起的兩個分子生物素化，然后，使用四價的鏈霉親和素作為接頭綴合在一起。可將肽偶聯至受體肽的15-氨基酸序列以進行生物素化(稱為AP ;Chen等，2，Nat. Methods，99(2005))。受體肽序列允許通過大腸桿菌(E. coli)酶生物素連接酶(BirA ；同上文)進行位點特異性的生物素化。重組調理素可類似地被生物素化以與固體基底綴合。對于生物素化的蛋白質也有許多可商購的試劑盒。綴合至固體表面的另一實例將使用PLP介導的生物綴合。參見例如，Witus等，132，JACS，16812 (2010)。在這一實施例中，Fe N末端上的AKT序列允許綴合至固體表面，并且處于最佳取向的凝集素結合結構域的取向指向遠離固體表面。應注意的是，單個凝集素結構域對糖的親和力很低，并且正常情況下，結合受親合力和多價驅使。就本裝置來說，從蛋白上除去了多聚化結構域，并且通過以高密度連接至固體基底(例如，珠)來有效地產生蛋白的多價，可改變所述濃度以提供最佳的功能性。
進一步考慮MBL，可通過用于改變的結合特異性的定向進化來操控其結合特征。可對MBL進行修飾，以便其結合至糖或其它分子特征的更受限的集合，結果是，所述經修飾的MBL將結合至微生物的更有限的集合，從而提供病原體類別鑒定(例如，病毒、細菌、真菌或原生動物中的一種)、亞類分型(例如，革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌)或確定特定種的能力。在本領域中有很多可利用的策略。例如，直接的定向進化策略直觀地檢查與糖絡合的MBL的原子結構，然后，將適當的氨基酸進行突變從而以糖特異性的方式進行接觸，以便喪失獨特的接觸或產生特定類型的空間位阻。大鼠MBL的三維結構以與高甘露糖寡聚糖絡合和與N-乙酰氨基葡萄糖胺、甲基化的巖藻糖等絡合的方式得以解析。Hisl89Val和Ile207Val為替代的實例，所述修飾改變了特異性。在定向進化的另一策略中，蛋白質受到隨機誘變并且對得到的蛋白質進行期望性質的篩選。這對噬菌體展示抗體的親和力成熟來說是特別有用的技術，其中，通過飽和誘變使抗體互補決定區(CDRs)發生突變，并將成功的六個CDRs變體一起改組以形成最高親和力抗體。為了選擇特異性地結合至酵母菌、革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、凝固酶陰性細菌、需氧細菌等的MBL變體，可將定向進化范式應用到MBL。然而，為使之起效，這些靶標生物體上的相關表面特征或靶標糖的模式和性質在不同類或種之間可能必須不同。已知MBL強有力地結合至真菌、革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌上的甘露糖和N-乙酰葡萄糖胺糖。例如，MBL強有力地結合至假絲酵母菌(Candida spp.)、煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、A 組 β 溶血性鏈球菌(β hemolytic group A streptococci·)。MBL 對大腸桿菌(Escherichiacoli)、克雷伯氏菌(Klebsiella spp.)和 b 型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzaetype b)具有中等親和力。MBL較弱地結合至B組β溶血性鏈球菌(β hemolyticgroup B streptococci)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) (Neth 等，68, Infect.,688 (2000))。認為腦膜炎奈瑟菌血清組B(Neisseria meningitides serogroupB)、b型流感嗜血桿菌(H. influenzaetype b)和新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)的莢膜多糖減弱了 MBL結合,細菌內毒素也減弱了 MBL 結合。同上文，Van Emmerik 等，97, Clin. Exp. Immunol. ,411 (1994);Schelenz 等,63, Infect. Tmmun. , 3360 (1995)。其他人報道稱MBL促進酵母菌而非細菌的調理吞噬，而不管MBL結合補體的MBL(凝集素)途徑對酵母菌的調理吞噬來說至關重要，但是經典的補體途徑對細菌的調理吞噬來說至關重要(Brouwer等，180, J. Immunol. , 4124 (2008))。然而，并未報道MBL結合至受試細菌菌種，只報道了 MBL結合不會促進顯著的補體激活和調理吞噬。可通過以下方法分離具有特定特異性的MBL衍生物，所述方法為標準的噬菌體展示策略首先，由噬菌粒載體表達一組MBL變體；然后，使這一庫結合至感興趣的靶標(例如，大腸桿菌(E. coli))并進行一輪或兩輪選擇；然后，針對相關靶標(例如，假絲酵母(Candida))進行一輪陰性選擇，取出未能結合的那些嗜菌粒。然后，重復進行這些陽性選擇和陰性選擇的循環直至產生普遍地結合至靶標而不結合至非靶標的噬菌體群。可將這一方法應用至期望差異化結合的任何成對的微生物菌株，如對所給定抗生素有抗性的細菌和敏·感的細菌。這一陽性/陰性富集策略也可與抗體-噬菌體展示庫一起使用，抗體-噬菌體展示庫甚至是分離此類特異性結合物的更為標準的方法。MBL屬于C型(鈣依賴性)凝集素超家族中的膠原凝集素類，可將膠原凝集素類的其它成員(如表面活性蛋白A、表面活性蛋白D、CL-Ll和CL-P1)用于本發明中。其它可能的調理素包括ficollins (Thiel等，1997),所述ficollins還激活了補體的凝集素途徑并結合MASP蛋白質。這些蛋白質與MBL有關但具有不同的、更加受限的特異性。在本文上下文所述的診斷裝置中，一個選擇是簡單地使用對應于上述MBL凝集素結構域的ficollin凝集素結構域。另一方法是使用MBL和一種或多種Ficollins之間的片段的“改組”或個別氨基酸的“改組”以產生可能具有雜交特異性的雜交分子。上述定向進化和選擇方法也可潛在地被用來生成提供上述的類特異性、亞類特異性和種特異性的人抗體片段或肽。本發明可如下述任一編號的段落所定義I. 一種重組調理素，所述重組調理素包含調理素的碳水化合物識別結構域；基底結合結構域；以及連接所述識別結構域至所述基底結合結構域的肽結構域。2.段落I中所述的重組調理素，其中，所述碳水化合物識別結構域是膠原凝集素或ficollin、或者衍生自膠原凝集素或ficollin。3.段落I中所述的重組調理素，其中，所述碳水化合物識別結構域是凝集素或者凝集素的局部或片段。4.段落3中所述的重組調理素，其中，所述的凝集素是甘露糖結合凝集素(MBL)。5.段落4中所述的重組調理素，其中，所述凝集素由MBL的第81位氨基酸殘基(脯氨酸)至第228位氨基酸殘基(異亮氨酸)(SEQ ID NO: 2)組成。6.在先任一段落中所述的重組調理素，其中，所述基底結合結構域包含至少一個使其化學交聯至固體基底的半胱氨酸殘基。7.在先任一段落中所述的重組調理素，其中，所述柔性肽包含甘氨酸+絲氨酸節段、或者脯氨酸+丙氨酸+絲氨酸節段。8.在先段落中所述的重組調理素，其中，所述柔性肽包含免疫球蛋白Fe部分。
9.段落8中所述的重組調理素，其中，所述Fe部分包括IgG Fe結構域的CH2-CH3交界處。10.在先任一段落中所述的重組調理素，其中，所述基底是磁性微珠、順磁微珠、微孔膜、中空纖維反應器或任何其它流體濾膜或流動裝置。11.在先任一段落中所述的重組調理素，其中，所述基底是生物組織或器官的活細胞或胞外基質。12.段落11中所述的重組調理素，其中，所述基底是吞噬細胞。13. 一種從流體中收集結合調理素的微生物的方法，所述方法包括使綴合至固體表面的重組調理素與所述流體相接觸；其中，所述重組調理素由調理素的碳水化合物識別結構域、固體基底結合結構域以及連接所述識別結構域至所述固體 表面結合結構域的柔性肽結構域組成；使結合所述調理素的微生物結合至所述重組調理素-固體表面綴合物；以及將所述微生物結合的重組調理素-固體表面綴合物與所述流體分離。14.段落13中所述的方法，其中，所述固體表面是磁性粒子，并在所述結合調理素的微生物結合至所述重組調理素-固體表面綴合物后，通過對所述流體施加磁力實現所述分離。15.段落13中所述的方法，所述方法進一步包括鑒別所述微生物的步驟。16.段落13中所述的方法，其中，所述流體是生物流體。17.段落16中所述的方法，其中，所述生物流體選自于由下述流體所組成的組血液、腦脊髓液、關節液、尿液、精液、唾液、淚液以及通過針、活組織檢查或吸引術程序收集的流體。18.段落17中所述的方法，其中，所述生物流體是血液。19.段落18中所述的方法，所述方法進一步包括將血液返回至其來源的步驟。20.段落19中所述的方法，其中，所述來源是受試者。21.段落20中所述的方法，其中，所述受試者患有感染或膿毒癥。22.段落13中所述的方法，其中，所述流體來自水樣品或食物樣品。23.段落1-10中任一段落所述的重組調理素在病原體鑒定中的用途。24.段落1-10中任一段落所述的重組調理素在疾病診斷中的用途。25.段落1-10中任一段落所述的重組調理素在水污染或食物污染鑒別中的用途。26.段落1-12中任一段落所述的重組調理素在疾病治療中的用途。27.段落26中所述的重組調理素的用途，所述用途進一步與另外的治療或療法相組合。28. 一種對受試者的血液感染進行治療的方法，所述方法包括向受試者的血液中給予重組調理素，其中，所述重組調理素由調理素的碳水化合物識別結構域、基底結合結構域以及連接所述識別結構域至所述基底結合結構域的柔性肽結構域組成，其中，所述碳水化合物識別結構域與結合調理素的微生物相結合，并且，其中，所述基底結合結構域與所述免疫系統的細胞、組織或器官相結合；使所述重組調理素與結合調理素的微生物相結合；以及使所述微生物-結合的重組調理素與所述免疫系統的細胞、組織或器官相結合，所述微生物在所述免疫系統中被殺死。29.段落28中所述的方法，其中，所述受試者是動物。30.段落28中所述的方法，其中，所述受試者是人。實施例實施例I. FcMBL. 81的構建和表達在診斷和療法應用中用作通用調理素的工程化構造MBL的實施方式，可使用MBL的“頸”和“凝集素”結構域構建。將第81位的脯氨酸(如結構生物信息學研究中心，蛋白質數據庫結構文件IHUP中所定義的)選擇作為N末端點，凝集素序列起始于該位置。該凝集素分子的這一局部下游(C末端)融合至人Fe部分Yl (Fcy)0在圖3中示出了工程化凝集素構建體的圖。在圖4中示出了克隆的Fe部分的示意圖。 這一構建體的氨基酸包括下列殘基Fe蛋白序列001 epkssdktht cppcpapell ggpsvflfpp kpkdtlmisr tpevtcvvvd vshedpevkf061 nwyvdgvevh naktkpreeq ynstyrvvsv ltvlhqdwln gkeykckvsn kalpapiekt121 iskakgqpre pqvytlppsr deltknqvsl tclvkgfyps diavewesng qpennykttp181 pvldsdgsff lyskltvdks rwqqgnvfsc svmhealhnh ytqkslslsp ga(SEQ IDNO: I)MBL. 81蛋白序列(這一序列包括人MBL的卷曲螺旋頸區和碳水化合物識別結構域(CRD))81 pdgdsslaas erkalqtema rikkwltfsl gkqvgnkffI tngeimtfek vkalcvkfqa141 svatprnaae ngaiqnlike eaflgitdek tegqfvdltg nrltytnwne gepnnagsde201 devillkngq wndvpcstsh lavcefpi(SEQ ID NO:2)Fc-MBL.81 序列001 epkssdktht cppcpapell ggpsvflfpp kpkdtlmisr tpevtcvvvd vshedpevkf061 nwyvdgvevh naktkpreeq ynstyrvvsv ltvlhqdwln gkeykckvsn kalpapiekt121 iskakgqpre pqvytlppsr deltknqvsl tclvkgfyps diavewesng qpennykttp181 pvldsdgsff lyskltvdks rwqqgnvfsc svmhealhnh ytqkslslsp gapdgdssla241 aserkalqte marikkwltf slgkqvgnkf fltngeimtf ekvkalcvkf qasvatprna301 aengaiqnli keeaflgitd ektegqfvdl tgnrltytnw negepnnags dedcvlllkn361 gqwndvpcst shlavcefpi(SEQ ID NO:3)因此，FcMBL. 81構建體由具有MBL的第81位氨基酸殘基(脯氨酸)至第228位氨基酸殘基(異亮氨酸)的凝集素與Fe Y的部分融合組成。在使用中，所述Fe部分二聚化并向MBL凝集素對單糖的結合的弱親和力增加親合力。當將Fe MBL. 81設計為用作診斷試劑時，通過將其第297位氨基酸從天冬酰胺變為天冬氨酸(N297D)或將Fe構建體中的第82位氨基酸進行變化可移除N連接糖基化。糖基化的Fe維持了 Fe介導的ADCC和CDC的正確取向。另外，可將半胱氨酸殘基克隆入工程化調理素中，使其通過化學綴合結合至固體基底。可通過本領域已知的多種技術來實現工程化調理素(如FcMBL)的構建和表達，參見例如，美國專利No. 5，541,087。在圖8A和圖8B中示出了瞬時轉染細胞中的構建體的表達。所述FcMBL.81表達約 35mg/L。實施例2.將Fe MBL. 81構建體與全長MBL在結合酵母菌方面進行比較。將約550萬白色念珠菌(Candida albicans)酵母細胞與不同數量的包被有野生型全長MBL (三聚體的六聚物)或Fe MBL. 81的MBL珠一起接種。如圖9的圖所示，1800萬野生型全長MBL或Fe MBL. 81珠結合了全部550萬真菌細胞。這一實施例表明在結合至 白色念珠菌方面，Fe MBL. 81珠的活性等同于野生型全長MBL珠。
權利要求
1.一種重組調理素，所述重組調理素包含 調理素的碳水化合物識別結構域； 基底結合結構域；以及 連接所述識別結構域至所述基底結合結構域的肽結構域。
2.權利要求I中所述的重組調理素，其中，所述碳水化合物識別結構域是膠原凝集素或fi Co 11 in、或者衍生自膠原凝集素或fi col I in。
3.權利要求I中所述的重組調理素，其中，所述碳水化合物識別結構域是凝集素、或者凝集素的局部或片段。
4.權利要求3中所述的重組調理素，其中，所述凝集素是甘露糖結合凝集素(MBL)。
5.權利要求4中所述的重組調理素，其中，所述凝集素由MBL的第81位氨基酸殘基(脯氨酸)至第228位氨基酸殘基(異亮氨酸)(SEQID NO:2)組成。
6.在先任一項權利要求中所述的重組調理素，其中，所述基底結合結構域包含至少一個使其化學交聯至固體基底的半胱氨酸殘基。
7.在先任一項權利要求中所述的重組調理素，其中，所述柔性肽包含甘氨酸+絲氨酸節段、或者脯氨酸+丙氨酸+絲氨酸節段。
8.在先權利要求中任一項所述的重組調理素，其中，所述柔性肽包含免疫球蛋白Fe部分。
9.權利要求8中所述的重組調理素，其中，所述Fe部分包括IgGFe結構域的CH2-CH3交界處。
10.在先任一項權利要求中所述的重組調理素，其中，所述基底是磁性微珠、順磁微珠、微孔膜、中空纖維反應器或任何其它流體濾膜或流動裝置。
11.在先任一項權利要求中所述的重組調理素，其中，所述基底是生物組織或器官的活細胞或胞外基質。
12.權利要求11中所述的重組調理素，其中，所述基底是吞噬細胞。
13.—種從流體中收集結合調理素的微生物的方法，所述方法包括 使綴合至固體表面的重組調理素與所述流體相接觸；其中，所述重組調理素由調理素的碳水化合物識別結構域、固體基底結合結構域以及連接所述識別結構域至所述固體表面結合結構域的柔性肽結構域組成； 使所述結合調理素的微生物結合至所述重組調理素-固體表面綴合物；以及 將所述微生物結合的重組調理素-固體表面綴合物與所述流體分離。
14.權利要求13中所述的方法，其中，所述固體表面是磁性粒子，并在所述結合調理素的微生物結合至所述重組調理素-固體表面綴合物后，通過對所述流體施加磁力實現所述分離。
15.權利要求13中所述的方法，所述方法進一步包括鑒別所述微生物的步驟。
16.權利要求13中所述的方法，其中，所述流體是生物流體。
17.權利要求16中所述的方法，其中，所述生物流體選自于由下述流體所組成的組血液、腦脊髓液、關節液、尿液、精液、唾液、淚液以及通過針、活組織檢查或吸引術程序收集的流體。
18.權利要求17中所述的方法，其中，所述生物流體是血液。
19.權利要求18中所述的方法，所述方法進一步包括將所述血液返回至其來源的步驟。
20.權利要求19中所述的方法，其中，所述來源是受試者。
21.權利要求20中所述的方法，其中，所述受試者患有感染或膿毒癥。
22.權利要求13中所述的方法，其中，所述流體來自水樣品或食物樣品。
23.權利要求1-10中任一項所述的重組調理素在病原體鑒定中的用途。
24.權利要求1-10中任一項所述的重組調理素在疾病診斷中的用途。
25.權利要求1-10中任一項所述的重組調理素在水污染或食物污染鑒別中的用途。
26.權利要求1-12中任一項所述的重組調理素在疾病治療中的用途。
27.權利要求26中所述的重組調理素的用途，所述用途進一步與另外的治療或療法相組合。
28.一種對受試者的血液感染進行治療的方法，所述方法包括 向受試者的血液中給予重組調理素，其中，所述重組調理素由調理素的碳水化合物識別結構域、基底結合結構域以及連接所述識別結構域至所述基底結合結構域的柔性肽結構域組成，其中，所述碳水化合物識別結構域與結合調理素的微生物相結合，并且，其中所述基底結合結構域與免疫系統的細胞、組織或器官相結合； 使所述重組調理素與結合調理素的微生物相結合；以及 使所述微生物結合的重組調理素與所述免疫系統的細胞、組織或器官相結合，所述微生物在所述免疫系統中被殺死。
29.權利要求28中所述的方法，其中，所述受試者是動物。
30.權利要求28中所述的方法，其中，所述受試者是人。
全文摘要
本發明提供了工程化分子調理素，所述工程化分子調理素可用于結合生物病原體或者識別亞類或特定病原體種，從而用于對患有傳染病、血源性傳染或膿毒癥的患者進行治療和診斷的裝置和系統中。本發明一方面提供了甘露糖結合凝集素(MBL)，所述MBL為豐富的天然血清蛋白，是先天性免疫系統的一部分。這一蛋白凝集素結合至幾乎所有種類生物病原體(病毒、細菌、真菌、原生動物)上的表面分子的能力使得工程化形式的MBL在診斷和治療傳染病和膿毒癥中極其有用。
文檔編號C07K19/00GK102947341SQ201180014755
公開日2013年2月27日 申請日期2011年1月19日 優先權日2010年1月19日
發明者米歇爾·舒普爾, 杰弗里·查爾斯·韋, 唐納德·E·英堡 申請人:哈佛大學校長及研究員協會