用于制備抗真菌病原體的植物的多核苷酸和方法

專利名稱：用于制備抗真菌病原體的植物的多核苷酸和方法
技術領域：
本發明涉及用于生成或增強植物的病原體抗性的組合物和方法。另外，本發明涉 及已經用本發明的組合物遺傳轉化的植物。
背景技術：
禾生毛盤孢(Colletotrichum graminicola) (Ces. ) (Cg)更通常地稱作炭疽病，是 影響玉蜀黍(Zea mays) (L.)的炭疽病葉斑病、炭疽病莖腐爛(ASR)和頂梢枯死的病原體， 所述玉蜀黍也稱為玉米(maize)或玉米(corn)。它是僅僅已知的也會造成葉斑病的普通莖 腐爛(Bergstrom，等，(1999) ,Plant Disease, 83 596-608, White,D. G. (1998)，Compendium ofCorn Diseases, pp. 1-78)。在美國，已知它從1855年開始發生，且已經在美洲、歐洲、非 洲、亞洲和澳大利亞有所報道(McGee, D. C. (1988)，Maize Diseases :A Reference Source for Seed Technologists, APS Press, St. Paul, MN ；White, (1998)同上；White，等，(1979) Proc. Annu. CornSorghum Res Conf (34th)，1-15)。只是在美國，每年感染超過 3750 萬英畝， 全國范圍內的平均產量降低6. 6% (參見

圖1)。產量降低是由于受感染的植物的低核重量 和“倒伏”，也就是說，由于感染造成莖的柔弱，植物倒下(Dodd，J.，(1980),Plant Disease, 64:533-537)。倒伏植物更難以收割，且易感其它疾病。感染后，通常莖的頂部首先死亡， 而莖的下部仍然是綠色的。在外表，通過莖外皮上的斑點樣黑斑，可以識別感染，同時在內 部，髓組織變色或呈現黑色。接種會以許多形式發生。根可以生長穿過莖碎片，且受到感 染。這將變成日益嚴重的問題，因為“免耕(no till)”農業方法由于它們的環境益處而被 更廣泛采用。真菌也可以通過昆蟲損傷和其它傷口感染莖(White(1998)同上)。葉感染可 能先于莖感染，從而造成葉斑病，并提供莖感染的接種物。關于自然界存在的Cg不同品種 或種族的數目，技術文獻中尚有爭論。病原體會由風或受污染的種子批傳播。孢子可以存 活最高達 2 年(McGee (1988)同上；Nicholson，等，(1980)，Phytopathology, 70 :255_261 ； Warren, H.L. (1977)，Phytopathology, 67 160-162 ；Warren，等，(1975)，Phytopathology, 65 620-623)。通過使用殺真菌劑，農民可以與玉米真菌病例如炭疽病感染相斗爭，但是它們具 有環境副作用，且需要田地監控和診斷技術來確定哪種真菌造成了感染，從而可使用正確 的殺真菌劑。特別對于大田作物例如玉米，這是困難的。如果可以將負責抗性的基因整合 入原種、高產種質且不減少產量，那么使用攜帶遺傳的或轉基因的抗性來源的玉米系是更 實用的。已經描述了對Cg的抗性的遺傳來源。已經鑒別出攜帶一定水平的Cg抗性的幾種 玉米系(White，等(1979)同上)。它們包括 A556、MP305、H21、SP288、CI88A 和 FR16。使用 A556的相互易位測交分析表明，控制對ASR的抗性的基因存在于染色體1、4和8的長臂上 以及染色體 6 的 2 個臂上(Carson, Μ. L. (1981)，Sources of inheritance ofresistance to anthracnose stalk rot of corn。 Ph.D.Thesis, University ofIllinois, Urbana-Champaign) 0源自這樣的系的抗性的漸滲是復雜的。報道了另一個近交LB31攜 帶控制對ASR的抗性的單個顯性基因，但是表現得不穩定，尤其在有歐洲玉米螟感染存在 時(Badu-Apraku 等，(1987)Phytopathology 77:957-959)。發現 MP305 系攜帶 2 個顯性的抗性基因，一個起主要作用，一個起次要作用(Cars0n(1981)同上)。通過美國農業 U (Department of Agriculture) f= 的國胃才直·禾中M胃· (National PlantGermplasm System) (GRIN ID :NSL 250298)，可以從密西西比大學(University of Mississippi)得 至丨JMP305。參見 Compilation of NorthAmerican Maize Breeding Germplasm, J. T. Gerdes 等，Crop ScienceSociety of America,1993。 從 W. Paul Williams, Supervisory ResearchGeneticist USDA-ARS, Corn Host Plant Resistance Research Unit, Box9555, 340Dorman Hall, Mississippi State, MS 39762，可以得到 MP305 的種子。已經報道，在染色體4的長臂上連鎖有2個賦予對Cg抗性的遺傳上可分離的 (即它們作為分開的遺傳基因座而發揮作用)基因(Toman，等，(1993)，Phytopathology， 83 :981-986 ;Cowen，N 等(1991)MaizeGenetics Conference Abstracts 33)。還己經 艮 道了染色體4上的顯著抗性數量性狀基因座(QTL) (Jung，等，(1994), Theoretical and AppliedGenetics, 89 413-418) Jung 等(同上)報道，UMC 15 可以用于選擇 MP305 中染 色體4上的QTL，并提示QTL是在UMC 15和UMC66之間的染色體4的12 cM區域上。實際 上，如下面更詳細地討論的，在IBM2相鄰4遺傳學圖上報道的UMC15和UMC66之間的區域 是約129cM，且按照Jimg等(1994，同上)指出的方式選擇QTL，會最好也只不過選擇具有 相當大的連鎖拖曳和負表型作用的大染色體區間，且在最壞的情況下，在2個標記之間會 發生雙重組，從而導致Rcgl基因座的假陽性選擇。攜帶這些基因(負責染色體4上QTL所 賦予的表型)的區域在本文中將被稱作Rcgl基因座或MP305抗性基因座；在其他地方，其 已經被稱作ASR基因座。關于植物的一般疾病抗性機理已經進行了大量工作。一些抗性機理實際上是非病 原體特異性的，或所謂的“非宿主抗性”。它們可能基于細胞壁結構或類似的保護機制。但 是，盡管植物缺少含有循環抗體的免疫系統和哺乳動物免疫系統的其它屬性，但它們確實 具有針對病原體進行特異性保護的其它機理。其中最重要的和最充分研究的是植物疾病抗 性基因，或“R”基因。該抗性機理和R基因的非常多的綜述之一，可以參見Bekhadir等， (2004), Current Opinion in Plant Biology 7 :391_399。存在 5 類公認的 R基因含有核 苷酸-結合位點(NBS)和富亮氨酸重復(LRR)的細胞內蛋白；含有胞外LRR結構域的跨膜 蛋白(TM-LRR)；含有胞質激酶結構域的跨膜和胞外LRR(TM-CK-LRR)；含有卷曲螺旋胞質結 構域的膜信號錨定蛋白(MSAP-CC)；和含有N-末端肉豆蔻基化位點的膜相關激酶(MAK-N) (參見，例如Cohn，等，(2001)，Immunology, 13 55-62 ；Dangl, ^ (2001), Nature, 411 826-833)。Broglie等人(US專利申請系列號11/397，153)描述了新型的R基因，其涉及 NBS-LRR型稱為Rcgl，發現于之前由Jimg等人(如上)所描述的Rcgl基因座內。他們描 述了在育種中利用這種基因座作為標記物，其染色體區間可以為谷物植物賦予抗性，以及 含有Rcgl基因的轉基因植物。本發明改進了 Broglie等人的工作，通過提供第二 NBS-LRR 基因，其與Rcgl基因不同，并被稱作Rcglb，其與Rcgl聯合是對Cg的抗性所必需的。Rcglb 基因與Rcgl在物理上(200-300kb)和遺傳上(小于1厘摩)緊密相關，并且代表了 Rcgl 基因座的第二組分。本發明提供了 Rcglb的序列，結合Rcgl和Rcglb的嵌合構建體，和共 同利用Rcgl和Rcglb基因(Rcgl基因座)育種的方法和標記。發明概述
本發明的實施方案基于對來自系MP305的負責抗性表型的基因的精細作圖、克隆 和表征，含有MP305抗性基因座(Rcgl基因座)的截短的染色體區間向具有很少或沒有連 鎖拖曳的其它系中的漸滲，這些基因作為轉基因的應用的證實，和使用育種技術、用分子標 記將這些基因或轉基因移進原種系中。實施方案包括分離的多核苷酸，其包含編碼能連同Rcgl多肽賦予對毛盤孢屬 (Colletotrichum)的抗性的Rcglb多肽的核苷酸序列，其中所述Rcgl多肽的氨基酸序 列基于Needleman-Wunsch比對算法，當與SEQ ID NO :3或在2006年2月22日保藏在 Agricultural ResearchService (ARS) Culture Collection 的專利保藏號NRRL B-30895 的 Rcgl序列所編碼的肽相比時，具有至少50%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%和 至少95%同一性，以及進一步其中Rcglb多肽具有當與SEQID NO :246或在2007年6月26 日保藏在 Agricultural Research Service(ARS) Culture Collection 的專利保藏號 NRRL B-50050的Rcglb序列所編碼的肽相比時，具有至少50 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、 至少90%和至少95%同一性的氨基酸，或該核苷酸序列的互補體，其中所述互補體和核苷 酸序列由相同數目的核苷酸組成，且100%互補。實施方案還包括分離的多核苷酸，其包含 編碼連同Rcgl多肽能夠賦予對毛盤孢屬(Colletotrichum)的抗性的多肽的核苷酸，其中 所述多肽具有在與SEQNO 246相比時具有至少50 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少 90%和至少95%同一性的氨基酸序列。 本發明的其它實施方案包括載體，其包含編碼本發明實施方案多肽的多核苷酸， 例如SEQ ID N0:3、SEQ NO :246，或保藏為專利保藏號NRRL-30895的質粒的多核苷酸序列， 或保藏為專利保藏號NRRLB-50050的質粒的多核苷酸序列以及包含可操作地連接到至少 一個調節序列上的本發明實施方案的多核苷酸的重組DNA構建體。本發明的其他實施方案 包括載體，其包含編碼SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :246 二者的多核苷酸。本發明也包括植 物細胞、以及植物，它們各自包含本發明實施方案的重組DNA構建體，和包含實施方案的重 組DNA構建體的種子。本發明包括的方法包括1)轉化宿主細胞、包括植物細胞的方法，其包含用本發明 實施方案的多核苷酸轉化宿主細胞，2)生產植物的方法，其包含用本發明實施方案的重組 DNA構建體轉化植物細胞，和從轉化的植物細胞再生植物，和3)賦予或增強對毛盤孢屬和 /或莖腐爛的抗性的方法，其包含用本發明實施方案的重組DNA構建體轉化植物，從而賦予 和/或增強對毛盤孢屬或莖腐爛的抗性。其它實施方案包括，測定玉米植物中存在或不存在本發明實施方案的多核苷酸或 Rcgl基因座的方法，其包含下述的至少一個(a)從玉米植物分離核酸分子，并通過擴增與 多核苷酸同源的序列，測定是否存在Rcgl基因，以及測定是否存在或不存在Rcglb基因(b) 從玉米植物分離核酸分子，并進行DNA印跡雜交，(c)從玉米植物分離蛋白，并使用Rcgl 蛋白和/或Rcglb蛋白的抗體進行蛋白印跡，(d)從玉米植物分離蛋白，并使用Rcgl蛋白 和/或Rcglb蛋白的抗體進行ELISA測定，(e)證實存在源自RcglmRNA轉錄物且Rcgl和 /或Rcglb蛋白特有的mRNA序列，或(f)通過表型測定證實新賦予或增強的對毛盤孢屬 (Colletotrichum)感染的抗性的存在，從而確定玉米植物中存在多核苷酸或Rcgl基因座。本發明也包括改變植物或植物細胞中能賦予對毛盤孢屬或莖腐爛的抗性的蛋白 表達水平的方法，其包含(a)用本發明實施方案的重組DNA構建體轉化植物細胞，和(b)在適合表達重組DNA構建體的條件下，培養轉化的植物細胞，其中重組DNA構建體的表達導致 在轉化的宿主中生產改變水平的能賦予對毛盤孢屬或莖腐爛的抗性的蛋白。本發明包括的另一種方法是，賦予或增強玉米植物中對毛盤孢屬和/或莖腐爛的 抗性的方法，其包含(a)使缺少Rcgl基因座的第一種玉米植物與含有Rcgl基因座的第 二種玉米植物雜交，以生成分離群體，(b)篩選分離群體中含有Rcgl基因座的成員，所述 Rcgl基因座具有能與連接到或位于Rcgl基因座內的第二種核酸雜交的第一種核酸，不包 括UMC15a或UMC66，和(c)選擇所述成員，用于進一步雜交和選擇。本發明也包括增強對毛盤孢屬和/或莖腐爛的抗性、或將毛盤孢屬和/或莖腐爛 抗性漸滲入玉米植物的方法，其包含用核酸標記進行玉米植物的標記輔助選擇，其中所述 核酸標記特異性地與具有第一種核酸序列的核酸分子雜交，所述第一種核酸序列連接在位 于MP305的Rcgl基因座上的第二種核酸序列上，并基于標記輔助選擇來選擇玉米植物。本 文公開的特異性的FLP、MZA和Rcgl-特異性的SNP標記是本發明的其它方面。
本發明的另一個實施方案是鑒定玉米植物的方法，所述玉米植物表現出新賦予的 或增強的對毛盤孢屬感染的抗性，其通過檢測Rcglb基因上或內部的至少一個標記的等位 基因，以及任選地通過檢測Rcgl基因上或內部的第二標記。其它實施方案包括，通過檢測玉米植物中至少2個標記的等位基因，鑒別表現出 新賦予的或增強的對毛盤孢屬抗性的玉米植物的方法，其中至少一個標記是在UMC2041下 邊、且在Rcglb基因上邊的染色體區間上或內部，且至少一個標記是在Rcgl基因下邊、且 在UMC2200上邊的區間上或內部。該方法包含的類似實施方案包括，至少一個標記是在 UMC1086下邊、且在Rcglb基因上邊的染色體區間上或內部，在UMC2285下邊、且在Rcglb基 因上邊的染色體區間上或內部，且至少一個標記是在Rcgl基因下邊、且在UMC2200上邊的 區間上或內部，在Rcgl基因下邊、且在UMC2187上邊的區間上或內部，或在Rcgl基因下邊、 且在UMC15a上邊的區間上或內部。其它實施方案包括，通過檢測玉米植物中至少2個標記的等位基因，鑒別表現出 新賦予的或增強的對毛盤孢屬抗性的玉米植物的方法，其中在UMC2041下邊、且在Rcglb基 因上邊的染色體區間上或內部的至少一個標記選自表16列出的標記，且在Rcgl基因下邊、 且在UMC2200上邊的區間上或內部的至少一個標記也選自表16列出的標記。實施方案包 括，通過選擇至少4個標記或至少6個，鑒別表現出新賦予的或增強的對毛盤孢屬抗性的玉 米植物的方法，其中至少2個或3個標記是在UMC2041下邊、且在Rcglb基因上邊的染色體 區間上或內部，且至少2個或3個標記是在Rcgl基因下邊、且在UMC2200上邊的區間上或 內部。當在UMC2041下邊、且在Rcglb基因上邊的染色體區間上或內部的2或3個標記，以 及在Rcgl基因下邊、且在UMC2200上邊的區間上或內部的2或3個標記選自表16列出的 那些時，其它實施方案包括該相同方法。該方法的另一個實施方案包括，檢測在MZA1112處 的等位基因7，檢測在MZA2591處的等位基因2，或檢測在MZA3434處的等位基因8。通過所 包括的方法生產的玉米植物和種子也是本發明的實施方案，包括不包含在表16所示的基 因座處在UMC2041處或其上面、或在UMC2200處或其下面的與MP305相同的等位基因的那 些玉米植物。其它實施方案包括，通過檢測玉米植物中至少2個標記的等位基因，鑒別表現出 新賦予的或增強的對毛盤孢屬抗性的玉米植物的方法，其中至少一個標記是在UMC2041下邊、且在Rcglb基因上邊的染色體區間上或內部，且至少一個標記是在Rcgl基因下邊、且在 UMC2200上邊的區間上或內部，且其中該方法檢測位于Rcgl基因或Rcglb基因內的至少一 個標記的存在或不存在。另一個這樣的實施方案包括該方法的修飾，其中選擇4個標記，其 中2個標記是在UMC2285下邊、且在Rcgl基因上邊的染色體區間內部，且至少2個標記是 在Rcgl基因下邊、且在UMC15a上邊的區間內部。該方法的其它實施方案包括Rcgl基因和 Rcglb基因，這些基因已經從供體玉米植物，包括MP305或DE81IASR (BC5)，漸滲進受體玉米 植物，以生產漸滲的玉米植物。該方法也包括這樣的情形，其中選擇漸滲的玉米植物在Rcgl 基因下邊和UMC15a上邊的重組事件，從而使得漸滲的玉米植物保持第一個MP305衍生的在 Rcgl基因下邊、且在UMC15a上邊的染色體區間，且不保持第二個MP305衍生的在UMC15a處 和下邊的染色體區間。通過這些方法生產的玉米植物和種子也是本發明的實施方案。本發 明包括的 漸滲的玉米植物包括作為PH705、PH5W4、PH51K或PH87P的Rcgl基因座轉變的那 些，或其后代。本發明的其它實施方案是鑒別表現出增強的對毛盤孢屬感染的抗性的玉米植物 的方法，其通過檢測玉米植物在Rcgl基因座處存在或不存在至少一個標記，和選擇其中存 在至少一個標記的玉米植物來實現。實施方案包括，當至少一個標記是在SEQ ID NOs 137, 255，256，257，258或266上或內部時，以及當至少1個標記是在Rcgl或Rcglb編碼序列上 或內部，或位于SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :245所述多核苷酸上或內部時。本發明包括的漸滲的玉米植物包含，作為PH705、PH5W4、PH51K或PH87P的Rcgl基 因座轉變的那些，或其后代。這樣的實施方案包括玉米種子，其包含第一個MP305衍生的由 BNLG2162和UMC1051定義的染色體區間，且不包含第二個MP305衍生的在UMC2041上邊或 在UMC1051下邊的染色體區間，且當該玉米種子包含Rcgl和Rcglb基因的至少一種，且當 生長時生成表現出對毛盤孢屬感染的抗性的玉米植物。該實施方案的種子也包括下述玉米 種子，其包含第一個MP305衍生的在UMC2285和UMC15a之間但是不包括該二者的染色體區 間，且不包含第二個MP305衍生的在UMC2285處或上邊、或在UMC15a處或下邊的染色體區 間，而且這樣的包含Rcgl和Rcglb基因的玉米種子在生長時，生成表現出對毛盤孢屬感染 的抗性的玉米植物。由該種子生產的玉米植物和植物細胞也包含在本發明的實施方案中。本發明也包括作為PH705、PH5W4、PH51K或PH87P的Rcgl基因座轉變的后代種子， 或其后代，以及包含在MZAl 1123處的等位基因7、在MZA2591處的等位基因2或在MZA3434 處的等位基因8中的至少2個或更多個的后代種子。其它實施方案包括，包含在MZA2591. 32 處的胞嘧啶核苷酸、在MZA2591. 35處的胸腺嘧啶核苷酸和在MZA3434. 17處的胞嘧啶核苷 酸的后代種子。實施方案也包括分別在SEQ ID NO 140-146上或內部的MZA3434、MZA2591、MZA 11123、MZA15842、MZA1851、MZA8761和MZA11455的遺傳標記。其它實施方案包括位于Rcgl 基因座或Rcgl基因或Rcglb基因上或內的遺傳標記，包括位于SEQ ID NO: 137上的那些， 或在SEQ ID NOs :255，256，257，258和266任一個上的那些。包含的標記也包括位于SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 245 上的那些。附圖簡述圖1是顯示各縣在2002年炭疽病莖腐爛感染嚴重性的美國地圖。圖2 (a、b、c)是將它與其它已知NBS-LRR多肽相對比的實施方案多肽序列(SEQ IDNO:3)的比對。圖3是用Windows QTL Cartographer軟件生成的圖，它顯示了負責Cg抗性表型的 基因座位于FLP標記定義的染色體上的特定位置(X軸)處的機會(Y軸)的統計學分析。圖4是RT-PCR反應物的等分試樣的電泳凝膠印跡，它揭示了 260bp帶的存在，該 260bp帶存在于源自受感染的和未受感染的抗性植物的樣品中，但是在易感樣品中不存在。 從來自DE811和DE811ASR莖組織的12. 5ng總RNA中，得到了 RT-PCR片段。使用Rcgl特 異性的引物和18S rRNA引物作為內部標準，擴增通過反轉錄得到的cDNA。圖5是用于驗證Rcgl基因的Mu-標記策略的示意圖。 圖6是Rcgl的基因結構，它顯示了 4種不同增變基因插入位點的位置。圖7(a_b)是一系列遺傳學像，以遞增的分辨率顯示了鄰近Rcgl基因座的區 域的圖。7(a)中標有“A”的圖的圖距按cM計，且與IBM2相鄰4遺傳學圖有關。使用來自 BC7群體的184個個體，形成7(b)中標有“B”的圖的圖距，且使用來自BC7群體的1060個 個體，形成7(b)中標有“C”的圖的圖距。與公開的圖相比時，BC7群體的遺傳作圖使圖分 辨率增加超過10-倍。顯示在每個圖右邊的標記的位置是基于它們在物理圖上的定位的外 推。圖8(a_b)的遺傳學像顯示了 DE811ASR(BC3)中含有Rcgl基因座的染色體區 間，在DE811ASR(BC5)中得到的含有Rcgl基因座的染色體區間的減小的大小，和最初使用 DE811ASR(BC5)作為供體來源得到的近交中染色體區間的進一步減小的大小。關于所有標 記，在Maize⑶B上可公開得到的IBM2相鄰圖上報道顯示的圖距，除了 MZA15842、FLP27和 FLP56之外，使用相對于圖7(b)中圖B和C的高分辨率圖的回歸分析，外推它們的圖位置， 其中使用兩種圖共有的UMC2285、PHI093和CSU166a位置。圖9 (a-b)。圖9 (a)顯示了來自DE811ASR(BC5)的非同線性區域相對于B73和Mol7 的比對。圖9 (a)中的BAC大小是估計值。圖9(b)顯示了其上存在Rcgl的SEQ ID NO 137 所述的非同線性區域的部分，包括其中的重復區域以及Rcgl外顯子1和2。圖10 (a-b)顯示了分別在DE811ASR(BC5)和DE811系中接種Cg后15天時不同單 個植物中平均葉子損傷大小的分布。圖11顯示了接種后7和15天時感染了 Cg的DE811和DE811ASR(BC5)植物上的 平均葉子損傷大小的對比。圖12顯示了使DE811ASR(BC5)和DE811與指示的系雜交產生的雜種的莖在接種 Cg后4-5周時疾病的平均嚴重性。圖13顯示了與使DE811與指示的系雜交產生的雜種的產量相比，使 DE811ASR(BC5)與指示的系雜交產生的雜種在接種Cg后成熟時產量的提高。圖14顯示了接種后4-5周從DE811ASR(BC5)或MP305衍生的近交系的莖中由Cg 造成的5個不同位置處的疾病嚴重性。Rcgl基因陽性和陰性的系之間的差異是統計學上顯 著的，P值小于0. 05。圖15顯示了來自Rcgl陽性和陰性的近交PH705系的代表性莖的疾病進展。圖16顯示了來自Rcgl陽性和陰性的近交PH87P系的代表性莖的疾病進展。圖17顯示了通過使DE811ASR(BC5)與指定系雜交衍生的雜種的莖的在5個不同 位置處接種4-5周后由Cg造成的疾病嚴重性。Rcgl基因陽性和陰性的系之間的差異是統計學上顯著的，P值小于0. 05，例外是位置5。圖18顯示了從Rcgl陽性和陰性的PH4CV和PH705系生成的雜種的代表性莖的疾
病進展。圖19顯示了從Rcgl陽性和陰性的PH705和PH87P系生成的雜種的代表性莖的疾
病進展。圖20顯示了給玉米莖的疾病嚴重性評分的方法。給莖評出指定為antgr75的評 分， 它代表著超過75%變色的節間的數目(最高達5，包括接種的節間)。這產生范圍為0-5 的評分，0表示在接種的節間小于75%變色，且5表示前5個節間(包括接種的節間)的 75%或更多變色。圖21顯示了與插入了含有DE811ASR(BC5)的Rcgl非同線性區域的區域同源的 B73物理圖上的毗連群，這證實了在可以得到序列信息的目標區域中可得到許多B73衍生 的細菌人工染色體(BAC)。圖22顯示了含有MZA和公開標記的遺傳學圖與Mol7和B73的物理圖的比對。使 用來自BC7作圖群體的1060個體，顯示遺傳學圖距離。Mol7BAC文庫的分析也表明Rcgl 基因座與Mo 17的對應區域是非同線性的。從Mo 17物理圖定位外推出虛線顯示的標記在 B73圖中的定位。從B73物理圖定位外推出虛線顯示的標記在Mo 17圖中的定位。圖23顯示了為使用INVADER 檢測系統反應而設計的Rcgl雜交標記的寡核苷酸。圖24顯示了為使用TaqMan 檢測系統反應而設計的Rcgi雜交標記的寡核苷酸。圖25顯示了從接種后0、3、6、9和13天(dpi)的抗性的和易感的植物分離的約 1. 5mg聚腺苷酸-富集的RNA得到的RNA印跡的結果。用隨機引物標記的420bp Rcgl片段 探測膜。抗性組織來自DE811ASR(BC5)，且易感組織來自DE811。圖26表明，使用Rcgl特異性的引物對的PCR擴增僅僅擴增抗性系DE811ASR(BC5) 和供體親本MP305，但是在易感系DE811中卻不能，例外是FLP110F-R，它擴增高度保守的卷 曲螺旋_核苷酸結合位點區域，并從而擴增DE811系的基因組中非Rcgl的其它區域。IOObp 梯用于片段定大小。圖27顯示了一系列V7-9玉米植物的葉鞘，其在組織創傷之后利用Cg孢子懸浮 液進行接種。這些結果被進一步討論于實施例8中。在缺少Rcgl轉基因時(頂行)，含有 Rcgl基因的植物的葉鞘展示了大的、擴展的壞死損傷。相反，當存在Rcgl轉基因時(在該 情況中，由其自己的啟動子驅動)(底行)，恢復了 ASR抗性表型，并且壞死被限定/限制于 創傷和真菌接種位點。圖28顯示利用ETJ115-ETJ116引物對進行的RT-PCR的結果。該數據明確顯示 BAC克隆191超毗連群的NBS-LRR基因專有地表達于含有MP305基因漸滲區的DE811ASR植 物中，正如在實施例9中所討論的。圖29顯示Rcglb基因的預測結構域結構，正如在實施例9中所討論的。圖30顯示Northern印跡分析的結果，其允許獨立地確認Rcglb表達，并提供了估 計的轉錄物大小。多聚A+來自于抗性和易感植物(0，6，13DPI)的RNA(0. 7mg)的Northern 印跡顯示存在4. 75kb的轉錄物條帶，其僅僅存在于抗性樣品中，其與從LRR以及基因的激 酶區域制備的探針特異性雜交，正如在實施例9中所討論的。
圖31a 31g提供了實施方案的Rcglb肽(SEQ ID NO 246)與來自大麥和稻的許 多NBS-LRR蛋白的比對，其顯示了同源區。圖32a和32b提供了 SEQ ID NO 246 (其與SEQ ID NO 256所列是分開的)的氨 基酸1036 1399與在BLAST P同源性檢索中所鑒定的許多推定蛋白激酶(SEQ ID NOs 252-254)的比對。圖33總結了在存在和不存在天然Rcgl轉基因時，RcglKO植物的葉鞘感染數據， 正如在實施例8中所討論的。圖34顯示了來自被實施例10中所描述構建體E所轉化的植物的葉鞘測定的結 果。可見到明顯的Cg感染特征。圖35顯示來自被實施例10中所描述構建體C所轉化的植物的葉鞘測定的結果。 可見到明顯的Cg感染特征。
圖36來自被實施例10中所描述構建體D所轉化的植物的葉鞘測定的結果。這些 葉子明顯顯示了由于同時存在和表達Rcgl和Rcglb基因的Cg感染的抑制。發明詳述本發明實施方案提供了涉及誘導植物的病原體抗性、尤其是真菌抗性的組合物和 方法(或工藝)。該組合物是賦予或增強對植物真菌病原體的抗性的新的核苷酸和氨基酸 序列。具體地，某些實施方案提供了具有SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 246所述氨基酸序列 的多肽，和其變體和片段。另外提供了分離的核酸分子，和其變體和片段，它們包含編碼SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 246所示氨基酸序列的核苷酸序列。在SEQ ID NO :1和4中，描述了編碼SEQ ID NO 3的多肽的核苷酸序列。編碼SEQ ID NO 246的多肽的核苷酸序列列于SEQ ID NO 255 258以及246和266中。Rcglb基 因及其側接區的基因組序列提供與SEQ ID NO 255 258或在SEQ ID NO 266中，其在實 施例9中被更詳細地討論。編碼SEQ ID NO 246的多肽的cDNA序列列于SEQ IDNO 245 中。在本文中也公開了包含編碼實施方案的多肽的核苷酸序列的植物、植物細胞、種子和微 生物。在布達佩斯條約規定下，2006年2月22日將Rcgl核酸分子保藏在位于國家農業 禾1Jfflff胃(National Center for Agricultural UtilizationResearch(NCAUR))白勺 微生物基因座和生物工藝研究單位(MicrobialGenomics and Bioprocessing Research Unit)的農業研究機構保藏中心(Agricultural Research Service(ARS) Culture Collection)。為保藏物給出下面的登記號NRRL B-30895。NCAUR的地址是1815N. UniversityStreet, Peoria, IL，61604。在國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯 條約的條款下，維持該保藏。該保藏僅僅為了本領域技術人員的方便而作出的，且不是對在 35U. S. C. § 112下需要的保藏物的承認。保藏將是不可撤回的，且在專利授權后對公眾的獲 取沒有限制或條件。但是，應當理解，保藏物的可獲得并不構成對破壞由政府行為授予的專 利權的實施主題發明的許可。在2006年3月13日，將2500粒DE8IlASR(BC5)種子的樣品保藏在美國典型培 養物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)), 10801University Blvd., Manassas, VA 20110-2209，USA，分配的保藏號是PT0-7434。在本申請未決期間，專利和商 標官員(Commissioner of Patentsand Trademarks)、在請求后獲得授權的由官員確定的人員和在提交本專利申請的外國專利局的相應官員可以獲得該保藏物。在國際承認用于專 利程序的微生物保存布達佩斯條約的條款下，維持該保藏物。保藏將是不可撤回的，且在專 利授權后對公眾的獲取沒有限制或條件。但是，應當理解，保藏物的可獲得并不構成對破壞 專利權的實施主題發明或方法的許可。在布達佩斯條約規定下，2007年6月22日將Rcglb核酸分子保藏在位于國家農 WJfflff^Φ^^ (National Center for AgriculturalUtilization Research(NCAUR)) ^ 微生物基因座和生物工藝研究單位(Microbial Genomics and Bioprocessing Research Unit)的農業研究機 構保藏中心(Agricultural Research Service(ARS) Culture Collection)。為保藏物給出下面的登記號NRRL B-50050。NCAUR的地址是1815N. University Street, Peoria, IL，61604。在國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯 條約的條款下，維持該保藏。該保藏僅僅為了本領域技術人員的方便而作出的，且不是對在 35U. S. C. § 112下需要的保藏物的承認。保藏將是不可撤回的，且在專利授權后對公眾的獲 取沒有限制或條件。但是，應當理解，保藏物的可獲得并不構成對破壞由政府行為授予的專 利權的實施主題發明的許可。實施方案的兩條全長多肽(SEQ ID NO 3和246)與NBS-LRR家族的已知多肽 具有不同程度的同源性。具體地，Rcgl(SEQ ID NO 3)與從稻(Oryza sativa)(登記號 NP_910480 (SEQ ID NO 14)、NP_910482 (SEQ ID NO 16)、NP_921091 (SEQ ID NO 17)禾口 NP_910483 (SEQ IDNO : 15))和大麥(Hordeum Vulgare)(登記號 AAG37354 (SEQ ID NO 18)； Zhou等，(2001)Plant Cell 13 :337_350)分離的NBS-LRR蛋白具有同源性。圖2提供了 SEQ ID NO :3所述的氨基酸序列與稻和大麥蛋白(SEQID NO 14-18)的比對。使用GAP程 序以將SEQ ID NO :3與各種上述稻和大麥序列的氨基酸比對表明，SEQ ID NO :3與稻蛋白 NP_910480 (SEQ ID NO 14)共有約 42. 3%序列相似性，與稻蛋白 NP_910482 (SEQID NO 16) 共有41.7%序列相似性，與稻蛋白NP_921091(SEQ ID N0 17)共有56. 9%相似性，且與稻 蛋白NP_910483 (SEQ ID NO 15)共有42. 1 %序列相似性。此外，SEQ ID NO :3與大麥蛋白 AAG37354(SEQ IDNO 18)共有約 42. 8%序列相似性。對Rcgl肽(SEQ ID NO 246)進行相似的分析，發現其與從稻分離的NBS-LRR蛋 白(登記號 Nos. ABA95308 (SEQ ID NO 250)，ABG66042 (SEQID NO 251), ABA92208 (SEQ ID NO 247)和 ABG66044(SEQ ID NO 248))和從大麥分離的蛋白(登記號 No. AAM22820 (SEQ ID N0249))具有同源性。圖31a 31g提供了 SEQ ID NO :246所列氨基酸序列與其中上 面以登記號提供的稻和大麥蛋白(SEQ ID NOs 247-251)的比對。使用ClustalW成對比 對的氨基酸比對(缺口開口罰分=10，缺口延伸罰分=0. 1)表明SEQ ID N0:246與稻蛋 白ABA92208 (SEQ ID NO 247)具有大約37. 的序列同一性，與稻蛋白ABG66044(SEQ ID NO: 248)具有28. 2%的序列同一性，與稻蛋白ABA95308(SEQ ID NO 250)具有26. 6%的同 一性，與稻蛋白ABG66042(SEQ ID NO 251)具有31. 1 %的序列相似性。此外，SEQ ID N0: 3與大麥蛋白AAM22820(SEQ ID NO 249)具有25. 6%的序列相似性。NBS-LRR組的R-基因是迄今為止發現的最大類R-基因。在鼠耳芥(Arbidopsis thaliana)中，預期該基因組中存在超過150個(Meyers，等，(2003)，Plant Cell, 15 809-834 ;Monosi，等，(2004)，Theoretical andApplied Genetics, 109 1434—1447)，而在 稻中，已經預測了約500個NBS-LRR基因(Monosi，(2004)同上)。NBS-LRR類的R基因包含2個亞類。第一類NBS-LRR基因含有在它們的N’末端的TIR-Toll/白細胞介素_1樣結 構域；迄今為止僅在雙子葉植物中發現它們(Meyers，(2003)同上；Monosi，(2004)同上)。 第二類NBS-LRR含有在它們N末端的卷曲螺旋結構域或(nt)結構域(Bai，等(2002)Genome Research, 12 1871-1884 ；Monosi, (2004)同上；Pan，等，(2000), Journal of Molecular Evolution, 50 203-213)。已經在雙子葉植物和單子葉植物物種中發現了第二類NBS-LRR。 (Bai, (2002)同上；Meyers，(2003)同上；Monosi，(2004)同上；Pan，(2000)同上)。基因的NBS結構域似乎在植物防御機制的信號傳導中起作用(vander Biezen, 等，(1998)，Current Biology :CB，8 :R226_R227)。LRR 區域似乎是與病原體 AVR 產物相互 作用的區域(Michelmore，等，(1998)，Genome Res.，8 1113-1130 ；Meyers, (2003)同上)。 與NBS結構域相比，該LRR區域處于大得多的多樣性選擇壓力下(Michelmore，(1998)同 上；Meyers, (2003)同上；Palomino,等，(2002)，Genome Research, 12 1305—1315)。LRR 結 構域也見于其它背景下；這些20-29-殘基基序以串聯陣列存在于具有不同功能的許多蛋 白中，所述功能例如激素-受體相互作用、酶抑制、細胞粘附和細胞運輸。許多最近的研究 揭示，LRR蛋白參與早期哺乳動物發育 、神經發育、細胞極化、基因表達的調節和細胞凋亡信 號傳導。實施方案的基因顯然與第2類家族的NBS-LRR相關，但是不會完全擬合經典模型。 氨基端與所謂的核苷酸結合位點(NBS)具有同源性。也存在富亮氨酸的區域，如預期的， 位于NBS的下游。但是，與以前研究的NBS-LRR蛋白不同，富亮氨酸的區域缺少在更經典 的LRR結構域中發現的系統性重復性質，在一般Lxx重復模式后一致性更低，且尤其不具有 Wang 等((1999)Plant J. 19 :55_64 ；尤其參見，圖 5)或Bryan 等((2000)，Plant Cell 12 2033-2045 ；尤其參見，圖3)所述的共有序列的實例。除了 NBS和LRR結構域外，Rcglb含 有蛋白激酶結構域。由于LRR區域是NBS-LRR的受體部分，所以當發現新的LRR時，例如本發明公開的 那些，從該序列不能立即明顯得出它的活性范圍，即它會起反應的病原體的范圍。在Cg抗 性表型的基礎上，分離了實施方案的基因，且因此新的LRR對Cg反應。但是，不排除它們對 在此前進行的工作中沒有測定的其它病原體反應。實施方案的核酸和多肽可以用于賦予或增強植物的真菌抗性的方法中。因此，本 文公開的組合物和方法可以用于保護植物免受真菌病原體。“病原體抗性”、“真菌抗性”和 “疾病抗性”意指該植物避免疾病癥狀，所述癥狀是植物-病原體相互作用的結果。也就是 說，預防病原體造成植物疾病和相關的疾病癥狀，或者，使病原體造成的疾病癥狀最小化或 減輕，例如，減少應激和相關的產量損失。本領域技術人員將明白，本文公開的組合物和方 法可以與本領域用于保護植物免受病原體攻擊的其它組合物和方法一起使用。因此，實施方案的方法可以用于保護植物免受疾病，尤其由植物真菌病原體造成 的那些疾病。本文使用的“真菌抗性”指，與野生型植物相比，增強的對真菌病原體的抗性或 耐受性。作用可以從對真菌病原體作用耐受性的輕微增加(例如，部分抑制)至完全抗性， 從而使植物不受真菌病原體存在的影響。增加水平的對特定真菌病原體或對更廣譜真菌病 原體的抗性，構成“增強的”或提高的真菌抗性。本發明實施方案也將增強或提高真菌植物 病原體抗性，從而使植物對真菌病原體或病原體的抗性增加。術語“增強”指提高、增加、擴 增、倍增、升高、增高等。在本文中，將本發明的植物描述成抗Cg感染，或對Cg感染具有增強的抗性'，這是本發明的Rcgl基因座的結果。因此，與因為缺少Rcgl基因座而對Cg感染易感的等價植物相比，它們通常表現出增加的對疾病的抗性。例如，使用實施例11(也參 見圖20)所述的評分系統，與因為缺少Rcgl基因座而對Cg感染易感的等價植物相比時，它 們的感染評分通常表現出1點、2點、或3點或更多的降低，甚至評分減少至1或0。在具體方面，賦予或增強植物的真菌抗性的方法包含，向植物中導入至少一個表 達盒，其中所述表達盒包含編碼實施方案的抗真菌多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列各 自可操作地連接到驅動在植物中的表達的啟動子上。植物表達這兩種多肽，從而賦予植物 真菌抗性，或提高植物的固有抗性水平。在具體實施方案中，該基因賦予對真菌病原體Cg 的抗性。如果需要，本領域技術人員能夠制造兩種獨立的轉基因植物，其各自表達這兩種多 肽的一種，并然后將這兩種植物雜交，選擇表達這二者多肽的植物。實施方案的抗真菌多肽的表達，可以靶向其中病原體抗性是特別重要的特定植物 組織，例如，葉子、根、莖或維管組織。這樣的組織-優選的表達可以通過根-優選的、葉 子_優選的、維管組織_優選的、莖_優選的、或種子_優選的啟動子來實現。本文使用的“核酸”包括單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物， 且除非另有限制，包括具有天然核苷酸的基本性質、表現為它們以與天然存在的核苷酸類 似的方式與單鏈核酸雜交的已知類似物(例如，肽核酸)。術語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換地用于指氨基酸殘基的聚合物。該術 語適用于氨基酸聚合物，其中一個或多個氨基酸殘基是對應天然存在的氨基酸的人工化學 類似物，也適用于天然存在的氨基酸聚合物。實施方案的多肽可以從本文公開的核酸生產， 或通過使用標準的分子生物學技術生產。例如，實施方案的截短的蛋白可以通過在適當宿 主細胞中表達實施方案的重組核酸來生產，或者通過先體外后體內方法的組合，例如蛋白 酶消化和純化來生產。當在指定的核酸的上下文中使用時，本文使用的術語“編碼”或“編碼的”指，該核 酸包含指導核苷酸序列翻譯成指定蛋白的必需信息。通過使用密碼子，指定編碼蛋白的信 息。編碼蛋白的核酸可以包含在核酸的翻譯區內的非翻譯序列(例如，內含子)，或可以缺 少這樣的間插非翻譯序列(例如，象在cDNA中那樣)。本發明實施方案包括分離的或基本上純化的多核苷酸或蛋白組合物。“分離的” 或“純化的”多核苷酸或蛋白、或其生物活性部分，是相當大地或基本上不含有在它天然存 在的環境中發現的正常伴隨該多核苷酸或蛋白或與其相互作用的組分。因而，分離的或純 化的多核苷酸或蛋白基本上不含有其它細胞材料，或當通過重組技術(例如PCR擴增)生 產時的培養基，或當化學合成時基本上不含有化學前體或其它化學藥品。最佳地，“分離的” 多核苷酸不含有在該多核苷酸所來源的生物的基因組DNA中天然側接該多核苷酸的序列 (即，位于多核苷酸的5'和3'末端的序列)(例如，蛋白編碼序列)。例如，在各種實施方 案中，分離的多核苷酸可以含有小于約5kb、約4kb、約3kb、約2kb、約lkb、約0. 5kb、或約 0. Ikb的在該多核苷酸所來源的細胞的基因組DNA中天然側接該多核苷酸的核苷酸序列。 基本上不含有細胞材料的蛋白包括含有小于約30%、約20%、約10%、約5%、或約1 % (按 干重計)的污染蛋白的蛋白制劑。當重組生產實施方案的蛋白、或其生物活性部分時，培養 基最佳地代表小于約30%、約20%、約10%、約5%、或約(按干重計)的化學前體或非 目標蛋白化學藥品。
實施方案也包括公開的核苷酸序列和其編碼的蛋白的片段和變體。“片段”意在指 核苷酸序列的部分或氨基酸序列的部分，和由此編碼的蛋白。核苷酸序列片段可以編碼保 持天然蛋白的生物活性的蛋白片段，并因此具有賦予植物真菌抗性的能力。或者，用作雜交 探針的核苷酸序列片段不一定編碼保持生物活性的片段蛋白。因而，核苷酸序列片段可以 是至少約15個核苷酸、約50個核苷酸、約100個核苷酸，且最高達編碼實施方案多肽的全 長核苷酸序列。編碼實施方案多肽的生物活性部分的核苷酸序列片段將編碼至少約15、約25、約 30、約40、或約50個鄰接氨基酸，或最高達實施方案全長多肽中存在的氨基酸總數(例如， SEQ ID NO :1編碼的肽的980個氨基酸)。用作雜交探針或PCR引物的核苷酸序列片段通 常不需要編碼蛋白的生物活性部分。當提及指定的多核苷酸時，本文使用的“全長序列”指天然序列的整個核酸序列。 “天然序列”意在指內源序列，即見于生物基因組中的非工程改造的序列。 因而，實施方案核苷酸序列的片段可以編碼多肽的生物活性部分，或它可以是用 作使用下述方法的雜交探針或PCR引物的片段。通過分離實施方案核苷酸序列之一的部 分，表達編碼的蛋白部分，和評價編碼的蛋白部分賦予或增強植物的真菌抗性的能力，可以 制備抗病原體多肽的生物活性部分。作為實施方案的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至 少約15、約20、約50、約75、約100、或約150個核苷酸，或最高達本文公開的全長核苷酸序 列中存在的核苷酸數目(例如，對于SEQ ID N0:l，4212個核苷酸)。“變體”意在指基本上類似的序列。對于多核苷酸，變體包含在天然多核苷酸內的 一個或多個內部位點處缺失和/或添加一個或多個核苷酸，和/或在天然多核苷酸的一個 或多個位點置換一個或多個核苷酸。本文使用的“天然”多核苷酸或多肽分別包含天然存 在的核苷酸序列或氨基酸序列。本領域技術人員將認識到，可以構建實施方案核酸的變體， 從而維持可讀框。關于多核苷酸，保守變體包括這樣的序列，其因為遺傳密碼的簡并性，編 碼實施方案多肽之一的氨基酸序列。天然存在的等位基因變體，例如使用眾所周知的分子 生物學技術(例如，下述的聚合酶鏈反應(PCR)和雜交技術)可以鑒別出的那些。變體多 核苷酸也包括合成地衍生的多核苷酸，例如使用例如定點誘變產生、但是仍然編碼實施方 案蛋白的那些。通常，如通過本文別處所述的序列比對程序和參數測得的，實施方案的特定 多核苷酸的變體與該特定多核苷酸將具有至少約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、 約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95 %、約96 %、約97 %、約98 %、約99 %或更高序列同一性。通過對比變體多核苷酸編碼的多肽和參照多核苷酸編碼的多肽之間的百分比序 列同一性，也可以評價實施方案的特定多核苷酸(即，參照多核苷酸)的變體。因而，例如， 公開了編碼與SEQ ID NO :3或246的多肽具有給定百分比序列同一性的多肽的分離的多核 苷酸。使用本文別處所述的序列比對程序和參數，可以計算任意2個多肽之間的百分比序 列同一性。當通過對比它們編碼的2個多肽共有的百分比序列同一性來評價任意一對給定 的實施方案多核苷酸時，2個編碼的多肽之間的百分比序列同一性是至少約40%、約45%、 約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高序列同一性。“變體”蛋白意在指，通過在天然蛋白的一個或多個內部位點處缺失或添加一個或多個氨基酸，和/或在天然蛋白的一個或多個位點處置換一個或多個氨基酸，從天然蛋白衍生出的蛋白。實施方案包括的變體蛋白是生物活性的，也就是說，它們繼續具有需要的天 然蛋白的生物活性，即本文所述的賦予或增強植物真菌病原體抗性的能力。這樣的變體可 以源自例如基因多態性或人工操作。如通過本文別處所述的序列比對程序和參數測得的， 實施方案天然蛋白的生物活性變體與天然蛋白的氨基酸序列將具有至少約40%、約45%、 約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的序列同一性。實 施方案蛋白的生物活性變體可以與該蛋白相差少至約1-15個氨基酸殘基，少至約1-10個、 例如約6-10個、少至約5個、少至4、3、2或甚至1個氨基酸殘基。可以以各種方式改變實施方案的蛋白，包括氨基酸置換、缺失、截短和插入。這 樣的操作的方法是本領域普遍已知的。例如，通過DNA突變，可以制備出抗病原體蛋白 的氨基酸序列變體和片段。誘變和多核苷酸改變的方法是本領域眾所周知的。參見，例 如，Kunkel (1985)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 82 488-492 ；Kunkel 等(1987)Methods in Enzymo 1. 154 :367_382 ；美國專利號 4，873，192 ；Walker 和 Gaastra，編· (1983) Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company, NewYork)禾口其中弓I用的參考文 獻。關于不影響目標蛋白的生物活性的適當氨基酸置換的指南，可以參見本文引作參考的 Dayhoff 等(1978)Atlasof Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C.)的模型。保守置換可能是最佳的，例如將一個氨基酸替換為具有類似性 質的另一個氨基酸。因而，實施方案的基因和多核苷酸包括天然存在的序列以及突變體形式。類似地， 實施方案的蛋白包括天然存在的蛋白及其變體和修飾形式。這樣的變體將繼續具有需要的 賦予或增強植物真菌病原體抗性的能力。顯然，將在編碼變體的DNA中產生的突變必須不 能將該序列置于讀框之外，且最佳地將不產生互補區，后者會產生二級mRNA結構。參見，歐 洲專利號0075444。預期本文包含的蛋白序列的缺失、插入和置換不產生蛋白特征的根本變化。但是， 當事先難以預測置換、缺失或插入的確切作用時，本領域技術人員將明白，將通過篩選已經 用變體蛋白轉化的轉基因植物，以確定對植物的抗真菌病原體攻擊能力的作用，來評價該 作用。變體多核苷酸和蛋白也包括源自誘變或重組操作的序列和蛋白，包括且不限于諸 如DNA改組的操作。本領域技術人員能預見到會改變蛋白響應的病原體范圍的修飾。利 用這樣的操作，可以操縱一個或多個不同的蛋白編碼序列，以生成具有所需的性質的新蛋 白。以此方式，從包含具有相當大序列同一性、且可以體外或體內同源重組的序列區域的 相關序列多核苷酸群體生成重組多核苷酸文庫。例如，使用該方案，可以使編碼目標結構 域的序列基序在實施方案的蛋白基因和其它已知蛋白基因之間改組，以得到編碼具有提 高的目標性質的蛋白的新基因，例如提高的賦予或增強植物真菌病原體抗性的能力。這 樣的DNA改組的策略是本領域已知的。參見，例如，Stemmer (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 10747-10751 ；Stemmer(1994)Nature 370 :389_391 ；Crameri 等(1997)Nature Biotech. 15 :436_438 ；Moore 等(1997)J.Mol. Biol. 272 :336_347 ；Zhang 等(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 4504-4509 ；Crameri 等(1998) Nature 391 :288_291 ；和美國專利號 5，605，793 和 5，837，458。實施方案的多核苷酸可以用于從其它生物、尤其其它植物分離對應的序列。以此 方式，諸如PCR、雜交等的方法等可以用于鑒別這樣的序列，這基于它們與本文所述序列的 序列同源性。實施方案包括，基于它們與本文所述整個序列或其變體和片段的序列同一性 而分離的序列。這樣的序列包括作為公開序列的直向同源物的序列。“直向同源物”意在指 源自共同祖先基因且由于物種形成而見于不同物種中的基因。當它們的核苷酸序列和/或 它們編碼的蛋白序列共有至少約60 %、約70 %、約75 %、約80 %、約85 %、約90 %、約91 %、 約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或更大的序列同一性 時，認為在不同物種中發現的基因是直向同源物。直向同源物的功能經常在物種間是高度 保守的。因而，實施方案包括分離的多核苷酸，其編碼賦予或增強真菌植物病 原體抗性的蛋 白，且在嚴格條件下與本文公開的序列或其變體或片段雜交。在PCR方案中，可以設計寡核苷酸引物用于PCR反應中，以從提取自任意目標生物 的cDNA或基因組DNA擴增對應的DNA序列。設計PCR引物和PCR克隆的方法，是本領域 普遍已知的，且公開在 Sambrook 等(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (2d ed. , Cold SpringHarbor Laboratory Press, Plainview, New York)。也參見 Innis 等， 編· (1990) PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (AcademicPress, New York) ；Innis禾口Gelfand,編· (1995)PCR Strategies(AcademicPress,New York)；禾口Innis 禾口 Gelfand，編· (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)。已知的 PCR 方 法包括、且不限于，使用配對引物、嵌套引物、單特異性引物、簡并引物、基因-特異性引物、 載體_特異性引物、部分地錯配的弓I物等的方法。在雜交技術中，使用全部或部分已知的多核苷酸作為探針，該探針選擇性地與存 在于從選定的生物克隆的基因組DNA片段或cDNA片段群體(即，基因組或cDNA文庫)中 的其它對應多核苷酸雜交。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡 核苷酸，且可以用可檢測基團(例如32P)或任意其它可檢測標記作出標記。因而，例如，通 過標記基于實施方案多核苷酸的合成寡核苷酸，可以制作雜交探針。制備雜交探針和構建 cDNA和基因組文庫的方法，是本領域普遍已知的，且公開在Sambrook等(1989)同上。例如，本文公開的整個多核苷酸、或其一個或多個部分，可以用作能特異性與對應 多核苷酸和信使RNA雜交的探針。為了實現在許多條件下的特異性雜交，這樣的探針包括 獨特的、且最佳為至少約10個核苷酸長、至少約15個核苷酸長或至少約20個核苷酸長的 序列。這樣的探針可以用于通過PCR從選定的生物擴增對應多核苷酸。該技術可以用于從 所需生物分離其它編碼序列，或作為確定生物中存在編碼序列的診斷測定。雜交技術包括 鋪平板的DNA文庫的雜交篩選(噬斑或菌落；參見，例如，Sambrook等(1989)同上)。這樣的序列的雜交可以在嚴格條件下進行。“嚴格條件”或“嚴格雜交條件”意指 這樣的條件，在該條件下，探針將與它的靶序列的雜交程度在檢測上大于與其它序列的雜 交程度(例如，為背景的至少2-倍)。嚴格條件是序列-依賴性的，且在不同情況下將是不 同的。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可以鑒別出與探針100%互補的靶序列(同 源探測)。或者，可以調節嚴格性條件，以允許序列中的有些錯配，從而檢測更低程度的相似 性(異源探測)。通常，探針的長度小于約1000個核苷酸，最佳長度小于500個核苷酸。一般地，嚴格條件是這樣的，其中鹽濃度小于約1. 5M Na離子，通常約0. 01-1. OMNa離子濃度(或其它鹽)，pH 7. 0-8. 3，且對于短探針(例如，10_50個核苷酸)，溫度是至 少約30°C，而對于長探針(例如，大于50個核苷酸)，溫度是至少約60°C。通過加入去穩定 劑例如甲酰胺，也可以達到嚴格條件。示例性的低嚴格性條件包括，在37°C用30-35%甲酰 胺、IM NaCl、l% SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液雜交，及在50_55°C在1X-2X SSC(20X SSC = 3. OM NaCl/0. 3M檸檬酸三鈉)中洗滌。示例性的中等嚴格性條件包括，在37°C、在 40-45%甲酰胺、1.0M NaCl、l% SDS中雜交，和在55-60°C、在0. 5X-1X SSC中洗滌。示例性 的高嚴格性條件包括，在37°C、在50%甲酰胺、IM NaClU % SDS中雜交，最后在60-65 °C、在
0.IX SSC中洗滌至少30分鐘。任選地，洗滌緩沖液可以包含約0. -約SDS0雜交 持續時間通常小于約24小時，經常約4-約12小時。洗滌持續時間將至少是足以達到平衡 的時間長度。特異性通常隨雜交后的洗滌而變化，關鍵因素是最終洗滌溶液的離子強度和溫 度。 對于 DNA-DNA 雜交體，可以從 Meinkoth 和 Wahl (1984) Anal. Biochem. 138 :267_284 的 方程估計出熱解鏈溫度(Tm) =Tm = 81. 50C +16. 6 (log M)+0. 41 (% GC)-0. 61 (% form)-500/ L ；其中M是單價陽離子的體積摩爾濃度，% GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，% form是雜交溶液中甲酰胺的百分比，且L是按堿基對計算的雜交體長度。Tm是50%的互 補靶序列與完全匹配的探針雜交時的溫度(在確定的離子強度和PH下)。對于每的錯 配，Tm降低約1°C ；因而，可以調節Tm、雜交和/或洗滌條件，以與所需同一性的序列雜交。 例如，如果要得到具有> 90%同一性的序列，則可以使Tm降低10°C。通常，將嚴格性條件選 擇在，在確定的離子強度和PH處，比特定序列序列和它的互補體的Tm低約5°C。但是，非常 嚴格的條件可以使用比1低1、2、3或4°C的雜交和/或洗滌；中等嚴格性條件可以使用比 Tm低6、7、8、9或10°C的雜交和/或洗滌；低嚴格性條件可以使用比Tm低11、12、13、14、15 或20°C的雜交和/或洗滌。使用該方程、雜交和洗滌組合物和所需的Tm，本領域普通技術人 員將理解，內在地描述了雜交和/或洗滌溶液的嚴格性的變化。如果所需的錯配程度產生 小于45°C (水性溶液)或32°C (甲酰胺溶液)的Tm，則最佳地增加SSC濃度，從而可以使 用更高的溫度。關于核酸雜交的廣泛指南，參見Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes, Part
1,Chapter 2 (Elsevier, New York)；禾口 Ausubel 等，編· (1995) Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2(GreenePublishing and ffiley-Interscience,New York)。 參見Sambrook等(1989)同上。各種方法可以用于檢查存在或不存在DNA、RNA、或蛋白的特定序列。它們包括，例 如，DNA印跡、RNA印跡、蛋白印跡和ELISA分析。這樣的技術是本領域技術人員眾所周知 的，且存在許多參考文獻，它們提供了詳細方案。這樣的參考文獻包括Sambrook等(1989) 同上，禾口 Crowther，J. R. (2001)，The ELISA Guidebook, Humana Press, Totowa, NJ, USA。下面的術語用于描述2個或更多個多核苷酸或多肽之間的序列關系(a) “參照序 列，”(b) “對比窗，”(c) “序列同一性，”和，(d) “序列同一性百分比”。(a)本文使用的“參照序列”是用作序列對比的基礎的確定序列。參照序列可以是 指定序列的子集或整體；例如，作為全長cDNA或基因序列的片段，或整個cDNA或基因序列。(b)本文使用的“對比窗”指多核苷酸序列的鄰接的和指定的片段，其中與用于2 個多核苷酸的最佳比對的參照序列(不包含添加或缺失)相比，對比窗中的多核苷酸序列可以包含添加或缺失(即，缺口)。通常，對比窗的長度是至少約20個鄰接核苷酸，且任選 地可以是約30、約40、約50、約100、或更長。本領域技術人員理解，為了避免由于在多核苷 酸序列中包含缺口而與參照序列的高相似性，通常導入缺口罰分，并從匹配數目中減去。比對對比序列的方法是本領域眾所周知的。因而，使用數學算法，可以確定任 意2個序列之間的序列同一性百分比。這樣的數學算法的非限制性實例是Myers和 Miller (1988)CABI0S4 :11_17 的算法；Smith 等(1981)Adv. Appl. Math. 2 482 的局部比 對算法；Needleman 和 Wunsch(1970) J. Mol. Biol. 48 :443_453 的全局比對算法；Pearson 和 Lipman (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85 2444-2448 的局部搜索比對方法；Karlin 禾口 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264 的算法，如在 Karlin 和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5877 中所改進的。這些數學算法的計算機實現，可以用于對比序列，以確定序列同一性。這樣的實 現包括，且不限于PC/Gene 程序中的 CLUSTAL(可從 Intelligenetics，Mountain View, California 得到)；ALIGN 程序(2. 0)和 GCGWisconsin Genetics 軟件包 10 版(可從 Accelrys Inc. , 9685Scranton Road, San Diego，California，USA得到)中的GAP、BESTFIT、 BLAST、FASTA和TFASTA。使用默認參數，可以執行使用這些程序的比對。CLUSTAL程序 詳細記載在 Higgins 等(1988)Gene 73:237-244(1988) ；Higgins 等(1989)CABIOS 5 151-153 ；Corpet 等(1988)Nucleic Acid Res. 16 10881-90 ；Huang 等(1992)CABIOS 8 155-65 ；和 Pearson 等(1994) Meth. Mol. Biol. 24 :307_331。ALIGN 程序是基于上面 Myers 和Miller(1988)的算法。當對比氨基酸序列時，可以在ALIGN程序中使用PAM 120加權 殘基表，缺口長度罰分為12，缺口罰分為4。Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403的 BLAST程序是基于上面Karlin和Altschul (1990)的算法。可以用BLASTN程序進行BLAST 核苷酸搜索，評分=100，字長=12，以得到與編碼實施方案蛋白的核苷酸序列同源的核苷 酸序列。可以用BLASTX程序進行BLAST蛋白搜索，評分=50，字長=3，以得到與實施方案 蛋白或多肽同源的氨基酸序列。為了得到用于對比目的的有缺口的比對，可以如Altschul 等(1997) Nucleic Acid Res. 25 :3389 所述使用有缺口的 BLAST (在 BLAST 2. O 中)。或者， PSI-BLAST (在BLAST2.0中)可以用于進行重復搜索，其檢測分子之間的距離關系。參見 Altschul等(1997)同上。當使用BLAST、有缺口的BLAST、PSI_BLAST時，可以使用各程序 的默認參數(例如，對于核苷酸序列的BLASTN，對于蛋白的BLASTX)。參見網站ncbi. nlm. nih.gov。也可以通過目檢，手工地進行比對。除非另有說明，本文提供的序列同一性/相似性值指使用GAP 10版、使用下述參 數得到的值使用50的缺口權重和3的長度權重和nwsgapdna. cmp評分矩陣，核苷酸序列 的％同一性和％相似性；使用8的缺口權重和2的長度權重和BL0SUM62評分矩陣，氨基酸 序列的％同一性和％相似性；或其任意等價程序。“等價程序”是指，當與GAPlO版生成的對 應比對相對比時，對于任意2個正被討論的序列，產生具有相同核苷酸或氨基酸殘基匹配 和相同百分比序列同一性的比對的任意序列對比程序。GAP 使用 Needleman 和 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 443-453 的算法，以發現使 匹配數最大化且使缺口數最小化的2個完整序列的比對。GAP考慮所有可能的比對和缺口 位置，并產生具有最大數目的匹配堿基和最少缺口的比對。它允許提供以匹配堿基為單位 的缺口產生罰分和缺口延伸罰分。對于插入的每個缺口，GAP必須利用缺口產生罰分匹配數。如果選擇大于O的缺口延伸罰分，則GAP對于每個插入的缺口必須另外利用缺口長度乘以缺口延伸罰分。在GCG Wisconsin Genetics軟件包10版中，蛋白序列的默認缺口生 成罰分值和缺口延伸罰分值分別是8和2。對于核苷酸序列，默認缺口生成罰分是50，而 默認缺口延伸罰分是3。缺口生成和缺口延伸罰分可以表達為選自0-200的整數。因而， 例如，缺口生成和缺口延伸罰分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、55、60、65 或更大。GAP代表最佳比對家族的一個成員。該家族可以存在許多成員，且其它成員沒有更 好的品質。GAP表現出4個比對品質因數品質、比率、同一性和相似性。品質是計量最大化 的，以比對序列。比率是品質除以更短片段中的堿基數。百分比同一性是實際上匹配的符號 的百分比。百分比相似性是相似的符號的百分比。忽略在缺口對面的符號。當一對符號的 評分矩陣值大于或等于0.50 (相似性閾值)時，評為相似性。在GCG Wisconsin Genetics 軟件包10版中使用的評分矩陣是BL0SUM62 (參見Henikoff和Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915)。(c)在2個多核苷酸或多肽序列的上下文中，本文使用的“序列同一性”或“同一 性”指，當比對指定對比窗中的最大一致性時，2個序列中相同的殘基。當序列同一性百分 比用于指蛋白時，公認的是，不同的殘基位置的差異經常在于保守氨基酸置換，其中氨基酸 殘基被置換為具有類似化學性質(例如，電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基，且因此不改變 該分子的功能性質。當序列差異在于保守置換時，可以向上調節百分比序列同一性，以改正 置換的保守性質。據稱差異在于這樣的保守置換的序列具有“序列相似性”或“相似性”。 進行該調節的方法，是本領域技術人員眾所周知的。一般地，這包含將保守置換評分為部分 的、而不是完全的錯配，從而增加百分比序列同一性。因而，例如，當相同氨基酸評分為1、且 非保守置換評分為O時，保守置換評分是在0-1之間。計算保守置換的評分，例如，如在程 序 PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View, California)中所實現的。(d)本文使用的“序列同一性百分比”指，通過在對比窗中對比2個最佳比對的序 列測得的值，其中與用于2個序列的最佳比對的參照序列(不包含添加或缺失)相比，對比 窗中的多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即，缺口)。如下計算百分比確定2個序 列中存在相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數目，以得到匹配位置的數目，將匹配位置 的數目除以對比窗中的位置總數，并將結果乘以100，以得到序列同一性百分比。術語“多核苷酸”的應用，無意將實施方案限制為包含DNA的多核苷酸。本領域技 術人員將認識到，多核苷酸可以包含核糖核苷酸和核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合。 這樣的脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的類似物。實施方案的多 核苷酸也包括序列的所有形式，包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式等。實施方案的分離的多核苷酸可以整合入能導入宿主細胞并在其中復制的重組DNA 構建體中。“載體”可以是這樣的構建體，其包括復制系統和能在給定宿主細胞中轉錄和 翻譯多肽編碼序列的序列。已經描述了適用于穩定轉染植物細胞或確立轉基因植物的許 多載體，例如，Pouwels 等，Cloning Vectors :A Laboratory Manual，1985，supp. 1987 ； Weissbach 和 Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，AcademicPress，1989 ; 和 Flevin 等，Plant Molecular Biology Manual,KluwerAcademic Publishers，1990。一 般地，植物表達載體包括，例如，在5'和3'調節序列和顯性選擇標記的轉錄控制下的一個或多個克隆的植物基因。這樣的植物表達載體也可以含有啟動子調節區(例如，控制誘 導型或組成型、環境-或發育-調節的、或細胞-或組織-特異性的表達的調節區)、轉錄起 始位點、核糖體結合位點、RNA加工信號、轉錄終止位點和/或多腺苷酸化信號。術語“重組構建體”、“表達盒”、“表達構建體”、“嵌合構建體”、“構建體”、“重組DNA 構建體”和“重組DNA片段”在本文中可互換地使用，且是核酸片段。重組構建體包含核酸 片段的人工組合，包括且不限于，在自然界不一起發現的調節和編碼序列。例如，重組DNA 構建體可以包含源自不同來源的調節序列和編碼序列，或源自相同來源且以與自然 界發現 的不同的方式排列的調節序列和編碼序列。這樣的構建體可以單獨使用，或可以與載體結 合使用。如果使用載體，則載體的選擇依賴于用于轉化宿主細胞的方法，如本領域技術人員 眾所周知的。例如，可以使用質粒載體。熟練的技術人員熟知必須存在于載體上的遺傳元 件，以成功地進行轉化、選擇和繁殖包含實施方案的任意分離的核酸片段的宿主細胞。通過 擴增、DNA印跡分析、mRNA表達的RNA印跡分析、蛋白表達的免疫印跡分析、表型分析等，可 以進行篩選，以得到表現出多核苷酸或Rcgl基因座的所需表達水平和模式的系。術語“重組DNA構建體”指由從不同來源獲取的核酸片段裝配而成的DNA構建體。 核酸片段的類型和起源可以非常不同。在有些實施方案中，另外提供了包含可操作地連接到實施方案的異源核苷酸序列 上的啟動子的表達盒。實施方案的表達盒可以用于生成轉化的植物、植物細胞和微生物，及 用于實施誘導本文公開的植物真菌病原體抗性的方法。表達盒包括可操作地連接到實施方 案的多核苷酸上的5'和3'調節序列。“可操作地連接”意在指2個或更多個元件之間的 功能連接。“調節序列”指位于編碼序列的上游(5’非編碼序列)、之內或下游(3’非編碼 序列)的核苷酸，且其可以影響相關編碼序列的轉錄、RNA加工、穩定性或翻譯。調節序列可 以包括，但不限于，啟動子、翻譯前導序列、內含子和多腺苷酸化識別序列。例如，目標多核 苷酸和調節序列(啟動子，例如)之間的可操作連接是允許表達目標多核苷酸的功能連接。 可操作地連接的元件可以是鄰接的或非鄰接的。當用于指2個蛋白編碼區的連接時，可操 作地連接的意指編碼區是在相同讀框中。表達盒可以另外含有至少一個要共轉化進生物中 的其它基因。或者，可以在多個表達盒上提供其它基因。這樣的表達盒提供有多個限制位 點和/或重組位點，用于插入在調節區的轉錄調節下的編碼抗病原體多肽的多核苷酸。表 達盒可以另外含有選擇標記基因。表達盒將在5' -3'轉錄方向包含轉錄起始區(即，啟動子)、翻譯起始區、實施 方案的多核苷酸、翻譯終止區和在宿主生物中起功能的任選的轉錄終止區。調節區(即，啟 動子、轉錄調節區和翻譯終止區)和/或實施方案的多核苷酸對于宿主細胞而言或相互可 以是天然的/類似的。或者，調節區和/或實施方案的多核苷酸可以是宿主細胞異源的或 彼此異源的。本文使用的“異源的”序列是源自外來物種的序列，或者如果來自相同物種， 則通過故意的人工干預，從它在組合物和/或基因組基因座中的天然形式進行相當大的修 飾。例如，可操作地連接到異源多核苷酸上的啟動子來自與多核苷酸所來源的物種不同的 物種，或者如果來自相同/類似物種，則從它們的原始形式和/或基因組基因座相當大地修 飾其中之一或二者，或者啟動子不是可操作地連接的多核苷酸的天然啟動子。任選地包含的終止區可以是對于轉錄起始區天然的，可以是對于可操作地連接 的目標多核苷酸天然的，可以是對于植物宿主天然的，或可以源自啟動子、目標多核苷酸、宿主或其任意組合的另一個來源(即，外來的或異源的)。方便的終止區可以從根癌土壤 桿菌(A. tumefaciens)的Ti-質粒得到，例如，章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區。也參見 Guerineau 等(1991)Mol. Gen. Genet. 262 141-144 ;Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon 等(1991)Genes Dev. 5 141-149 ；Mogen 等(1990)Plant Cell 2:1261-1272; Munroe 等(1990)Gene 91 :151_158 ；Ballas 等(1989)Nucleic Acid Res. 17 :7891_7903 ； 和Joshi等(1987)Nucleic AcidRes. 15 :9627_9639。在具體實施方案中，使用馬鈴薯蛋 白酶抑制劑II基因(PinII)終止子。參見，例如，Keil等(1986)Nucl. Acids Res. 14 5641-5650 ；和An等(1989) Plant Cell 1 :115_122，它們在本文中整體引作參考。許多啟動子可以用于實踐實施方案，包括目標多核苷酸序列的天然啟動子。可以 基于所需的結果來選擇啟動子。在本文引作參考的Potenza等(2004) In Vitro Cell Dev Biol-Plant 40 :1_22的最近的綜述中，討論了許多種植物啟動子。例如，核酸可以與組成 型、組織-優選的、病原體-誘導型或其它啟動子相組合，以在植物中表達。這樣的組成型啟 動子包括，例如，Rsyn7啟動子的核心啟動子，和在WO 99/43838和美國專利號6，072，050中 公開的其它組成型啟動子；核心CaMV 35S啟動子(Odell等(1985)Nature 313 :810_812)； 稻肌動蛋白(McElroy 等(1990)PlantCell 2:163-171)；遍在蛋白(Christensen 等 (1989)Plant Mol. Biol. 12 619-632 和 Christensen 等(1992)Plant Mol. Biol. 18 675-689) ；pEMU(Last 等(1991)Theor. Appl. Genet. 81 581-588) ；MAS(Velten 等(1984) EMBO J. 3 =2723-2730) ；ALS啟動子(美國專利號5，659，026)，等。其它組成型啟動子包括， 例如，美國專利號 5，608，149 ；5，608，144 ；5，604，121 ；5，569，597 ；5，466，785 ；5，399，680 ； 5，268，463 ；5，608，142 ；和 6，177，611。有時，從誘導型啟動子、尤其從病原體-誘導型啟動子表達基因有時是有益的。這 樣的啟動子包括，來自致病相關蛋白(I3R蛋白)的那些，它們在病原體感染后被誘導；例 如，I3R蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質酶等。參見，例如，Redolfi等(1983) Neth. J. Plant Pathol. 89 245-254 ；Uknes 等(1992)Plant Cell 4:645-656;和 Van Loon(1985)Plant Mol. Virol. 4 :111_116。也參見本文引作參考的 W099/43819。令人感興趣的是導致在病原體感染部位處或附近局部地表達蛋白的啟動子。參 見，例如，Marineau 等(1987)Plant Mol. Biol. 9 335-342 ；Matton 等(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2 325-331 ；Somsisch 等(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 2427-2430 ；Somsisch 等(1988)Mol. Gen. Genet. 2 :93_98 ；和 Yang(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 14972-14977。也參見，Chen 等(1996)Plant J. 10 :955_966 ；Zhang 等 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 2507-2511 ；Warner 等(1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz 等(1989) Plant Cell 1 :961_968 ；美國專利號 5，750，386 (線蟲-誘導型)；和其 中引用的參考文獻。特別令人感興趣的是玉米PRms基因的誘導型啟動子，它的表達由病原 體串珠鐮孢(Fusarium moniliforme)誘導(參見，例如，Cordero 等(1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41 189-200)。另外，隨著病原體通過傷口或昆蟲損傷進入植物，傷口 _誘導型啟動子可以用 于實施方案的構建。這樣的傷口-誘導型啟動子包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑(Pin II)基 因(Ryan (1990)Ann. Rev. Phytopath. 28 :425-449 ;Duan 等(1996)Nature Biotechnology 14 494-498) ；wunl 和 wun2,美國專利號 5，428，148 ；winl 和 win2 (Stanford 等(1989)Mol. Gen. Genet. 215 200-208)；系統素(McGurl 等(1992) Science 225 1570-1573)； WIPl (Rohmeier 等(1993)Plant Mol. Biol. 22 783-792 ；Eckelkamp 等(1993)FEBS Letters 323:73-76) ；MPI 基因(Corderok 等(1994)Plant J. 6 (2) :141_150)；等，本文引
作參考。通過應用外源化學調節劑，可以將化學藥品調節的啟動子用于調節基因在植物中 的表達。根據目的，啟動子可以是化學藥品_誘導型啟動子(這時使用化學藥品誘導基因表 達)或化學藥品_抑制型啟動子(這時使用化學試劑阻抑基因表達)。化學藥品_誘導型 啟動子是本領域已知的，并包括且不限于，玉米In2-2啟動子，它由苯磺酰胺除草劑安全劑 激活，玉米GST啟動子，它由用作突出前(pre-emergent)除草劑的疏水親電子化合物激活， 和煙草PR-Ia啟動子，它由水楊酸激活。其它化學藥品調節的目標啟動子包括類固醇-響 應型啟動子(參見，例如，Schena 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 10421-10425 和 McNellis等(1998)Plant J. 14(2) :247_257中的糖皮質激素-誘導型啟動子)和四環 素-誘導型和四環素-阻抑型啟動子(參見，例如，Gatz等(1991)Mol.Gen. Genet. 227 229-237，和美國專利號5，814，618和5，789，156)，本文引作參考。組織-優選的啟動子可以用于在特定植物組織內靶定增強的實施方案的多肽的 表達。例如，組織-優選的啟動子可以用于在疾病抗性特別重要的植物組織(例如，根、 莖或葉子)中表達多肽。組織-優選的啟動子包括Yamamoto等(1997)Plant J. 12(2) 255-265 ；Kawamata 等(1997)Plant Cell Physiol. 38(7) 792-803 ；Hansen 等(1997) Mol.Gen Genet. 254(3) 337-343 ；Russell 等(1997)Transgenic Res. 6(2) 157-168 ； Rinehart 等(1996)Plant Physiol. 112(3) 1331-1341 ；Van Camp 等(1996)Plant Physiol.112(2) 525-535 ；Canevascini 等(1996)PlantPhysiol.112 (2) :513_524 ； Yamamoto 等(1994)Plant Cell Physiol. 35(5) 773-778 ；Lam(1994)Results Probl. Cell Differ. 20 181-196 ；Orozco 等(1993)Plant Mol Biol.23(6) 1129-1138 ；Matsuoka 等 (1993)Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20) :9586_9590 ；和 Guevara-Garcia 等(1993)Plant J. 4(3) :495-505。如果需要，可以修飾這樣的啟動子，進行弱表達。維管組織-優選的啟動子是本領域已知的，且包括選擇性地驅動在例如木質部 和韌皮部組織中的蛋白表達的那些啟動子。維管組織-優選的啟動子包括且不限于， 野黑櫻(Primus serotina)的野黑櫻苷水解酶基因啟動子(參見，例如，國際
發明者K·E·布羅利, K·H·巴特勒 申請人:納幕爾杜邦公司