腫瘤靶向的新型釕多吡啶配合物載siRNA的制備與評價的制作方法

本發明涉及4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-酰基-rgds二氯化釕(ru-co-rgds)的制備及ru-co-rgds/vegf-sirna基因遞送系統的構建，并且對其進行了體內外抗腫瘤活性和基因沉默效率的評價。本專利主要是通過rgds修飾，增強釕吡啶配合物ru-cooh的靶向性，使在靶部位的濃度增加，從而減小副作用，提高了治療指數。

背景技術：

基因治療以改變人的遺傳物質為基礎，將外源正常基因導入靶細胞，以糾正基因缺陷或沉默相關基因表達，從而起到抗腫瘤的目的。血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,vegf)能促進血管內皮細胞增殖、遷移和腫瘤的新血管生成淋巴管的形成，增加血管通透，促進腫瘤生長、轉移。在基因治療領域中，具有的基因沉默靶向性的rna干擾(rnainterfence,rnai)治療重大疾病方面顯示出非常大的應用潛力。

rna干擾是指通過雙鏈rna(dsrna)在逆轉錄后引起該序列的同源mrna產生特異性降解，從而達到基因沉默的作用。rnai具有高特異性、高效性、高穩定性。vegf存在于卵巢癌、宮頸癌等實體瘤，血液系統腫瘤等大多數重要的人類腫瘤中，且vegf受體過高表達。因此，在根本上從基因水平抑制vegf表達，實現抗新生血管的生成，從而達到抑制腫瘤的生長和遷移的目的。vegf-sirna轉染被認為是一種潛在的抗腫瘤策略。

釕多吡啶金屬配合物應用廣泛。與核酸通過嵌入，溝槽結合和靜電模式等模式結合，可作為核酸結構探針、核酸分子光開關、化學核酸酶、基因載體，因低毒性、易吸收及代謝快等并被認為成為新的最有前景的抗癌藥物之一。釕多吡啶配合物作為非病毒類載體與陽離子聚合物等相比，具有更好的水溶性、更豐富的結構多樣性和更合理的正電荷密度，而且更易制備，因此其作為基因領域中安全的高效的非病毒型基因載體。

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arg-gly-asp-x,rgdx)rgd肽可作為整合素和其配體相互作用的識別位點,介導細胞與細胞外基質蛋白及細胞間的粘附作用，同時具有信號傳導功能。rgds與整合素的特異結合,可以將治療效應分子靶向性地導入腫瘤部位,有效地減少了對正常細胞的損害。此外，含rgdx的多肽或化合物被應用于新型材料的修飾與合成。其中，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸(arg-gly-asp-ser,rgds)中的絲氨酸的修飾，增加了化合物的親水性，所以在抗腫瘤藥物的修飾中rgds靶向肽具有廣泛應用。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種具有抗腫瘤活性的基因遞送系統，由抗腫瘤基因治療藥物vegf-sirna和基因載體ru-co-rgds制備而成。

本發明所述的基因遞送系統，其特征在于，ru-co-rgds和vegf-sirna的重量比為1.66：1。

本發明所述的基因遞送系統，為納米結構。

本發明的另一個目的在于提供基因遞送系統的制備方法，包括以下步驟：基因載體ru-co-rgds與抗腫瘤基因治療藥物vegf-sirna在常溫下以質量比為1.66:1混合，即得ru-co-rgds/vegf-sirna。

其中，ru-co-rgds的制備方法如下：4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-甲酸與hcl·arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl液相接肽法，用三氟乙酸/三氟甲磺酸脫去保護基，形成4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-酰基-rgds，最后與釕吡啶配合物回流反應即得ru-co-rgds。

其中，ru-co-rgds的制備方法如下：通過液相接肽法，將4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-甲酸與hcl·arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl在thf/dmf中通過ddc/hobt反應，得到4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-酰基-r(tos)-g-d(obzl)-s-obzl；然后用三氟乙酸/三氟甲磺酸脫去保護基，形成4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-酰基-rgds；將順-2,2'聯吡啶二氯化釕與4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-酰基-rgds在n2環境下避光回流反應，回流反應結束后，旋干溶液，加入純凈水溶解后，加入飽和六氟磷酸鹽溶液，出現紅橙色沉淀，離心，取上清液，旋干，甲醇乙醚體系重結晶，得到ru-co-rgds。

本發明所述的基因遞送系統ru-co-rgds/vegf-sirna的制備方法如下：將vegf-sirna與小牛胸腺dna按照2：1(v:v)的比例混合，反復吹打，室溫下靜置10min，同時將ru-co-rgds與魚精蛋白混合，反復吹打，室溫下靜置10min，然后將ru-co-rgds/魚精蛋白復合物加入到vegf-sirna/dna復合物中，反復快速吹打，室溫靜置30min，即得ru-co-rgds/vegf-sirna。

優選的，本發明所述的基因遞送系統的制備方法，包括以下步驟：hcl·ar

g(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl的合成：

取400mgboc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl中加入適量無水hcl-乙酸乙酯溶液溶解，室溫攪拌4h，可見大量白色固體析出，用tlc板監測反應。反應結束后，室溫下減壓濃縮，殘留物用乙酸乙酯溶解，反復數次，并用少量乙醚減抽濾，以除去氯化氫，即得hcl·arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl，

4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-酰基-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl的合成：

將4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-甲酸87mg溶解于無水thf中，無水dmf助溶，冰浴條件下加入hobt55mg和dcc100mg完全溶解，活化30min，加入制備好的hcl·arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl312mg，并用dmm調節ph＝8.0-9.0，室溫下攪拌反應14h，用tlc板監測反應，得到粉紅色固體粉末，

4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-酰基-rgds的合成：

將86mg4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-酰基-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl冰浴條件下加入1.35ml三氟乙酸，0.45ml三氟甲磺酸(v:v＝3:1)，反應30min，所得化合物為用乙醇反復磨洗，得到標題產物，

ru-co-rgds的合成

取順-2,2'聯吡啶二氯化釕35mg和4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-酰基-rgds79mg于50ml兩口燒瓶中，加入50％乙醇10ml，避光，充入n2的條件下回流反應10h。回流反應結束后，旋干溶液。加入5ml純凈水溶解，加入飽和六氟磷酸鹽溶液，出現紅橙色沉淀。1000rpm，離心3min。經過鑒定，上清液中產物含量多。取上清液，旋干。甲醇乙醚體系重結晶，最后得到終產物150mg，

ru-co-rgds/vegf-sirna的制備

將vegf-sirna與小牛胸腺dna按照2：1(v:v)的比例混合，反復吹打，室溫下靜置10min。同時將ru-co-rgds與魚精蛋白混合，反復吹打，室溫下靜置10min。后將ru-co-rgds/魚精蛋白復合物加入到sirna/dna復合物中，反復快速吹打，室溫靜置30min，即得ru-co-rgds/vegf-sirna。

本發明所述的基因遞送系統在制備抑制腫瘤中的應用。

本發明涉及以宮頸癌hela細胞株為模型，用mtt法評價基因載體ru-co-rgds對vegf-sirna的細胞毒性和ru-co-rgds/vegf-sirna的體外抗腫瘤活性，結果顯示ru-co-rgds對hela細胞表現出低毒性，并且ru-co-rgds/vegf-sirna具有良好的體外抗腫瘤活性，其ic50為122.6nm。

本發明涉及以宮頸癌hela細胞株為模型，通過elisa測定蛋白水平的基因沉默效率，通過rt-pcr測定mrna水平的基因沉默效率。在mrna水平，ru-co-rgds/vegf-sirna能夠下調vegf相應mrna的表達，濃度為100nm的抑制率為59±5.2％；在蛋白水平，ru-co-rgds/vegf-sirna能夠下調vegf蛋白的表達，濃度為100nm的抑制率為64.1±2.5％。

本發明涉及以荷s180腹水瘤小鼠模型進行體內抗腫瘤活性評價，ru-co-rgds/vegf-sirna復合物中vegf-sirna的給藥劑量為0.3mg/kg，其抑瘤率為52.54％。

對說明書中出現的以下詞語作進一步的解釋：

ru：釕多吡啶配合物

rgds：精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸

ru-co-rgds：4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-酰基-rgds二氯化釕

dcc：碳二亞氨

hobt：1-羥基苯并三唑

vegf：血管內皮生長因子

sirna：小干擾rna

thf：四氫呋喃

od值：光密度值

depc：焦碳酸二乙酯

dmf：n，n-二甲基甲酰胺

tfa：三氟乙酸

tfmsa：三氟甲磺酸

ru(bpy)2cl2：順-2,2'聯吡啶二氯化釕

4′-methyl-2,2′-bipyridyl-4-carboxylicacid：4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-甲

酸

tlc：薄層色譜分析

dmso：二甲基亞砜

dmem：改良杜氏伊格爾培養基

fbs：胎牛血清

fam：羥基熒光素

mtt：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽

elisa：酶聯免疫吸附測定

rt-pcr：逆轉錄-聚合酶鏈式反應

mtt:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽

dmso：二甲基亞砜

ns：生理鹽水

附圖說明：

附圖1為rgds的制備路線。

附圖2為ru-co-rgds的制備路線。

(i)4′-methyl-2,2′-bipyridyl-4-carboxylicacid,dcc,hobt,nmm,thf；

(ii)tfa/tfmsa；

(iii)ru(bpy)2cl2,n2,50％ethanol,refluxedinthedark

附圖3為boc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl的質譜((867.35[m+1]⁺))。

附圖4為boc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl的核磁¹hnmr(300mhz,dmso-d6)。

附圖5為boc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl的hplc。

附圖6為ru-co-rgds的質譜([m/2]²⁺＝521.6482)。

附圖7為ru-co-rgds的紅外。

附圖8為ru-co-rgds的紫外。

附圖9為ru-co-rgds的熒光。

附圖10為ru-co-rgds在hela細胞的轉染效果圖。

a:空白細胞對照組

b:游離的fam-vegf-sirna組

c:ru-co-rgds/fam-vegf-sirna基因遞送體系組

d:lipo/fam-vegf-sirna陽性對照組

附圖11為ru-co-rgds對hela細胞的細胞毒性。

附圖12為ru-co-rgds/vegf-sirna的體外抗腫瘤活性。

附圖13為各組vegf蛋白的含量。

附圖14為各組vegf-mrna的含量。

附圖15為ns、ru-co-rgds/vegf-sirna、ru-co-rgds、vegf-sirna和dox組瘤重。

附圖16為ru-co-rgds/vegf-sirna、ru-co-rgds、vegf-sirna和dox組抑瘤率。

具體實施方式

通過以下具體實施例對本發明作出進一步的說明，但不作為對于本發明的限制。

實施例1.ru-co-rgds/vegf-sirna的制備

h-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl的制備路線如圖1。ru-co-rgds的制備路線如圖2。

hcl·arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl的合成

合成boc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl。esi-ms(m/e)：(867.35[m+1]⁺)。取400mg中加入適量無水hcl-乙酸乙酯溶液溶解，室溫攪拌4h，可見大量白色固體析出，用tlc板監測反應。反應結束后，室溫下減壓濃縮，殘留物用乙酸乙酯溶解，反復數次，并用少量乙醚減抽濾，以除去氯化氫。即得hcl·arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl。esi-ms(m/e)：767.30[m+1]⁺。

4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-酰基-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl的合成

將4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-甲酸87mg溶解于無水thf中，無水dmf助溶。冰浴條件下加入hobt55mg和dcc100mg完全溶解，活化30min。加入制備好的hcl·arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl312mg，并用dmm調節ph＝8.0-9.0。室溫下攪拌反應14h，用tlc板監測反應。得到粉紅色固體粉末328mg(產物89％)。esi-ms(m/e)：964.36[m+1]⁺。

4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-酰基-rgds的合成

將86mg4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-酰基-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl冰浴條件下加入1.35ml三氟乙酸，0.45ml三氟甲磺酸(v:v＝3:1)，反應30min。所得化合物為用乙醇反復磨洗，得到標題產物80mg。esi-ms(m/e)：629.62[m+1]⁺

ru-co-rgds的合成

取順-2,2'聯吡啶二氯化釕35mg和4’-甲基-(2，2’-聯吡啶)-4-酰基-rgds79mg于50ml兩口燒瓶中，加入50％乙醇10ml，避光，充入n2的條件下回流反應10h。回流反應結束后，旋干溶液。加入5ml純凈水溶解，加入飽和六氟磷酸鹽溶液，出現紅橙色沉淀。1000rpm，離心3min。經過鑒定，上清液中產物含量多。取上清液，旋干。甲醇乙醚體系重結晶，最后得到終產物150mg。q-tof(m/e)：521.6482[m/2]²⁺。

實驗結果

對boc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-ser-obzl進行鑒定，質譜(esi-ms，見圖3)，氫譜(見圖4)，液相(見圖5)。對產物ru-co-rgds進行鑒定，旋光結果：[α]²⁶d^＝6.817±0.9388(c＝0.1g/100ml,h2o)；熔點163.3±1.2℃；質譜(q-tof見圖6)，紅外(見圖7)，紫外(見圖8)，熒光(見圖9)檢測：激發波長450nm，最高峰出現在634.5nm。

ru-co-rgds/vegf-sirna的制備

將vegf-sirna與小牛胸腺dna按照2：1(v:v)的比例混合，反復吹打，室溫下靜置10min。同時將ru-co-rgds與魚精蛋白混合，反復吹打，室溫下靜置10min。后將ru-co-rgds/魚精蛋白復合物加入到sirna/dna復合物中，反復快速吹打，室溫靜置30min，即得ru-co-rgds/vegf-sirna。

實施例2.ru-co-rgds/vegf-sirna的體外抗腫瘤活性評價

激光共聚焦顯微鏡考察sirna的轉染效果

宮頸癌細胞hela是貼壁生長的細胞，以適量濃度接種于培養瓶中，加入含10％胎牛血清，100u/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的deme完全培養液，置于37℃恒溫、5％co2飽和濕度的培養箱中培養。取對數生長期hela細胞，先用pbs洗滌三遍，加1ml胰酶,消化3min后，離心(2000rpm、3min)，用含10％胎牛血清的deme培養基調整細胞濃度至1×10⁵個/ml，每個激光共聚焦培養小皿中加入2ml，共四組，37℃恒溫、5％co2培養過夜。小心棄掉上清液，pbs洗一次，加入2ml含有100nmru-co-rgds/fam-vegf-sirna、fam-vegf-sirna、lipo2000/fam-vegf-sirna的無血清dmem培養基，另一個空白組培養皿加入2ml無血清dmem培養基，轉染4h。吸除上清液，1mlpbs洗3次，每個培養皿加1mlhoechst染液(pbs稀釋，工作濃度為4μg/ml)，染色15min。之后吸除上清液，用1mlpbs洗3次，最后加入1mlpbs。置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

實驗結果

本實驗中，ru-co-rgds表面吸附的sirna是fam標記的vegf-sirna，從圖10中我們可以看出ru-co-rgds/fam-vegf-sirna組的細胞核(被hoechst33342染成藍色)周圍有綠色熒光(fam)，而blank組和vegf-sirna組細胞核周圍沒有綠色的熒光，陽性對照組lipo2000/fam-vegf-sirna有綠色熒光。可以得出結論：vegf-sirna被ru-co-rgds成功遞送進hela細胞內，并且分布在細胞核周圍。

ru-co-rgds的細胞毒作用

將hela細胞以適量濃度接種于培養瓶中，加入含10％胎牛血清,100u/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的dmem完全培養液，置于37℃恒溫、5％co2飽和濕度的培養箱中培養。取對數生長期hela細胞，先用pbs洗滌三遍，加1ml胰酶，消化3min后，離心(2000rpm、3min)，用含10％胎牛血清的dmem培養基調整細胞濃度至4×10⁴個/ml。取96孔培養板，pbs液封，設空白培養基組，其余每孔加入100μl細胞懸液，在37℃，5％co2的培養箱中培養過夜。小心棄去培養液，加入含ru-co-rgds的dmem培養基100μl，濃度依次為5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、150μg/ml。每個濃度設置六個復孔。置于培養箱內培養48h。每孔加入25μl新鮮配制的濃度為5mg/ml的mtt，37℃，5％co2培養箱繼續培養4h。離心后小心棄去上清液，并加入150μldmso，用微型振蕩器震蕩700r，10min。混勻后，在酶標儀上以檢測波長為490nm測定吸光度(od)值，計算細胞存活率。細胞存活率(％)＝[(實驗組od值-空白組od值)/(對照組od值-空白組od值)]×100％。上述實驗重復三次。

實驗結果

從圖11中我們可以看出隨著濃度的增加，與空白組相比較，細胞存活率沒有明顯性差異(p>0.05)。因此修飾后的載體ru-co-rgds對hela細胞是沒有毒性的。

ru-co-rgds/vegf-sirna的體外抗腫瘤活性

取對數生長期的hela細胞，胰酶消化后，用含10％胎牛血清的dmem培養基調整細胞濃度至4×10⁴個/ml。每孔種100μl細胞懸液于96孔培養板內，37℃，5％co2培養過夜。小心棄去培養液，加入100μl含40nm，80nm，100nm和120nmru-co-rgds、vegf-sirna、ru-co-rgds/nc、ru-co-rgds/vegf-sirna、lipo2000/nc和lipo2000/vegf-sirna的無血清dmem培養基。每組每個濃度設置六個復孔。轉染4h，小心棄掉上清液，加入完全dmem培養基棄繼續培養44h。每孔加入25μl新鮮配制的濃度為5mg/ml的mtt，37℃，5％co2培養箱繼續培養4h。離心后小心棄去上清液，并加入150μldmso，用微型振蕩器震蕩700r，10min。混勻后，在酶標儀上以檢測波長為490nm測定吸光度(od)值，計算細胞存活率。細胞存活率(％)＝[(實驗組od值-空白組od值)/(對照組od值-空白組od值)]×100％。上述實驗重復三次。

實驗結果

從圖12中可以得出以下結論：

(1)不同濃度的ru-co-rgds、ru-co-rgds/nc、和陰性對照組vegf-sirna分別與blank(即濃度為0的細胞)比較，無顯著性差異(p>0.05)，說明裸的vegf-sirna和單獨的載體ru-co-rgds對細胞增殖均無抑制作用。

(2)不同濃度的ru-co-rgds/vegf-sirna與blank(即濃度為0的細胞)比較，當濃度為40nm時，有差異(p<0.05)，當濃度為60nm時，有顯著性差異p<0.01)；相同濃度的ru-co-rgds/vegf-sirna與ru-co-rgds/nc、陰性對照組vegf-sirna相比較，當濃度為40nm時，有差異(p<0.05)，當濃度為60nm時，有顯著性差異(p<0.01)；相同濃度的ru-co-rgds/vegf-sirna與陽性對照組lipo2000/vegf-sirna比較，無顯著性差異(p>0.05)，即ru-co-rgds/vegf-sirna表現出較好的體外抗腫瘤活性。

(3)ru-co-rgds/vegf-sirna對hela細胞的抑制作用呈現一定的濃度依賴性，即隨著濃度的增加，其抑制作用表現出增強趨勢。

從圖9中我們可以看出隨著ru-co-rgds/vegf-sirna的濃度增加，細胞存活率逐漸下降，即其抗腫瘤活性逐漸增強，呈現濃度依賴性。其ic50為122.6nm。

實施例3ru-co-rgds/vegf-sirna的蛋白水平沉默效率評價

細胞培養

取對數生長期hela細胞，胰酶消化后，用含10％胎牛血清的dmem培養基調整細胞濃度至1×10⁵個/ml，每孔加2ml于六孔板中，設三個復孔，培養過夜當細胞密度長至80％左右時，棄掉上清，加入2ml含有100nmvegf-sirna，ru-co-rgds/nc、ru-co-rgds/vegf-sirna、lipo2000/vegf-sirna和lipo2000/nc的無血清dmem培養基，空白組加入2ml無血清dmem培養基，轉染4h后換成新鮮的含10％fbs的dmem培養基，繼續培養44h。

提取蛋白

冰上操作：細胞培養48h后，離心(1000rpm，10min)取上清即可。

bcaproteinassaykit定量裂解液中蛋白濃度

將上一步提取的蛋白裂解液稀釋十倍，每組設置三個復孔，根據bca工作液試劑盒操作步驟,測定每組蛋白濃度，做下記錄，求每組樣品總蛋白濃度平均值。

humanvegfelisa試劑盒測定樣品蛋白中vegf的含量

蛋白上樣量為120μg，根據蛋白濃度，加入相應體積的蛋白裂解液并用depc水定容到50μl，根據試劑盒步驟操作最后在450nm下測定od值。上述實驗重復三次。

實驗結果

蛋白定量結果

繪制標準曲線

不同濃度的標準蛋白的od值

標準方程為y＝0.001x+0.1345。r²＝0.9939

各組蛋白樣品中總蛋白量

elisa

各組蛋白樣品中vegf蛋白的相對含量

從圖13中我們可以看出，裸的vegf-sirna組與空白組相比，沒有明顯性差異(p>0.05)，即裸的vegf-sirna不能下調hela細胞vegf蛋白的表達；ru-co-rgds/nc和lipo2000/nc與空白組相比較，沒有明顯性差異(p>0.05)，表明載體材料對vegf蛋白的表達沒有影響；而ru-co-rgds/vegf-sirna分別與vegf-sirna/nc、blank組相比均有明顯性差異(p<0.01)，與lipo2000/vegf-sirna陽性對照組相比，沒有明顯性差異(p>0.05)，說明ru-co-rgds將vegf-sirna遞送進入細胞并成功下調vegf蛋白的表達。

實施例4.ru-co-rgds/vegf-sirna的mrna水平沉默效率評價

細胞培養

取對數生長期hela細胞，細胞密度達到80％左右時，用pbs洗滌三遍，加入1ml胰酶消化3min，離心(2000rpm，3min)，用含10％胎牛血清的dmem培養基調整細胞濃度至1×10⁵個/ml，每孔加2ml于六孔板中，培養過夜，設三個復孔，棄掉上清，加入2ml含有100nmvegf-sirna，ru-co-rgds/nc，ru-co-rgds/vegf-sirna，lipo2000/nc，lipo2000/vegf-sirna的無血清dmem培養基，轉染4h，換成新鮮含血清的dmem培養基，繼續培養44h。

rna的提取

(1)首先棄掉六孔板的上清液，然后用1mlpbs洗滌三次，每孔加入1mltrizol裂解液(每10cm²加入1mltrizol)。吹打均勻并室溫裂解10min，將裂解液轉移至無rnaseep管，靜置5min。

(2)相分離。在每1mltrizol加入0.2ml氯仿，然后劇烈振蕩，室溫放置3分鐘，離心(4℃，12000rpm，15min)。液體分成三層，下層的紅色為苯酚-氯仿相，上層是無色的水相。rna存在于水相中，水相約占總體積的50％。

(3)沉淀rna。小心地將上層水相液體轉移到另一干凈的無rnaseep管中，然后每管加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫靜置10min，然后離心(4℃，12000rpm，10min)。離心后在管的底部可看到絮狀半透明膠樣的rna沉淀。

(4)洗滌rna。小心去除上清，加入1ml配制好的75％乙醇(depc水配制)，洗滌rna沉淀，振蕩器混勻，離心(4℃，12000rpm，10min)，小心棄去上清。

(5)rna的復溶。將rna沉淀放置10min，待rna沉淀干燥。但是注意不能將rna沉淀完全干燥，因為這會極大地降低它的溶解度。用depc水重懸rna沉淀，并且用槍頭反復吹打幾次，靜置10分鐘，55℃水浴10-15min。-20℃保存；

(6)測rna濃度：用depc水校正nanodrop-1000后，取2μl混勻后的rna溶液樣品，滴加到測量臂上，選擇rna，點擊measure測量。同法依次測量所有rna溶液樣品。

逆轉錄

(1)樣品準備：逆轉錄rna上樣量為2μg,根據上一步測得的rna濃度，計算出我們所需rna體積。

(2)取microamp^tmoptical96-wellreactionplate，每個反應孔加10μl2×rtbuffer，1μl20×rtenzymemix，加入相應體積的rna溶液，用depc水補足20μl。用opticaladhesivefilm將板子封口。離心(4℃，1000rmp，3min)，排出聚集在反應孔底部的氣泡。

(3)放入pcrsystem9700中,設置反應條件：94℃-5min，94℃-30s，55℃-30s，72℃-25s，72℃7min,4℃∞，共30個循環。

(4)測濃度：反應結束后，首先用depc水校正nanodrop-1000，取2μl混勻后的cdna溶液樣品，滴加到測量臂上，蓋上測量臂，選擇dna-50，點擊measure測量。同法依次測量所有cdna溶液樣品，并記錄下測量的結果。按照上樣量進行稀釋，稀釋后用同樣的方法進行測定。

rt-pcr

cdna的上樣量為20ng，據此計算所需加入的各cdna樣品的體積。每個反應孔加入10μlgeneexpressionmastermix、1μl探針標記的引物(vegf或gapdh)、相應體積的cdna樣品，以depc水補齊20μl，搖勻。離心(4℃，1000rmp，3min)，使液體聚集于底部并排出氣泡；放入appliedbiosystems7500real-timepcrsystem中,設置條件。hold:50℃2min，95℃10min，cycle(40cycles)，95℃15s，60℃1min。

數據處理中，根據ct值以gapdh為內參，運用2^-△△ct法相對定量各實驗組mrna的量。上述實驗重復三次。

實驗結果

提取的各組rna濃度

提取的各組rna濃度

逆轉錄后各組的cdna的濃度

逆轉錄后各組的cdna的濃度

rt-pcr

rt-pcr后各組2^-△△ct值如下表所示：

genesilencingefficiencyonvegf-sirnalevel

從圖14可以看出：

(1)裸的vegf-sirna組與空白組相比，沒有顯著性差異(p>0.05)，說明裸的vegf組對vegf-mrna的轉錄沒有影響；

(2)ru-co-rgds/nc組和lipo2000/nc組與空白組相比，沒有顯著性差異(p>0.05)，說明載體材料對vegf-mrna的轉錄沒有影響；

(3)ru-co-rgds/vegf-sirna組分別與空白組和ru-co-rgds/nc相比較，均有明顯性差異(p<0.01)，而與lipo2000/vegf-sirna組相比，沒有明顯性差異(p>0.05)，可以得出ru-co-rgds/vegf-sirna能夠下調vegf-mrna的轉錄水平，并且效率和陽性對照組相當。

實施例6.ru-co-rgds/vegf-sirna的體內抗腫瘤活性研究

實驗分組

實驗共分為5組，分別是生理鹽水組(ns)，ru-co-rgds/vegf-sirna組，裸vegf-sirna組，ru-co-rgds組，鹽酸阿霉素組(dox)。每組12只小鼠，四組共60只。

給藥劑量

(1)ru-co-rgds/vegf-sirna組：vegf-sirna劑量為0.3mg/kg，ru-co-rgds的劑量為0.498mg/kg，即按質量比為1.66:1配制藥品并給藥

(2)vegf-sirna組：劑量為0.3mg/kg

(3)ru-co-rgds組：劑量為0.498mg/kg

(3)dox組：劑量為2μmol/kg

(4)ns：等體積的生理鹽水，即每只0.2ml

給藥方式：尾靜脈注射

實驗動物：icr小鼠，雄性，體重20±2g(x±sd)，由北京維通利華動物實驗技術有限公司提供。

實驗方案

建立荷s180腹水瘤小鼠模型：取1×10⁷個/ml的s180細胞懸液于健康小鼠腋皮下接種，0.2ml/只，小鼠接種瘤液后養7天至瘤體積(長×寬²/2)為150mm³左右，將全部小鼠隨機分組，分為5組，并編號。測量體重，然后開始給藥，ru-co-rgds/vegf-sirna、vegf-sirna、ru-co-rgd組按給藥劑量每天尾靜脈注射給藥一次，每次0.2ml/只，連續給藥5天；陰性對照以等體積的生理鹽水尾靜脈注射給藥，每天給藥一次，0.2ml/只，連續給5天；陽性對照dox組以尾靜脈注射給藥，按給藥劑量每天給藥一次，0.2ml/只，連續給藥5天，每天按編號測量小鼠體重。

實體瘤抑瘤率及臟器指數的測定

每組連續給藥5天后，于第6天脫頸椎處死小鼠，處死前稱取體重，然后將小鼠解剖，取出瘤、腦、心、肝、脾、腎，并稱重，按如下公式計算抑瘤率。

抑瘤率％＝[(生理鹽水組平均瘤重－給藥組平均瘤重)/生理鹽水組平均瘤重]×100％。數據統計均采用t檢驗和方差分析，以(mean±sdg)表示。

從圖15中我們可以看出，裸的vegf-sirna組與空白組相比，沒有顯著性差異(p>0.05)，說明裸的vegf-sirna對腫瘤的生長無抑制作用；ru-co-rgds/vegf-sirna與空白組相比較，有顯著性差異(p<0.05)，與dox組相比,沒有顯著性差異(p>0.05)，說明ru-co-rgds/vegf-sirna明顯抑制腫瘤的生長，抑瘤率接近于陽性藥dox；從圖16中可以看出，ru-co-rgds/vegf-sirna組，裸vegf-sirna組，ru-co-rgds組，鹽酸阿霉素組(dox)的抑瘤率。