4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或更多改變或以其他方式修 飾的密碼子。
[0072] 本領域技術人員可認識到氨基酸添加和/或取代一般基于氨基酸側鏈取代基的 相對相似性，例如其疏水性、電荷、大小等。考慮各種前述特征的示例性氨基酸取代組是本 領域技術人員眾所周知的，并且包括：精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨 酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
[0073] 因此，實施方案的基因和核苷酸序列包括天然存在的序列和突變體形式。同樣地， 實施方案的蛋白質包含人工改造的蛋白質和其變異(例如截短的多肽）及修飾(例如突變 體)形式。此種變體將繼續具有所需殺蟲活性。本文包含的蛋白質序列的缺失、插入和取代 不期望產生蛋白質特征中的根本改變。然而，當在這樣做之前難以預測取代、缺失或插入的 確切作用時，本領域技術人員將認識到作用將通過常規篩選測定例如昆蟲攝食測定進行評 價。
[0074] 變體核苷酸序列和蛋白質還包含衍生自誘變和重組程序例如DNA改組的序列和 蛋白質。用此種程序，一個或多個不同編碼序列可以進行操作，以產生具有所需性質的新殺 蟲蛋白質。以這種方式，由包括序列區域的相關序列多核苷酸群體生成重組多核苷酸的文 庫，所述序列區域具有基本序列同一性，并且可以在體外或體內同源重組。例如，使用這種 方法，全長編碼序列、編碼目的結構域的序列基序、或實施方案的核苷酸序列的任何片段可 以在實施方案的核苷酸序列和其他已知K//7核苷酸序列的相應部分之間改組，以獲得編碼 具有改善的目的性質的蛋白質的新基因。
[0075]實施方案進一步涉及實施方案的轉化的植物的植物繁殖材料，包括但不限于種 子、塊莖、球莖、鱗莖、葉以及根和枝條的插條。
[0076]實施方案可以用于轉化任何植物物種，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。[0077]實施方案的組合物以多種方式在保護植物、種子和植物產物中有用。例如，組合物 可以在涉及將有效量的殺蟲組合物置于害蟲環境中的方法中使用，其通過選自噴霧、撒粉、 撒播或種子涂敷的程序實現。
[0078] 在植物繁殖材料(果實、塊莖、鱗莖、球莖、谷粒、種子）但尤其是種子作為商業產物 銷售前，它照例用保護劑涂料進行處理，所述保護劑涂料包括除草劑、殺昆蟲劑、殺真菌劑、 殺細菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑或這些制劑中的幾種的混合物，若需要則連同在配制領 域中照例采用的進一步載體、表面活性劑或施用促進佐劑一起，以提供針對由細菌、真菌或 動物害蟲引起的損害的保護。為了處理種子，通過用液體制劑浸滲塊莖或谷粒或通過用組 合的濕或干制劑涂敷其，保護劑涂料可以應用于種子。此外，在特定情況下，對于植物的其 他應用方法是可能的，例如針對芽或果實的處理。
[0079] 編碼實施方案的殺蟲蛋白質的基因可以經由合適載體引入微生物宿主內，并且將 所述宿主應用于環境、或植物或動物。在將核酸插入細胞內的背景中的術語"引入的"意指 "轉染"或"轉化"或"轉導"，并且包括提及核酸摻入真核或原核細胞內，其中核酸可以摻入 細胞的基因組(例如染色體、質粒、質體或線粒體DNA)內，轉變成自主復制子或瞬時表達(例 如轉染的mRNA)。
[0080] 許多方法可用于在允許基因穩定維持和表達的條件下將表達殺蟲蛋白質的基因 引入微生物宿主內。例如，可以構建表達盒，其包括與用于表達核苷酸構建體的轉錄和翻譯 調節信號可操作地連接的目的核苷酸構建體，和與宿主生物中的序列同源的核苷酸序列， 由此將發生整合，和/或在宿主中起作用的復制系統，由此將發生整合或穩定維持。轉錄和 翻譯調節信號包括但不限于啟動子、轉錄起始開始位點、操縱基因、激活劑、增強子、其他調 節元件、核糖體結合位點、起始密碼子、終止信號等。
[0081] 在實施方案中，轉化的微生物(其包括完整生物、細胞、一種或多種孢子、一種或多 種殺蟲蛋白質、一種或多種殺蟲組分、一種或多種害蟲影響組分、一種或多種突變體、活或 死細胞和細胞組分，包括活和死細胞和細胞組分的混合物，并且包括破碎的細胞和細胞組 分）或分離的殺蟲蛋白質可以與可接受的載體一起配制成一種或多種殺蟲組合物，其是例 如懸浮液、溶液、乳劑、撒粉粉末、可分散顆粒或小丸、可濕性粉末和可乳化濃縮物、氣溶膠 或噴霧劑、浸滲顆粒、佐劑、可包被糊劑、膠體以及例如聚合物物質中的膠囊化。此種配制的 組合物可以通過此種常規方法進行制備，例如包含多肽的細胞培養物的脫水、凍干、勻漿、 提取、過濾、離心、沉降或濃縮。
[0082] 上文公開的此種組合物可以通過添加下述獲得：表面活性劑、惰性載體、防腐劑、 濕潤劑、攝食刺激劑、引誘劑、被囊化劑、粘合劑、乳化劑、染料、UV保護劑、緩沖劑、流動劑 或肥料、微量營養物供體或影響植物生長的其他制劑。一種或多種農用化學品包括但不限 于除草劑、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺細菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑、殺蝴劑、植物生長調節 齊U、落葉劑（harvestaid)和肥料，可以與在配制領域中照例采用的載體、表面活性劑或佐 劑或其他組分組合，以促進產物處理和應用于特定靶害蟲。合適的載體和佐劑可以是固體 或液體，并且對應于在配制技術中通常采用的物質，例如自然或再生礦物質、溶劑、分散劑、 濕潤劑、增粘劑、粘合劑或肥料。實施方案的活性成分正常以組合物的形式應用，并且可以 應用于待處理的作物區域、植物或種子。例如，實施方案的組合物可以應用于在用于準備糧 倉或地窯等或在糧倉或地窖等中的貯存過程中的谷物。實施方案的組合物可以與其他化合 物同時或連續應用。應用實施方案的活性成分或實施方案的農用化學品組合物(其包含通 過實施方案的細菌菌株產生的至少一種殺蟲蛋白質）的方法包括但不限于葉應用、種子涂 敷和土壤應用。應用數目和應用比率依賴于通過相應害蟲的侵擾強度。
[0083]實施方案的組合物可以以合適形式用于直接應用或作為基本組合物的濃縮物，這 在應用前需要用合適量的水或其他稀釋劑稀釋。殺蟲濃度將依賴于特定制劑的性質而改 變，特別地依賴于它是濃縮物還是待直接使用。
[0084]在害蟲已開始出現時或在害蟲出現前作為防護措施，通過例如噴霧、霧化、撒粉、 播散、涂敷或傾注、引入土壤內或上、引入灌溉水內、通過種子處理或一般應用或撒粉，組合 物(包括實施方案的轉化的微生物和殺蟲蛋白質）可以應用于昆蟲害蟲的環境。例如，實施 方案的殺蟲蛋白質和/或轉化的微生物可以與谷物混合，以保護在貯存過程中的谷物。一 般重要的是獲得在植物生長的早期階段中害蟲的良好控制，因為這是植物可以被最嚴重損 害的時間。實施方案的組合物可以方便地包含另一種殺昆蟲劑，如果認為這是必要的話。在 一個實施方案中，組合物在種植時以組合物的顆粒形式直接應用于土壤，所述組合物具有 載體和實施方案的芽孢桿菌屬菌株或轉化的微生物的死細胞。另一個實施方案是組合物的 顆粒形式，所述組合物包括農用化學品例如除草劑、殺昆蟲劑、肥料、惰性載體、和實施方案 的芽孢桿菌屬菌株或轉化的微生物的死細胞。
[0085]本領域技術人員將認識到并非所有化合物在針對所有害蟲中是同等有效的。實施 方案的化合物展示出針對昆蟲害蟲的活性，這可以包括經濟上重要的農藝學、森林、溫室、 苗圃、觀賞植物、食物和纖維、公共和動物健康、家用和商業結構、家庭和貯存產物害蟲。 [0086] 廣泛多樣的生物測定技術是本領域技術人員已知的。一般程序包括將實驗化合物 或生物添加到封閉容器中的飲食來源。殺蟲活性可以通過但不限于下述進行測量：在攝食 和暴露合適時間長度后的死亡率中的改變、重量減輕、吸引力、驅性以及其他行為和身體改 變。本文描述的生物測定可以對于幼蟲或成蟲期中的任何攝食昆蟲害蟲使用。 實施例
[0087]本發明的以下實施例所使用的分子生物學技術和方法均為目前比較成熟的技 術。其中大部分技術是本實驗室常用的核心技術，另外該技術在CurrentProtocolsin MolecularBiology和MolecularCloning:ALabortoryManual等文獻中均有詳細記載。 下述實施例為了舉例說明而不是限制而呈現。
[0088]實施例1:原核表達和包含體抽提 將改良型K/a?編碼序列構建到原核表達載體pET22b上（圖1)，利用大腸桿菌DH5a菌株進行原核表達和包含體抽提。具體步驟如下：取單克隆菌落小養過夜，再大養50ml至 0D600達0. 4-0. 6;取lml培養液于13000rpm條件下離心收集lmin，再用30ul水溶解；之 后，加入IPTG至ImM，培養6hr;再將培養液于4°C和8000rpm條件下，離心10min，去上清； 用10ml1XPBS重懸沉淀，加入溶菌酶10mg，25°C處理30min;再加入蛋白酶抑制劑PMSF至 終濃度為ImM，于冰上超聲破碎（200W，30S超聲，30S間隔，30個循環);之后，加入TritonX- 100,至終濃度為1%，室溫混合30min;接著，于4°C和12000rpm條件下離心lOmin;之后，將 離心收集的沉淀用包涵體蛋