3d免疫細胞培養支架及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于免疫細胞培養技術領域，具體涉及一種3D免疫細胞培養支架及其制備方法。
【背景技術】
[0002]DC-CIK共免疫中，DC (dendritic cell，樹突狀細胞)主要是從骨髓組織、血液中分離出的具有很強的捕獲抗原、呈遞抗原的能力和分泌能力，能夠誘導持久有力的特異性抗腫瘤免疫反應；而011((細胞因子誘導的殺傷細胞)是人外周血中單個核細胞在體外經多種細胞因子刺激后獲得的一群異質細胞。它具有增殖能力強、殺瘤活性高和殺瘤譜廣、臨床應用不良反應小的特點，是腫瘤過繼免疫治療中更為有效的殺瘤效應細胞。DC-CIK聯合免疫中，將DC細胞和CIK細胞進行共培養，使兩者之間相互既促進DC的成熟，更能促進ClK的增殖并且加強CIK的腫瘤殺傷效力。
[0003]然而在上述DC與CIK的共培養中，由于DC本身分離自單個核細胞(PBMC)體外培養中的半貼壁細胞。目前進行共培養時，都是將DC直接貼附在培養容器上，培養容器的生長氛圍不如原始生存環境，導致DC的生長、成熟以及表達的性狀、免疫活性等方面都不能達到原始體內環境的水平，大大影響了 DC所要具備的抗原提呈效果。而由于CIK功能的強弱與DC的細胞密度以及其提呈的專一性有關，DC體外增殖能力低、相反CIK競爭性增殖能力強大，會造成DC不足引起與CIK的接觸機會低，從而使得DC的抗原提呈作用無法發揮，從而降低CIK的治療效力。
[0004]因此，在上述培養環境不能滿足DC培養體外增殖的情形下，通常技術人員在培養中借用培養通常細胞的中空纖維培養、微載體培養以及微囊培養法等提升培養的環境，以彌補簡單液體培養瓶的不足；但是，DC這一類的單核貼壁細胞貼壁的容器壁面形狀迥異于人體內的微環境，在培養的過程中細胞體自身也容易受剪切力的損傷；更主要地，細胞的生長方向多趨于二維，導致采用上述培養方式DC細胞與抗原接觸機會仍然不足，細胞品質仍然無法達到較好的預期。
【發明內容】
[0005]本發明實施的目的在于克服上述體外培養中常規培養瓶培養環境的不足，提供一種3D免疫細胞培養支架及其制備方法。
[0006]為了實現上述發明目的，本發明實施例的技術方案如下:
[0007]—種3D免疫細胞培養支架的制備方法，包括如下步驟:
[0008]獲取膠原蛋白；
[0009]將所述膠原蛋白用0.03?0.06mol/L的醋酸溶解，制成質量分數I?2%的膠原溶液；
[0010]將所述膠原溶液冷凍成型，獲得膠原塊；
[0011]將所述膠原塊進行真空干燥，獲得膠原海綿體；
[0012]將所述膠原海綿體于100?110°C下進行真空熱交聯。
[0013]本發明的上述膠原支架的制備過程中，相比其他的普通的培養載體，其針對于DC細胞在體內的間質環境，采用膠原蛋白制成多孔隙的柔性支架，膠原蛋白的纖維粘性可以提升DC的吸附效果，從而使半貼壁類型的DC能具有全貼壁的能力；并且制備的支架具有的多孔隙的微孔環境，可以用來固定細胞的作用，以避免在大量CIK共培養中液體培養中懸浮和流動導致與CIK無法穩定接觸的不足；從而提升DC和CIK的接觸。
[0014]本發明進一步還提出一種根據上述方法直接制備得到的3D免疫細胞培養支架。該膠原蛋白纖維連接一體的支架整體，支架自身具有的多孔隙的微孔環境，并且自身具有良好的復水性和細胞親和性能，能保持或者吸收養料形成細胞培養的料床，提供相比其他支架更好的細胞培養環境；進行DC和CIK共培養的過程中，孔隙內細胞的保持能力在局部上可以提升DC和CIK的接觸幾率，提升DC和CIK培養的細胞活性和品質。
【具體實施方式】
[0015]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0016]本發明實施例提出一種3D免疫細胞培養支架的制備方法，包括如下步驟:
[0017]S01，將膠原蛋白溶解在0.03?0.06mol/L的醋酸溶液中，制成質量分數I?2%的膠原溶液；
[0018]S02，將膠原溶液于模具中冷凍成型，得到膠原塊；
[0019]S03，將膠原塊進行真空干燥，得到膠原海綿體；
[0020]S04，將膠原海綿體于100?110°C下進行真空熱交聯，即得到膠原支架。
[0021]本發明的上述膠原支架的制備過程中，相比其他的普通的培養載體，其針對于DC細胞在體內的間質環境，采用膠原蛋白制成多孔隙的柔性支架，膠原蛋白的纖維粘性可以提升DC的吸附效果，從而使半貼壁類型的DC能具有全貼壁的能力；并且制備的支架具有的多孔隙的微孔環境，可以用來固定細胞的作用，以避免在大量CIK共培養中液體培養中懸浮和流動導致與CIK無法穩定接觸的不足；從而提升DC和CIK的接觸。
[0022]同時，本發明的支架的材質是膠原蛋白，膠原支架能夠為體外培養細胞提供與其組織來源相似甚至相同的細胞生長微環境和細胞聯系，更接近于體內生長模式，形成類似體內組織的結構，發揮其功能；從而實現既利于各類細胞的分化定向誘導，又利于細胞分化表型的維持和增殖。
[0023]其中在上述步驟SOl中首先將原料膠原蛋白溶解制成溶液，是為了在制備溶液的過程中能夠使膠原蛋白的蛋白纖維重新分布，保證重新成型后的固態形狀的品質；雖然本發明在3D支架的早期制備中采用直接將膠原蛋白采用冷凍抽干直接固化成型，也可得到組織工程載體；但是這樣的方式得到的載體之后進行細微的電鏡掃描觀察，其微觀結構紊亂且整體并不穩定，內部蛋白纖維連接并不穩定，往往在DC還未培養至成熟就已經分解破碎。而細胞培養中如果支架的孔隙過大，那么細胞無法良好地貼服，如果孔隙小，那么細胞短短幾次分裂之后會因為空間、養料的不足而死亡；所以本發明中用溶解之后使其纖維均一形成溶液，避免直接抽干之后孔隙不均一的缺陷。
[0024]進一步在步驟S02中將膠原溶液于模具中冷凍成型，得到膠原塊；而在該步驟中，基于本發明中膠原蛋白濃度和冷凍的要求，采用冷凍過程控制-20?30°C左右I?2h即可。采用凍干的方式得到固化的膠原蛋白，一方面可以初步形成支架的雛形，另一目的在于維持后續交聯的過程中蛋白分子不至于沉降、聚集等等。其中，需要指出的是該模具的采用是基于支架成型的形狀進行的采用，根據所需填充的培養容器的大小或者不同培養容器的形狀，模具也可以進行相應的改變，或者可以自行設計均可。冷凍成型的過程中，一般控制時間I?2h即可，避免溫度進一步過低下進行凍干生成冰晶的剪切力過大對蛋白纖維造成更加驗證的變性傷害。
[0025]在固化成塊狀之后步驟S03中將固化后形成的膠原塊進行真空干燥，得到膠原海綿體。在該步驟中通過真空將凍結的膠原塊中的冰晶直接進行升華從而去除，在真空條件下進行干燥的過程，可以保持生物活性，尤其是避免熱敏和氧化等情形使其被破壞。并且在真空凍結中進行升華干燥之后，能形成“骨架”，干燥后能保持原形，體積幾乎不變。凍干之后形成的海綿體，復水性好，可迅速溪水還原成凍干前的狀態。這一復水性的海綿特性能使支架之后被用于液體培養基的過程時，自身能吸收很多液體培養基中的養料成分，之后支架自身便可以作為細胞的料床，為細胞的生長提供較為全面的三維環境，而不僅僅只是簡單的粘附。
[0026]而進一步出于品質的效果，由于上述步驟S04中需要對蛋白纖維的交聯度和干化的程度進行掌控，而影響熱交聯處理中這一效果的，還有步驟S03中將將膠原塊進行真空干燥得到膠原海綿體步驟中，真空干燥的程度。基于這一目的，本發明中步驟S03的干燥時間控制36?48h，使干燥的過程冷凍干燥程度即可，而不進行到解析干燥的步驟。采用冷凍干燥36?48h將其中的冰升華為水蒸氣的升華干燥(非解析干燥)方式，這一過程能除去的是膠原塊中原本溶液中的大量的自由水分子，而不會去除與蛋白分子吸附的結合水；保留這些結合水有利于后續熱交聯過程中防止過度干化，從而保證支架的品質。而如果進一步加長時間并調整溫度，進行解析干燥的話，吸附水會大量的被從吸附狀態解析出來，這樣并不利于后續的支架品質。所以本發明中控制時間為36?48h，并且真空干燥的過程中，保持溫度與冷凍成型的溫度基本相當即可。
[0027]之后步驟S04將真空干燥后形成的海綿體進行真空交聯，通過真空下高熱100?IlOtC使蛋白質分子可通過氨基酸殘基上的羥基、氨基、羧基之間的脫水縮臺而交聯。真空交聯也是為了避免發生氧化交聯，因為一般通常下蛋白質氧化也是可以交聯的，具體為在氧氣(一般有空氣即可)條件下，蛋白質分子可發生硫氫基與硫氫基的氧化型交聯從而生成二硫鍵。這種氧化交聯雖然某種程度上可以增加固化后交聯的蛋白的硬度，但是卻大大降低了縮脹性能，不利于后續的復水，柔韌性上也會有所欠缺。所以本發明步驟S04中將上述海綿體進行真空熱交聯，避免氧化交聯的情況，從而保證熱交聯的過程不至于大大降低支架的復水性能。
[0028]同時，經過本發明中的反復實施和考察，在步驟S04的真空交聯處理中，熱交聯處理的程度會影響到纖維蛋白直接的性能。熱交聯時間過長，蛋白纖維干化過于嚴重，那么之后再用于組織培養時，支架自身脫水或者硬化的不可逆程度過高，之后復水性、表面親和性都會大量降低，從而降低支架用于細胞培養的效果；所以經過反復的驗證，本發明將步驟S04中真空交聯的過程控制15?18h，得到實驗所需的膠原支架，一方面避免交聯度不夠支架容易過早降解，也能避免干化嚴重的缺陷。
[0029]其中，上述膠原支架的原料膠原蛋白本身可以直接去購買或者自行制備，本發明步驟SOl中所采用的膠原蛋白最好采用成纖維膠原蛋白，主要一方面是來源廣，包括I型膠原、II型膠原、III型膠原、XI型膠原、XXIV型膠原和XXVII型膠原，約占膠原總數的90%。相比成纖維膠原，非成纖維膠原的α-鏈既含有三螺旋域(膠原域，C0L)，還含有非三螺旋域(非膠原域，NC)，結構上不利于交聯形成孔隙均一和穩定的支架。
[0030]本發明的上述制備方法，白針對DC和CIK等免疫細胞的特點，采用膠原蛋白制成溶液，然后冷凍并行真空冷凍干燥。最后步驟S04再將真空脫水之后的膠原蛋白進行熱交聯固化，形成膠原蛋白纖維連接一體的支架整體。支架自身具有的多孔隙的微孔環境，并且自身具有良好的復水性和細胞親和性能，能保持或者吸收養料形成細胞培養的料床，提供相比其他支架更好的細胞培養環境。進行DC和CIK共培養的過程中，孔隙內細胞的保持能力在局部上可以提升DC和CIK的接觸幾率，提升DC和CIK培養的細胞活性和品質。
[0031]本發明在上述3D免疫細胞培養支架制備方法的基礎上，進一步還提出由上述方法直接制備得到的3D免疫細胞培養支架。
[0032]采用上述方法制備得到的支架，經過性能測試，柔韌性能比較好，非常易于保存和使用，并且在稍微潤濕之后培養容器的表面具有良好的粘附固定效果，基本上固定