專利名稱：一種提取法制備過氧化氫酶的方法
技術領域：
一種提取法制備過氧化氫酶的方法，屬于酶制品技術領域，涉及從動物肝臟提取法制備過氧化氫酶。
背景技術：
過氧化氫酶(catalase，CAT)，也稱觸酶，可從微生物發酵生產或動物肝臟中提取。過氧化氫酶為酶制劑，其主要作用是分解過氧化氫(俗稱雙氧水)。過氧化氫酶在紡織工業、食品工業和橡塑工業均有廣泛的應用。
據報道，一個過氧化氫酶分子可以分解約2500000個過氧化氫分子，其分解能力約為鐵離子的106倍左右，故在工業上過氧化氫酶有廣泛的應用。尤其在印染業中，用過氧化氫酶分解漂染過程中過量的H2O2，既可以節省操作時間，又能大量節約洗滌水和能耗，并減少了污水的排放，是一種高效又環保的催化劑。
過氧化氫酶廣泛存在于各種動物的器官中，尤以肝臟中含量最豐富。由于豬肝來源廣泛，價格低廉，非常適于作為提取過氧化氫酶的原料。
國外對過氧化氫酶的研究起步較早，自1937年首次推出作為細胞結晶化酶之一的牛肝過氧化氫酶之后，已利用選擇性沉淀法、層析法等不同方法從牛、馬或人的紅細胞、肝或腎中提純過氧化氫酶。用沉淀法(鹽析或有機溶劑沉淀等)，酶活損失大，工藝路線長，保存條件要求高，對環境有一定的污染。國內在過氧化氫酶方面的研究不多，微生物發酵法生產過氧化氫酶已列入國家“863”計劃，由江南大學承擔此課題。從豬肝中分離提取過氧化氫酶尚未見規模生產的文獻報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種提取法制備過氧化氫酶的方法，采用先進的分離純化技術，達到工藝簡單，提取效率高，酶活損失小，對環境無污染的目的。
本發明的技術方案以新鮮動物肝臟(豬肝或牛肝)為原料，經粉碎打漿，浸泡防腐，絮凝沉淀，加溫，板框過濾，超濾除腥，加鹽沉淀，加甲醛滅菌，最后澄清而制得過氧化氫酶產品。
肝臟豬肝打漿后加漿液重量比2-4倍量的水浸泡，浸泡液中添加防腐劑300000/L青霉素防腐，攪拌30分鐘，浸泡20-24小時；分層后清液調PH至6.0-7.0，添加清液體積比0.5％的1％濃度甲殼素溶液60-75rpm攪拌絮凝沉淀1.5-3小時；在0.3Mpa下用硅藻土助濾對浸泡液進行板框過濾得清酶液；將清酶液經超濾膜超濾除腥，在超濾液中添加重量比為20-25％的10％濃度NaCl溶液沉淀澄清，靜置過夜，再高速離心或板框壓濾除去沉淀，在清液中添加體積比為0.2-0.5％的35％甲醛溶液滅菌后，再過濾除去少量沉淀，即得產品過氧化氫酶。
具體步驟1)肝臟粉碎打漿豬肝或牛肝稱重，切成塊狀，用絞肉機打碎來回2-3次即可。
2)浸泡防腐將粉碎后的豬肝漿倒入鍋內，加入重量比2-4倍量的水，加入防腐劑，攪拌約30分鐘，浸泡20-24小時，將浸泡液上浮固體物去除，放出下清液，離心分離，棄渣，取清液。
由于浸泡溫度為25℃，豬肝中所含的營養又特別豐富，以前的浸泡都或多或少的發現有腐敗現象，在浸泡時添加300000/L的青霉素可以抑制細菌生長，為后處理減輕壓力，而且不會損失酶活。
3)絮凝沉淀為使酶更好地溶解在水中，并進一步去除雜蛋白，過濾前將PH調至6.0-7.0，加浸泡液體積比0.5％的1％甲殼素溶液，在60-75rpm絮凝沉淀1.5-3小時，產生大量絮凝沉淀，離心分離，去渣，取清液。絮凝后酶活沒有損失。
4)加溫將上述清液夾套加熱至50-55℃，保溫10分鐘，夾套通冷卻水冷卻至室溫。
5)板框過濾在0.3Mpa下用硅藻土助濾對浸泡液進行板框過濾得清酶液，效果比較理想，酶活不降低。
6)超濾除腥添加青霉素浸泡后，雖然沒有臭味，但腥味還是很重，由于過氧化氫酶的分子量一般為225000-250000之間，腥味主要是由成分復雜的小分子蛋白質產生，根據研究經驗，用截留分子量為80000的中空纖維超濾膜可以除去小分子蛋白。超濾濃縮3倍，酶損失可以忽略不計。
7)加鹽沉淀在超濾液中添加重量比為20-25％的10％濃度NaCl溶液沉淀澄清，靜置過夜，再高速離心或板框壓濾除去沉淀。
8)加甲醛滅菌在清液中添加體積比為0.2-0.5％的35％甲醛溶液滅菌后，再過濾除去少量沉淀，既可以滅菌，而且酶活沒有損失，上述酶液在25℃下敞口放置10天不發臭，跟蹤測酶活沒有損失，可以認為甲醛是有效的。
9)酶液最后澄清處理酶液經硅藻土助濾或高速離心可得澄清的制品。
本發明的有益效果本發明主要考慮從豬肝提取過氧化氫酶，并能適應大規模工業生產的需要。我國豬肝和牛肝原料豐富廉價，但從這些動物肝臟中提取過氧化氫酶的研究很少，過氧化氫酶產品的生產在我國是一個空白，國內市場上過氧化氫酶產品完全來自國外，開發生產高質量的國產過氧化氫酶將可取代進口產品。
過氧化氫酶是一種穩定的除氧酶。其作用是高效分解過氧化氫，可廣泛應用于紡織品氧漂后的生物除氧凈化工藝。能在大幅度節約水和能源的情況下清除氧漂后織物和水浴中殘留過氧化氫，避免后續活性染料染色中可能產生的染料分解或染色疵病。本產品使用方便、安全、性價比優越，具有節水、節能、節時、環保等優點，平均可降低工藝成本40％以上。
過氧化氫酶同樣適用于賓館、醫院、洗衣房等使用過氧化氫進行漂白或消毒的紡織品。防止由于織物中殘留過氧化氫的存在而造成使用者皮膚過敏，引發炎癥等不良后果。同時也可避免織物因過氧化氫殘留而引起的氧化脆損，從而延長使用期限。
從豬肝中提取過氧化氫酶，作為農副產品的深加工，還可增加養殖戶的收入。
具體實施例方式
實施例1取200g豬肝打漿后，加入400g水，按上述技術方案進行處理，不經濃縮，得產品過氧化氫酶，酶活≥15000u/ml。
實施例2取200g豬肝打漿后，加入400g水，按上述技術方案進行處理，濃縮約2倍，得產品過氧化氫酶，酶活≥30000u/ml。
實施例3取200g豬肝打漿后，加入400g水，按上述技術方案進行處理，在濃縮約4倍，得產品過氧化氫酶，酶活≥50000u/ml。
權利要求
1.一種提取法制備過氧化氫酶的方法，其特征是肝臟豬肝打漿后加漿液重量比2-4倍量的水浸泡，浸泡液中添加防腐劑300000/L青霉素防腐，攪拌30分鐘，浸泡20-24小時；分層后清液調PH至6.0-7.0，添加清液體積比0.5％的1％濃度甲殼素溶液60-75rpm攪拌下絮凝沉淀1.5-3小時；在0.3Mpa下用硅藻土助濾對浸泡液進行板框過濾得清酶液；將清酶液經超濾膜超濾除腥，在超濾液中添加重量比為20-25％的10％濃度NaCl溶液沉淀澄清，靜置過夜，再高速離心或板框壓濾除去沉淀，在清液中添加體積比為0.2-0.5％的35％甲醛溶液滅菌后，再過濾除去少量沉淀，即得產品過氧化氫酶。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是所用肝臟是牛肝。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是超濾采用截留分子量為80000的中空纖維超濾膜。
全文摘要
一種提取法制備過氧化氫酶的方法，屬于酶制品技術領域。本發明以新鮮豬肝或牛肝為原料，經浸泡使肝臟中所含過氧化氫酶溶于水中，添加青霉素防腐，離心后酶液添加甲殼素溶液絮凝雜蛋白，采用硅藻土助濾進行板框過濾，以超濾膜超濾除腥和濃縮，添加NaCl澄清沉淀，添加甲醛溶液滅菌，最后澄清處理制得產品過氧化氫酶。本發明所用原料豐富廉價，制備工藝采用先進的分離純化技術，工藝簡單，提取效率高，酶活損失小，對環境無污染，制備的產品酶活分別為≥15000u/ml，≥30000u/ml，≥50000u/ml。該產品用于分解紡織漂染時的殘留雙氧水，該產品使用方便安全、性價比優越，具有節水、節能、節時、環保、降低工藝成本等優點。
文檔編號C07K1/36GK1493688SQ0315295
公開日2004年5月5日 申請日期2003年9月4日 優先權日2003年9月4日
發明者沈國強, 孫亮, 花慧, 姜文侯 申請人:江南大學