對過氧化氫穩定的過氧化物酶變體的制作方法

專利名稱：對過氧化氫穩定的過氧化物酶變體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的過氧化物酶變體，和含有這種過氧化物酶變體的漂白或洗滌劑組合物。
在洗滌過程中使用漂白劑并作為洗滌劑組合物的成分是本領域中熟知的。因此，在市售的大部分洗滌劑組合物中摻有漂白劑或作為其成分出售。摻入洗滌劑組合物中的重要常規漂白劑是那些在洗滌過程中形成過氧化氫的作為其前體的化合物。用作漂白劑并以此方式起漂白作用的化合物，最重要的例子是過硼酸鹽和過碳酸鹽。現在還不知道用這些漂白劑漂白的詳細機制，但一般認為在洗滌過程中形成的過氧化氫通過氧化將有色物質(由其在織物上形成污漬)轉化為無色物質，有色物質與過硼酸鹽或過碳酸鹽直接作用也發生一些氧化。
現已發現以過氧化氫為底物的過氧化物酶能夠增強洗滌過程中過氧化氫的漂白效果。WO89/09813中描述了過氧化物酶漂白織物上污漬的應用。還發現從染色織物上瀝出的有色物質可借助過氧化物酶和過氧化氫一起漂白。WO91/05839中描述了過氧化物酶以此方式抑制染料轉移的應用。
現令人驚異地發現，可通過重組DNA技術制備在堿性條件下提高了對過氧化氫穩定性的過氧化物酶變體。
因此，本發明涉及在堿性條件下提高了對過氧化氫穩定性的過氧化物酶變體，其特征在于在SEQ ID.1中所示序列編碼的灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)過氧化物酶這一親本過氧化物酶的48-56，76，109，214，239，258-262，264，266-272氨基酸殘基區中插入、缺失或取代一個或多個氨基酸殘基。
經X線衍射獲得親本過氧化物酶結晶結構的信息，還通過親本過氧化物酶的氨基酸序列與其他已知過氧化物酶的氨基酸序列排列比較來獲得這些信息(K.G.Welinder等，″Structure and evolutionof peroxidases″in Plant Peroxidase Biochemistry and Physiology，K.G.Welinder等(編)，University of Copenhagen and Geneva1993)。
在本文中術語“提高了對過氧化氫的穩定性”意指在高達20mMH2O2濃度的過氧化氫存在下過氧化物酶變體穩定性至少比親本過氧化物酶的高10％。更具體講，這是指在10-60℃溫度范圍內一個或多個溫度下、在最高達20mM H2O2的一個或多個H2O2濃度下，過氧化物酶變體的半衰期比野生型過氧化物酶(親本過氧化物酶)的至少長10％。(通過將殘余活性與一級衰變相匹配來測定半衰期)。術語“堿性條件”指7-11的PH范圍。
另一方面，本發明涉及含有本發明過氧化物酶變體和過氧化氫源，任選還含有可氧化底物的漂白組合物；涉及含有表面活性劑、本發明的過氧化物酶變體，過氧化氫源、任選還含有可氧化底物的洗滌劑組合物。
參照附圖進一步說明本發明，其中

圖1表示質粒pHD414，它是質粒p775(在EP238023中有述)的衍生體。按實施例1獲得質粒pHD414。
在本說明書和權利要求中使用了下列縮寫氨基酸A＝Ala＝丙氨酸V＝Val＝纈氨酸L＝Leu＝亮氨酸I＝Ile＝異亮氨酸P＝Pro＝脯氨酸F＝Phe＝苯丙氨酸W＝Trp＝色氨酸M＝Met＝蛋氨酸G＝Gly＝甘氨酸S＝Ser＝絲氨酸T＝Thr＝蘇氨酸C＝Cys＝半胱氨酸Y＝Tyr＝酪氨酸N＝Asn＝天冬酰胺Q＝Gln＝谷氨酰胺D＝Asp＝天冬氨酸E＝Glu＝谷氨酸K＝Lys＝賴氨酸R＝Arg＝精氨酸H＝His＝組氨酸在描述本發明過氧化物酶變體過程中，為了指稱方便使用了下列命名原則原始氨基酸位置取代后的氨基酸根據這一命名原則，例如在48位由絲氨酸取代賴氨酸表示如下K48S；在此位缺失賴氨酸表示為K48*；插入另外的氨基酸殘基如酪氨酸則表示為K48KY。多個取代用加號隔開，即E214L＋E239L代表在214和239位由亮氨酸取代谷氨酸的突變。
親本過氧化物酶由SEQ ID No.1中所示氨基酸序列編碼。所述序列可從灰蓋鬼傘衍化而來。
在本發明過氧化物酶變體的一種實施方案中，在SEQ ID No.1中所示氨基酸序列編碼的親本過氧化物酶48-56，76，109，214，239，258-262，264，266-272氨基酸殘基區中缺失、插入或取代一個或多個氨基酸殘基。
在本發明過氧化物酶變體另一實施方案中，一個或多個氨基酸殘基可適當地取代如下K48S，V53K，A，G72Q，A91C，N92K，H109K，Q118E，M125A，P，W，G，S，T，C，Y，N，D，E，K，R，H，特別是 M125S，T，S147Q，I152C，P155C，M166A，P，W，G，S，T，C，Y，N，D，E，K，R，H，特別是 M166S，T，N192K，I195K，V206R，E214L，K218R，F229G，A230C，E239A，V，L，I，P，F，W，M，G，S，T，C，Y，N，Q，D，K，R，H，特別是 E239K，G，S，L，Q，M，M242A，P，W，G，S，T，C，Y，N，D，E，K，R，H，特別是 M242S，T，S244C，S252P，W258F，H，M261A，V，L，I，P，F，W，G，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，H，特別是 M261F，V，I，L，Q，M268A，V，L，I，P，F，W，G，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，H，特別是 M268F，V，I，L，Q，Y272A，V，L，I，P，F，W，G，S，T，C，M，N，Q，D，E，K，R，H，特別是 Y272F，M276A，P，W，G，S，T，C，Y，N，D，E，K，R，H，特別是 M276S，T，K278R，M279A，P，W，G，S，T，C，Y，N，D，E，K，R，H，特別是 M279S，T，A304E，V314P。
在一替代方案中，本發明過氧化物酶變體可為上述過氧化物酶變體的片段。
根據本發明，過氧化物酶序列的2個或多個氨基酸殘基可被取代如下K41R＋K48R，V53K＋Q118E，V53A＋E239G，I152C＋A91C，P155C＋A230C，M166F＋E239K，G167N＋V176L，E214L＋E239L，R241E＋E239K，S244C＋P155C，E239K＋M242I＋Y272F，M166F＋E239K＋M242I＋Y272F，M125L＋M166F＋E239K＋M242I＋Y272F。
根據本發明，本發明公開的取代、插入或缺失可與WO93/24618中公開的取代、插入或缺失相結合，WO93/24618中在本發明中示為SEQ ID No.1的親本過氧化物酶79-94，125，153-157，161-204，242，276-279氨基酸殘基區中缺失、插入或取代一個或多個氮基酸殘基。這種組合的一個實例是M242I＋Y272F＋E239K變體，在實施例4中證明其對過氧化氫具有良好的穩定性。
可按本領域熟知的各種方法從任何產生目標過氧化物酶的微生物分離編碼親本過氧化物酶的DNA序列。首先，應利用來自產生待研究過氧化物酶的生物體的染色體DNA或信使RNA構建基因組DNA和/或cDNA文庫。然后，如果過氧化物酶的氨基酸序列已知，可合成同源性標記寡核苷酸探針，用于從細菌DNA基因組文庫或從真菌cDNA文庫鑒定編碼過氧化物酶的克隆。或者，可在低嚴緊性雜交和沖洗條件下使用含有來自另一真菌菌株過氧化物酶的同源序列的標記寡核苷酸探針作為鑒定過氧化物酶編碼性克隆的探針。
另一種鑒定產生的過氧化物酶克隆的方法包括將基因組DNA片段插入諸如質粒的表達載體中，用形成的基因組DNA文庫轉化過氧化物酶陰性細菌，然后將轉化的細菌鋪在含過氧化物酶底物的瓊酯上。加入過氧化氫時那些含有攜帶過氧化物酶之質粒的細菌將產生周圍有清澈瓊脂圈的菌落，這是因為底物被所分泌的過氧化物酶氧化的緣故。
或者，按已有標準方法合成制備編碼酶的DNA序列，如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(Tetrahedron Letters22，1981，pp.1859-1869)描述的氨基亞磷酸酯法，或Matthes等(The EMBO J.3，1984，pp，801-805)所述方法。按照氨基亞磷酸酯法，在如自動DNA合儀上合成寡核苷酸，并徑純化、退火，連接并克隆在適當載體中。
最后，該DNA序列可以是基因組和合成的、合成的和cDNA或基因組和cDNA的混合來源，按標準技術將相當于整個DNA序列各個部分的合成、基因組或cDNA來源(適當時)的片段連接而成。還可用特異引物通過聚合酶鏈反應(PCR)制備該DNA序列，如US4,683,202或R.K.Saiki等Science239，1988，pp487-491所述。
一旦分離了編碼過氧化物酶的DNA序列并確定了突變的適宜位點，就可用合成寡核苷酸引入突變。這些寡核苷酸含有目標突變位點的側翼核苷酸序列；并在寡核苷酸合成中插入突變核苷酸。在一特定方法中，在攜帶過氧化物酶基因載體中在過氧化物酶編碼序列當中造成一單鏈DNA缺口。然后將帶有目標突變的合成核苷酸退火到單鏈DNA的同源性部分。剩余的缺口隨后用DNA聚合酶I(Klenow片段)填平，用T4連接酶連接該構建物。Morinage等(1984，Biotechnology2646-639)描述了該方法的一個具體例子。美國專利4,760,025(Estell等，于1988年7月26日授權)描述了通過對DNA序列盒進行小的改變引入編碼多個突變的寡核苷酸的方法，但用Morinage方法一次可引入更多種突變，因為能引入各種長度的多種寡核苷酸。
Nelson和Long(Analytical Biochemistry180，1989，pp147-151)描述了向過氧化物酶編碼序列中引入突變的另一種方法。它包括含有目標突變的PCR片段的3步生成法，用化學合成的DNA鏈作為PCR反應的引物之一引入突變。通過限制性內切酶酶切可從PCR產生的片段分離出帶突變的DNA片段，并再插入表達質粒中。
根據本發明，按上述方法之一或本領域已知的任何替代方法產生的突變過氧化物酶編碼序列可用表達載體表達成酶形式，表達載體典型地包括編碼啟動子、操縱子、核糖體結合位點、翻譯起始信號和任選的抑制基因或各種激活基因的調控序列。為了使得所表達蛋白可分泌，可在過氧化物酶編碼序列前插入編碼信號序列的核苷酸。為了在調控序列控制下表達，將靶基因在適當的讀碼框架中與調控序列有效地連接。可引入質粒載體并能支持突變過氧化物酶基因轉錄的啟動子序列，包括但不限于原核β-內酰胺酶啟動子(Villa-kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)和tac啟動子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)。在Scientific American，1980，24274-94中“Useful proteins from recombinant bacteria”一文中可找到其他參考文獻。
根據一種實施方案，用攜帶突變DNA的表達載體轉化枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。如果在諸如枯草芽孢桿菌的分泌性微生物中沒有表達，則在翻譯起始區之后和目標DNA序列之前需要一種信號序列。信號序列的作用是將表達產物運送到細胞壁，并在此處分泌時將其從產物上切下來。如上所定義的“調控序列”包括存在的信號序列。
用編碼本發明過氧化物酶變體的DNA序列轉化的宿主微生物還可以是酵母，優選酵母屬菌株，如釀酒酵母或pombe裂殖酵母，或畢赤酵母屬，如巴斯德畢赤酵母。
在現優選的一種產生本發明過氧化物酶變體的方法中，使用絲狀真菌作為宿主生物。這種絲狀真菌宿主生物可方便地為以前已用于產生重組蛋白的宿主之一，例如曲霉屬菌株，如黑曲霉、構巢曲霉或米曲霉。在如EP238023中廣泛描述了米曲霉在生產重組蛋白中的應用。
為了在曲霉中表達過氧化物酶變體，編碼過氧化物酶的DNA序列之前需有一啟動子。該啟動子可為在曲霉中顯示強轉錄活性的任何DNA序列，并可衍生自編碼細胞外或細胞內蛋白如淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂酶、過氧化物酶、纖維素酶或糖酵解酶的基因。
適宜啟動子的例子是那些衍生自編碼米曲酶TAKA淀粉酶、米黑毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲酶酸穩定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑毛霉脂酶、米曲霉堿性蛋白酶或米曲霉丙糖磷酸異構酶的基因。
特別當宿主生物為米曲霉時，用于本發明方法的優選啟動子是米曲霉TAKA淀粉酶啟動子，因為它在米曲霉中顯示強轉錄活性。EP 238023中描述了此TAKA淀粉酶啟動子的序列。
終止和多聚腺苷化序列可適當地衍生自啟動子的同一來源。
在EP238023中描述了用于轉化真菌宿主細胞的適當技術。
為了保證過氧化物酶變體從宿主細胞中分泌，編碼過氧化物酶變體的DNA序列之前可有一信號序列，它可以是天然存在的序列或其功能性部分或一種使蛋白從細胞分泌的合成序列。尤其，該信號序列可衍生自編碼曲霉淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因，編碼米黑毛霉脂酶或蛋白酶的基因，或編碼腐質霉纖維素酶、木聚糖酶或脂酶的基因。該信號序列優選地衍生自編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩定性α-淀粉酶、灰蓋鬼傘或macrorhizus過氧化物酶、或黑曲霉葡糖淀粉酶的基因。
用于培養轉化的宿主細胞的培養基可以是適于曲霉細胞生長的任何常規培養基。轉化子通常是穩定的并可在無任何篩選壓力下培養。但如果發現轉化子不穩定，可向細胞中引入篩選標記用于篩選。
從宿主細胞分泌的成熟過氧化物酶蛋白可按常規方法從培養基中回收，為人熟知的方法包括離心或過濾從培養基中分離細胞，用鹽如硫酸銨沉淀培養基中蛋白成分，然后進行層析步驟，如離子交換層析、親合層析等。
為了獲得過氧化物酶變體的漂白效果，本發明漂白組合物中應存在過氧化氫或過氧化氫前體，優選過硼酸鹽或過碳酸鹽，或產生過氧化氫的酶系統，如氧化酶和其底物，或過氧羧酸或其鹽作為過氧化物酶變體的底物。
雖然還沒有闡明過氧化物酶漂白織物上或洗滌液中有色物質的機制，但現今相信這種酶通過還原過氧化氫并氧化有色物質(電子供體底物)起作用，從而產生無色物質或不與織物吸附的物質。下述反應式1中描述了這一反應。反應式1通過使用對過氧化氫敏感性低的本發明過氧化物酶變體，可以向漂白/洗滌液中加入更少量的酶而仍然獲得滿意的漂白效果。
在漂白組合物中，過氧化物酶變體的量相當于洗滌液中濃度為0.01-20PODU/ml，過氧化氫或過氧化氫前體或產生過氧化氫的酶系統或過氧羧酸或其鹽的量相當于過氧化氫濃度最高達20mMH2O2。
過氧化物酶活性的測定一個過氧化物酶單位(PODU)是在下列催化條件下每分鐘催化1μmol過氧化氫轉化的酶量0.88mM過氧化氫，1.67mM 2.2′-連氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸鹽)，0.1M磷酸緩沖液，PH7.0，30℃保溫，然后在418nm處光度計測定。
對本發明過氧化物酶變體用作漂白組合物，現發現在洗滌和/或漂洗過程開始時或此過程中加入另一種(本發明過氧化物酶變體的)可氧化底物，可增強所用過氧化物酶變體的漂白效果。認為這是由于形成了該底物的自由基或其他氧化態，其參與有色物質的漂白或其他改性。這種可氧化物質的例子為有機化合物如酚類化合物，如對羥基苯磺酸鹽。其他可用于此目的的酚類化合物見M.Kato和S.shimizu的Plant Cell Physiol.，26(7)，1985，pp，1291-1301(特別參見表1)或B.C.Saunders等Peroxidase，London，1964，p.141 ff.WO94/12621中公開了其他類型增強劑，它們可用于此目的，例如吩噻嗪和吩、嗪和其衍生物，如10-甲基吩噻嗪，10-吩噻嗪-丙酸、N-羥基琥珀酰亞胺-10-吩噻嗪-丙酸酯、10-乙基-4-吩噻嗪-羧酸，10-乙基吩噻嗪，10-丙基吩噻嗪，10-異丙基吩噻嗪，10-吩噻嗪丙酸甲酯，10-苯基吩噻嗪，10-烯丙基吩噻嗪，10-(3-(4-甲基-1-哌嗪基)丙基吩噻嗪，10-(2-吡咯烷-1-基乙基)吩噻嗪，10-(3-二甲氨基丙基)吩噻嗪，2-氯-10-甲基吩噻嗪，2-乙酰-10-甲基吩噻嗪和10-甲基吩噁嗪。
可氧化底物的量相當于每升洗液中濃度為0.1μM到100μM。
洗滌劑組合物本發明的過氧化物酶變體可作為一種成分加入洗滌劑組合物中。因此，它可作為一種洗滌劑添加劑包括在洗滌劑組合物中。洗滌劑組合物和洗滌劑添加劑通常還含有一種或多種其他酶如脂肪酶、淀粉酶、角質酶和纖維素酶。
在一個特定方面，本發明提供一種洗滌劑添加劑。可通過加入多個含有一種或多種酶的分離式添加劑或加入一種含有所有這些酶的聯合式添加劑而將酶加入洗滌劑組合物中。本發明的洗滌劑添加劑，即分離式添加劑或聯合式添加劑，可制成如粒狀、液態、漿液等。優選的洗滌劑添加劑制品是顆粒狀的(尤其是非粉塵顆粒)、液態的(尤其是穩定的液體)、漿狀或被保護酶的形式。
可按US4,106,991及4,661,452的方法(均為Novo IndustriA/S專利)生產非粉塵顆粒，并選擇性采用本領域中已知的方法對非粉塵顆粒進行包被。蠟樣包被材料的例子有平均摩爾分子量為1000至20000的聚(環氧乙烷)產物(聚乙二醇；PEG)；含有16到50個環氧乙烷單位的乙氧基化壬基酚；含有15到80個環氧乙烷單位的乙氧基化脂肪醇(其中的醇含有12-20個碳原子)；脂肪醇；脂肪酸；甘油單-，雙-及三脂肪酸酯。專利GB1483591中給出了適用于流化床技術的涂膜包被材料的例子。根據已建立的方法在液態酶制劑中加入多羥基化合物如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸可達到穩定作用。本領域的技術人員熟知其他酶穩定劑。可按EP238,216的方法制備被保護酶。
本發明的洗滌劑組合物可制成任何方便的形式，如粉狀、顆粒狀、糊狀或液態。液態洗滌劑可以是典型的含高達70％的水及0-30％有機溶劑的水性洗滌劑，也可是非水性的。
該洗滌劑組合物中含一種或多種表面活性劑，它們可以是陰離子、非離子、陽離子或兩性離子型。本洗滌劑中通常含有0-50％的陰離子表面活性劑，如線性烷基苯磺酸鹽(LAS)，α-烯屬磺酸鹽(AOS)，烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸酯)(AS)，乙氧基化醇硫酸酯(AEOS或AES)，二級烷磺酸鹽(SAS)，α-磺基脂肪酸甲酯，烷基或鏈烯基琥珀酸或皂。還可以含0-40％的非離子表面活性劑，如醇乙氧基化物(AEO或AE)，羧基化醇的乙氧基化物，壬基酚乙氧基化物，烷基聚甘醇甙，烷基二甲胺氧化物，乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺，脂肪酸單乙醇酰胺，或多羥基烷基脂肪酸酰胺(如W092/06154中所述)。
本洗滌劑組合物中還可含有一種或多種其他酶，如淀粉酶、脂肪酶、角質酶、蛋白酶和纖維素酶。
本洗滌劑中可含有1-65％的洗滌劑助洗劑或配合劑，如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或層疊式硅酸鹽(如從Hoechst得到的SKS-6)。本洗滌劑還可以是不帶助洗劑的，即基本上不含洗滌劑助洗劑。
本洗滌劑可含一種或多種聚合物。例如，羧甲基纖維素(CMC)，聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)，聚(乙烯基醇)(PVA)，多羧基化合物如聚丙烯酸、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂基酯/丙烯酸共聚物。
本洗滌劑可含有漂白系統，其中可包括H2O2源如過硼酸鹽或過碳酸鹽，它們可以和過酸形成型漂白活化劑如四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰氧基苯磺酸鹽結合使用。或者，漂白系統可含有如酰胺、酰亞胺或砜型的過氧酸。
本發明的洗滌劑組合物中的酶可用常規的穩定劑來穩定，如丙二醇或甘油之類的多羥基化合物、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如硼酸芳酯，此組合物可按WO92/19709和WO92/19708中所述方法配制。
該洗滌劑中還可含有其他常規洗滌劑組分，如包括粘土的織物調理劑、泡沫促進劑、抑泡劑、抗腐蝕劑、污物懸浮劑、防污物再沉劑、染料、殺菌劑、熒光增白劑或香味劑。
PH值(在使用濃度的水溶液中測定)通常為中性或堿性，如7-11。
本發明范圍內的特定洗滌劑組合物包括1).配制成堆積密度至少為600g/l的顆粒狀洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計)7-12％-乙氧基醇硫酸酯(如C12-18的醇，1-4％1-2EO)或烷基硫酸鹽(如C16-18)-醇乙氧基化物(如C14-15的醇，7EO) 5-9％-碳酸鈉(按Na2CO3計) 14-20％-可溶性硅酸鹽(按Na2O·2SiO2計) 2-6％-沸石(按NaAlSiO4計)15-22％-硫酸鈉(按Na2SO4計) 0-6％-檸檬酸鈉/檸檬酸 0-15％(按C6H5Na3O7/C6H8O7計)-過硼酸鈉(按NaBO3H2O計) 11-18％-TAED 2-6％-羧甲基纖維素 0-2％-聚合物(如馬來酸/ 0-3％丙烯酸共聚物，PVP，PEG)-酶 0-5％
-小成分(如抑泡劑，香味劑，熒光增白劑，光漂白劑)0-5％2).配制成堆積密度至少為600g/L的顆粒狀洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計) 6-11％-乙氧基醇硫酸酯(如C12-18的醇，1-2EO) 1-3％或烷基硫酸鹽(如C16-18)-醇乙氧基化物(如C14-15的醇，7EO)5-9％-碳酸鈉(按Na2CO3計) 15-21％-可溶性硅酸鹽(按Na2O·2SiO2計)1-4％-沸石(按NaAlSiO4計) 24-34％-硫酸鈉(按Na2SO4計) 4-10％-檸檬酸鈉/檸檬酸 0-15％(按C6H5Na3O7/C6H8O7計)-羧甲基纖維素 0-2％-聚合物(如馬來酸/丙烯酸共聚物PVP，PEG) 1-6％-酶 0-5％-小成分(如抑泡劑、香味劑) 0-5％3).配制成堆積密度至少為600g/L的顆粒狀洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計) 5-9％-醇乙氧基化物(如C12-15的醇，7EO) 7-14％-作為脂肪酸的皂類(如C16-22) 1-3％-碳酸鈉(按Na2CO3計) 10-17％-可溶性硅酸鹽(按Na2O·2SiO2計)3-9％-沸石(按NaAlSiO4計) 23-33％
-硫酸鈉(按Na2SO4計) 0-4％-過硼酸鈉(按NaBO3·H2O計)8-16％-TAED 2-8％-膦酸鹽(如EDTMPA) 0-1％-羧甲基纖維素 0-2％-聚合物(如馬來酸/丙烯酸 0-3％共聚物，PVP，PEG)-酶 0-5％-小成分(如抑泡劑，香味劑，熒光增白劑) 0-5％4).配制成堆積密度至少為600g/L的顆粒狀洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計) 8-12％-醇乙氧基化物(如C12-15的醇，7EO) 10-25％-碳酸鈉(按Na2CO3計) 14-22％-可溶性硅酸鹽(按Na2O·2SiO2計)1-5％-沸石(按NaAlSiO4計) 25-35％-硫酸鈉(按Na2SO4計) 0-10％-羧甲基纖維素 0-2％-聚合物(如馬來酸/丙烯酸共聚物， 1-3％PVP，PEG)-酶 0-5％-小成分(如抑泡劑，香味劑) 0-5％5).水性液態洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計) 15-21％-醇乙氧基化物 12-18％
(如C12-15的醇，7EO或C12-15的醇，5EO)-作為脂肪酸的皂(如油酸)3-13％-鏈烯基琥珀酸(C12-14) 0-13％-氨基乙醇 8-18％-檸檬酸 2-8％-膦酸鹽 0-3％-聚合物(如PVP，PEG) 0-3％-硼酸鹽(按B4O7計) 0-2％-乙醇 0-3％-丙二醇8-14％-酶 0-5％-小成分(如分散劑，抑泡劑，香味劑，熒光增白劑) 0-5％6).水性結構化液態洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計) 15-21％-醇乙氧基化物 3-9％(如C12-15的醇，7EO或C12-15的醇，5EO)-作為脂肪酸的皂(如油酸)3-10％-沸石(按NaAlSiO4計) 14-22％-檸檬酸鉀 9-18％-硼酸鹽(按B4O7計) 0-2％-羧甲基纖維素 0-2％-聚合物(如PVP，PEG) 0-3％-結合聚合物(如甲基丙烯酸月桂基酯/ 0-3％丙烯酸共聚物，摩爾比25∶1，分子量3800)
-甘油 0-5％-酶0-5％-小成分(如分散劑，抑泡劑，香味劑， 0-5％熒光增白劑)7).配制成堆積密度至少為600g/L的顆粒狀洗滌劑組合物含有-脂肪醇硫酸酯 5-10％-乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺 3-9％-作為脂肪酸的皂0-3％-碳酸鈉(按Na2CO3計) 5-10％-可溶性硅酸鹽(按Na2O·2SiO2計) 1-4％-沸石(按NaAlSiO4計) 20-40％-硫酸鈉(按Na2SO4計) 2-8％-過硼酸鈉(按NaBO3·H2O計) 12-18％-TAEP 2-7％-聚合物(如馬來酸/丙烯酸共聚物，PEG)1-5％-酶0-5％-小成分(如熒光增白劑，抑泡劑，香味劑) 0-5％8).配制成顆粒狀的洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計) 8-14％-乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺 5-11％-作為脂肪酸的皂0-3％-碳酸鈉(按Na2CO3計) 4-10％-可溶性硅酸鹽(按Na2O·2SiO2計) 1-4％-沸石(按NaAlSiO4計) 30-50％
-硫酸鈉(按Na2SO4計) 3-11％-檸檬酸鈉(按C6H5Na3O7計) 5-12％-聚合物(如PVP，馬來酸/ 1-5％丙烯酸共聚物，PEG)-酶0-5％-小成分(如抑泡劑，香味劑) 0-5％9).配制成顆粒狀的洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計) 6-12％-非離子表面活性劑 1-4％-作為脂肪酸的皂2-6％-碳酸鈉(按Na2CO3計)14-22％-沸石(按NaAlSiO4計) 18-32％-硫酸鈉(按Na2SO4計) 5-20％-檸檬酸鈉(按C6H5Na3O7計) 3-8％-過硼酸鈉(按NaBO3·H2O計)4-9％-漂白活化劑(如NOBS或TAED) 1-5％-羧甲基纖維素 0-2％-聚合物(如多羧基化合物或PEG) 1-5％-酶0-5％-小成分(如熒光增白利，香味利) 0-5％10).水性液態洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計)15-23％-乙氧基醇硫酸酯(如C12-15的醇，2-3EO) 8-15％-醇乙氧基化物 3-9％
(如C12-15的醇，7EO或C12-15的醇，5EO)-作為脂肪酸的皂(如油酸) 0-3％-氨基乙醇1-5％-檸檬酸鈉 5-10％-水溶助長劑(如甲苯磺酸鈉)2-6％-硼酸鹽(按B4O7計) 0-2％-羧甲基纖維素0-1％-乙醇1-3％-丙二醇 2-5％-酶 0-5％-小成分(如聚合物，分散劑，香味劑， 0-5％熒光增白劑)11).水性液態洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計) 20-32％-醇乙氧基化物 6-12％(如C12-15的醇，7EO或C12-15的醇，5EO)-氨基乙醇2-6％-檸檬酸 8-14％-硼酸鹽(按B4O7計) 1-3％-聚合物 0-3％(如馬來酸/丙烯酸共聚物，結合聚合物如甲基丙烯酸月桂基酯/丙烯酸共聚物和CMC)-甘油3-8％-酶 0-5％
-小成分(如水溶助長劑， 0-5％分散利，香味劑，熒光增白劑)12).配制成堆積密度至少為600g/L的顆粒狀洗滌劑組合物含有-陰離子表面活性劑 25-40％(如線性烷基苯磺酸鹽，烷基硫酸鹽，α-烯屬磺酸鹽，α-磺基脂肪酸甲酯，烷磺酸鹽，皂)-非離子表面活性劑(如醇乙氧基化物) 1-10％-碳酸鈉(按Na2CO2計) 8-25％-可溶性硅酸鹽(按Na2O·2SiO2計)5-15％-硫酸鈉(Na2SO4計) 0-5％-沸石(按NaAlSiO4計) 15-28％-過硼酸鈉(按NaBO3·4H2O計)0-20％-漂白活化劑(TAED或NOBs) 0-5％-酶 0-5％-小成分(如香味劑，熒光增白劑)0-3％13).如1)-12)中所述洗滌劑配方，其中的線性烷基苯磺酸鹽-或其一部分-被烷基硫酸鹽(C12-18)所取代。14).如1)-13)中所述洗滌劑配方，其中含有作為附加成分或已指定的漂白系統取代物的穩定化的或包囊的過酸。15).如1)、3)、7)、9)及12)中描述的洗滌劑組合物，其中的過硼酸鹽被過碳酸鹽所取代。16).如1)、3)、7)、9)、及12)中所述洗滌劑組合物，其另外含有錳催化劑，如可為Nature，369，1994，pp.637-639中的文章《低溫漂白的高效錳催化劑》中所述化合物的一種。17).配制成含有液態非離子表面活性劑(如線性烷氧基化伯醇)、助洗系統(如磷酸鹽)、酶及堿的非水性洗滌液的洗滌劑組合物。該洗滌劑中還可含有陰離子表面活性劑和/或漂白系統。
現在考慮，可向本發明洗滌劑組合物中加入一定量的過氧化物酶變體，該量相當于洗液中濃度為0.01-20PODU/ml。
在以下實施例中進一步說明本發明，但無意對所要求的本發明范圍進行任何限制。
實施例1.
構建表達灰蓋鬼傘過氧化物酶K48S變體的質粒1.克隆編碼灰蓋鬼傘過氧化物酶的cDNA用PCR方法構建探針用特異寡核苷酸引物進行聚合酶鏈反應(PCR)制備過氧化物酶cDNA片段(R.K.Saiki等，Science 239，1988，pp.487-491)，在灰蓋鬼傘過氧化物酶的氨基酸序列基礎上構建引物。用基因擴增(Gene Amp)試劑盒和儀器(從Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT，USA購得)按制造商的說明進行PCR，只是反應先在28℃進行3個循環以與第一條cDNA更好地雜交(從灰蓋鬼傘IFO 8371獲得的mRNA制得)，隨后在65℃進行30個PCR循環。
PCR中使用下列特異引物
T T1.5′-GCGCGAATTCGTNGGNATNAACCACGG-3′A A2.3′-TACAGNTTGACGGGNGGCCTAGGCG-5′A T T3.5′-GCGAATTCACNCCNCAGGTNTTCGACAC-3′AT A4.3’-GGNAAGGGNCCNCTCAAGCCTAGGCG-5′A5.5′-GCGCGAATTCTGGCAGTCNAC-3′A6.5′-GCGCGAATTCTGGCAGAGNATG-3′T7.3′-CGNTACCGNTTCTACAGCCTAAGG-5′“N”指所有四種核苷酸的混合物。
這些引物按如下配對1與2，3與4，5與7，6與7，1與4，1與7及3與7。這樣在5′末端以EcoRI位點和在3′一末端以BamHI位點延伸PCR片段。在1％瓊脂糖凝膠上分析PCR反應。在所有反應中發現了預期大小的帶。為了證實這些帶相當于過氧化物酶特異序列，將凝肢進行Southern印跡，并與具有以下序列的寡核苷酸探針雜交T A A A T5′-GTCTCGATGTAGAACTG-3′T該序列位于PCR引物3和4之間。發現該探針與約130bp、420bp、540bp、和240bp的帶雜交，因此說明所觀察到的DNA帶相應于過氧化物酶序列。
來自各種PCR反應的DNA用EcoRI和BamHI消化并克隆到質粒pUC19中(C.Yanisch-Perron等，Gene33，1985，pp.103-119)。通過用上述寡核苷酸探針雜交鑒定有正確PCR片段的菌落。按Sanger等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，1977，pp.5463-5467)所述的限制酶作圖和部分DNA序列分析分析陽性菌落的DNA。來自用引物1和4獲得的克隆之一的430bp片段用于按如下所述篩選灰蓋鬼傘cDNA文庫。
在大腸桿菌中構建灰蓋鬼傘cDNA文庫按如Boel等(EMBO J.31097-1102，1984)和Chirgwin等(Biochemistry(wash)，185294-5299，1979)所述方法在最高過氧化物酶活性時收集菌絲體，從勻漿化的灰蓋鬼傘(IFO8371)菌絲體提取總RNA。如Aviv和Leder(PNAS，USA691408-1412，1972)所述在Oligo(dT)-纖維素上進行兩輪親和層析獲得含Poly(A)的RNA。用購自Invitrogen的cDNA合成試劑盒按制造商的說明合成cDNA。將來自灰蓋鬼傘cDNA文庫的約50,000大腸桿菌重組子轉移到Whatman540濾紙上。按Gergen等所述(NucleicAcids Res.7，2115-2135，1979)裂解及固定菌落。此濾紙在0.2×SSC，0.1％SDS中與32P—標記的430bp過氧化物酶特異探針雜交。在65℃進行濾紙雜交和洗滌，然后用增敏屏放射自顯影24小時。放射自顯影后，升高溫度洗滌濾紙，然后再用增敏屏放射自顯影24小時。按此方式鑒定了50個陽性克隆。按標準方法(Birnboim和DolyNucleic Acids Res.7，1513-1523，1979)從雜交的菌落分離Miniprep質粒DNA，按Sanger二脫氧方法(Sanger等Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，1977，PP.5463-5467)測定插入的cDNA的DNA序列。通過用HindIII/XhoI酶切將過氧化物酶cDNA片段從載體上切下，并用瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫并準備用于連接反應。將此cDNA連接到HindIII/XhoI酶切的pHD414中生成pCiP，其中cDNA處在米曲霉TAKA啟動子和黑曲霉AMG終止子的轉錄調控之下。
曲霉表達載體pHD414的構建載休pHD414是質粒p775(在EP238023中有述)的衍生體。與p775不同，pHD414中在啟動子和終止子之間有一串單一的限制性位點。
通過在終止子3′末端除去約200bp長的片段(含有不希望的限制位點)，然后在啟動子5′末端除去約250bp長的片段(也含有不希望的限制位點)來制備該質粒。通過用NarI(于pUC載體中)和XbaI(正位于終止子的3′末端)酶切從p775除去200bp區域，然后用Klenow DNA聚合酶＋dNTP補平所造成的末端，在凝膠上純化該載體片段并再連接。按如上所述方法用此DNA轉化大腸桿菌MC1061。挑選10個菌落(pHD413-1到pHD413-10)并用限制酶分析法進行分析。一個克隆在限制酶分析中顯示所期望的帶型，用于構建pHD414。
pHD413用StuI(于啟動子的5′末端)和PvvII(于pUC載體中)酶切，并在凝膠上分離。純化該載體片段，再連接并轉化至大腸桿菌MC1061中。挑選12個菌落，按限制性酶分析法進行分析。所有12個克隆均顯示所希望的帶型。質粒pHD414示于圖1中。
2.三步PCR誘變三步PCR誘變中使用四種引物誘變引物(＝A)5′CCT GTT CGA TCG ATT CTT AGA-3′pCR輔助引物1 (＝B)5′-TGA TCA TAG TAC CAT CTA ATT ACA TCA AGCGGC-3′pCR輔助引物2 (＝C)5′-CTG TAA TAC GAC TCA CTA-3′pCR Handle (＝D)5′TGA TCA GAC TAG TAC CAT-3′將引物A和B稀釋至20pmol/μl。引物C和D稀釋至100pmol/μl。
所有三步在10×PCR緩沖液中進行100mM Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl2，0.1％明膠，2mM dATP、2mMdCTP、2mM dGTP、2mM TTP各200μl，和200μl水。
第1步，反應混合物組成為10μl 10×PCR緩沖液，50μl 2×核苷酸溶液，5μl引物A，5μl引物B，1μl pCiP(0.05μg/μl)，30μl水，0.5μl Taq聚合酶，和80μl石蠟，反應在94℃2分鐘進行1個循環，94℃1分鐘、50℃1分鐘和72℃2分鐘15個循環，94℃1分鐘、50℃1分鐘、72℃3分鐘15個循環，及72℃5分鐘1個循環。
在瓊脂糖凝膠上純化10μl PCR產物，重溶于10μl水中。然后進行第2步。反應混合物組成為10μl 10×PCR緩沖液，50μl 2X核苷酸溶液，5μl第1步純化產物，1μl pCiP(0.05μg/μl)，30μl水，0.5μlTaq聚合酶，和80μl石蠟，反應在94℃5分鐘、50℃2分鐘和72℃10分鐘進行一個循環。
向第2步反應混合物中加入1μl引物C和1μl引物D。按上述第1步進行PCR反應。
3.分離突變的限制性片段用瓊脂糖凝膠分離第3步的產物，重新溶于20μl水中。在補有牛血清白蛋白(BSA)的NEBuffer2(New England Biolabs)中用限制性酶XbaI和KpnI以總體積20μl 37℃酶切過夜。用瓊脂糖凝膠分離570bp XbaI/KpnI片段。4.與表達載體pCiP連接表達質粒pCiP在上文所示條件下用XbaI和KpnI酶切，用瓊脂糖凝膠分離該大片段。將以上分離的突變片段連接到該載體上，連接混合物用于轉化大腸桿菌。通過用限制酶酶切來自一轉化子的質粒制備物證實了所述片段的存在和方向。用Sanger的二脫氧鏈終止方法在此雙鏈質粒上進行序列分析。除改變的密碼子外，生成的質粒與pCiP相同。
實施例2構建表達其他鬼傘過氧化物酶變體的質粒用實施例1中所述相同方法構建了下列突變，只是使用別的消化PCR產物的限制酶和用于再克隆突變片段的載體。用于這種改造的突變和引物如下突變 引物A序列K48S 5′-CCT GTT CGA TCG ATT CTT AGA-3′V53K 5′-CTT AGA ATT AAA TTC CAT GAC-3′G72Q 5′-GAT GGA GCC ATC GGC GCC TCC TTG ACC GAA TTG ACC-3′A91C 5′-GCC TTC CCG TGC AAT GGC GGC-3′N92K 5′-TTC CCG GCT AAA GGA GGC CTC-3′H109K 5′-GGT ATT AAT AAA GGT GTC TCT-3′Q118E 5′-GAT CTC ATC GAA TTC GCC ACT-3′M125G 5′-GCC GTC GGC GGG TCC AAC TGC-3′M125A 5′-GCC GTC GGC GCC TCC AAC TGC-3′S147Q 5′-ACC GGG GAT CAA GCT TGG AGG TTG GGG TTG GGA ACT-3′I152C 5′-CCT TCG TTG TGT CCC GGG CCC-3′P155C 5′-G ATC CCC GGG TGC GGA AAC ACT-3′M166G 5′-TTG GAT CGT GGG GGC GAT GCA-3′N192K 5′-GAG GGT TTA AAA TCG GCC ATC-3′I195K 5′-G AAC TCG GCC AAA TTC AGG TCT-3′V206R 5′-CTG GGT ATC GAA GCG CTG AGG GGT CGA-3′K218R 5′-CTG AGT GGT GCC TCG GAG CAA GGT CTC-3′E214L 5′-TCT ACA TTT TAA CCT TGC TC-3′F229G 5′-GAG CTC CTC GGC GCC GCC GAG AGA AGG-3′A230C 5′-CTC GGC TTT TGC GAG GAA CTC-3′E239G 5′-TTC CCT GGC GGC TTC CGC ATG-3′E239H 5′-TTC CCT GGC CAC TTC CGC ATG-3′E239K 5′-TTC CCT GGC AAA TTC CGC ATG-3′E239L 5′-TTC CCT GGC CTA TTC CGC ATG-3′E239M 5′-TTC CCT GGC ATG TTC CGC ATG-3′E239Q 5′-TTC CCT GGC CAA TTC CGC ATG-3′E239S 5′-TTC CCT GGC TCA TTC CGC ATG-3′E239T 5′-TTC CCT GGC ACA TTC CGC ATG-3′E239W 5′-TTC CCT GGC TGG TTC CGC ATG-3′
E239R5′-TTC CCT GGC CGA TTC CGC ATG-3′M242G5′-GAA TCC CGC GGG AGG TCC GAT-3′S244C5′-T CGC ATG AGG TGC GAT GCT CTC-3′S252P5′-CG GCA GGC GGT CCG CGG GTC GCG AGC-3′W258F5′-GCA TGC CGA TTT CAA TCC AT-3′W258H5′-GCA TGC CGA CAT CAA TCC AT-3′M261F5′-TGG CAA TCC TTT ACT AGT AGC-3′M261G5′-TGG CAA TCC GGG ACC AGC AGC-3′M261Y5′-TGG CAA TCC TAT ACC AGC AGC-3′M261V5′-TGG CAA TCC GTC ACC AGC AGC-3′M268L5′-AAT GAA GTC CTA GGC CAG CGA-3′M268G5′-AAT GAA GTT GGG GGC CAG CGA-3′M268A5′-AAT GAA GTT GCA GGC CAG CGA-3′M268F5′-AAT GAA GTT TTT GGC CAG CGA-3′Y272F5′-GGG CCA GCG CTT TCG CGC CGC C-3′Y272G5′-GGC CAG CGA GGG CGC GCC GCC-3′Y272A5′-GGC CAG CGA GCC CGC GCC GCC-3′M276S5′-CGC GCC GCC TTT GCC AAG ATG-3′M276I5′-CGC GCC GCC ATA GCC AAG ATG-3′M276H5′-CGC GCC GCC CAC GCC AAG ATG-3′K278R5′-AG AAC AGA CAT GCG CGC CAT GGC GGC-3′M279G5′-ATG GCC AAG GGG TCT GTT CTC-3′M279A5′-ATG GCC AAG GCC TCT GTT CTC-3′A304E5′-AT AAC AGG CGC CTC GTT GGA CAC-3′V314P5′-GGC CTT ACT CCC GAT GAT ATC-3′K41R＋K48R 5′-AAT TCT AAG AAT TCG GCG AAC AGG GCT CTCACA TCG GGA CCC TTG-3′G167N＋V176L 5′-AAG CAA GTC AAC GAG CTC ATC AGG GCT GAAGCC TGC ATC GTT CAT ACG ATC CAA-3′R241E＋E239K 5′-TTC CCT GGC AAG TTC GAA ATG AGG TCC-3′。
應注意1-29位的變體是用BamHI和XbaI在補有BSA的NEBuffer3(New England Biolabs)中酶切，生成160bp的片段。30-219位變體是用Xba/KpnI在補有BSA的NEBuffer2中酶切，生成570bp的片段。220-277位變體是用KpnI/MscI在補有BSA的NEBuffer2中酶切，生成170bp的片段。278-363位變體是用MscI/XhoI在補有BSA的NEBuffer2中酶切，生成420bp的片段。
實施例3在米曲霉中表達鬼傘過氫化物酶變體轉化米曲霉或黑曲霉(一般方法)在100ml YPD培養基(Sherman等Methods in Yeast Genet-ics，Cold Spring Harbor Laboratory，1981)中接種米曲霉或黑曲霉的孢子，37℃搖瓶培養過夜。通過無紡布(mira-cloth)過濾收集菌絲體，用200ml 0.6M MgSO4沖洗。將菌絲體懸浮在15ml 1.2MMgSO4，10m M NaH2PO4，pH5.8中。在冰上冷卻懸液，加入1ml含120mg Novozym_234(批號1687)的緩沖液。5分鐘后加入1ml 12mg/ml BSA(Sigrna type H25)，輕輕攪動下37℃繼續孵育1.5-2.5小時，直到在顯微鏡下檢查在樣品中可見大量的原生質體。
用無紡布過濾懸液，將濾液轉移到無菌管中，有5ml 0.5M山梨醇，100mM Tris-HCl，pH＝7.0覆蓋。以100×g離心15分鐘，在MgSO4層頂部收集原生質體。向原生質體懸液中加入2體積STC(1.2M山梨醇、10mM Tris-HCl，pH＝7.5，10mM CaCl2)，在1000×g離心該混合物5分鐘。將原生質體層重懸于3ml STC中再次離心。重復這一操作。最后將原生質體重懸于0.2-1ml STC中。
將100μl原生質體懸液與10μl STC中的5-25μg適當DNA混合。將來自米曲霉菌株A1560(IFO4177)的原生質體與pToC186(一種帶有構巢曲霉amds基因的質粒)混合。將混合物在室溫下放置25分鐘。加入0.2ml 60％PEG 4000(BDH29576)，10mM CaCl2和10mM Tris-HCl，pH＝7.5，小心混合(兩次)，最后加入0.85ml相同溶液并小心混合。混合物在室溫下放置25分鐘，于2500xg離心15分鐘，沉淀重懸于2ml 1.2M山梨醇中。再次沉降后，將原生質體鋪在適當的培養板上。將來自pToC186轉化的A1560菌株的原生質體輔在含1.0M蔗糖(pH＝7.0)。10mM乙酰胺作為氮源和用于抑制背景生長的20mM CsCl的基本培養板上(Cove Biochem.Bio-phys.Acta113(1966)51-56)。37℃孵育4-7天后挑出孢子，懸浮在無菌水中并鋪板以形成單個菌落。重復這一步驟，第二次分離后將單一菌落的孢子作為所述轉化子儲存。
在米曲霉菌株中產生重組灰蓋鬼傘過氧化物酶變體。
將在過氧化物酶基因中合適當突變的質粒通過與含構巢曲霉amds基因的pToC186共轉化而轉化至米曲霉A1560中，如上所述用等量pCiP和pToC186(各約5μg)的混合物進行轉化。再分離兩次能夠利用乙酰胺作為其唯一氮源的轉化子。在YPD培養基上(Sherman等，1981)生長3天后，分析培養物上清液的過氧化物酶活性(PODU)。
實施例4
過氧化氫穩定性在H2O2存在下測試野生型重組灰蓋鬼傘過氧化物酶(rCiP)和如上所述方法制備的E239K、Y272F、M276S、M242I＋Y272F＋E239K變體的穩定性。
按如下方法純化待測變體樣品通過Propex布吸濾使5升培養液澄清。輕輕攪拌下向3.5升培養液中加入1378g硫酸銨(終濃度為2.5M)。于5℃靜置16小時。于2500xg 5℃離心5分鐘收集沉淀。將沉淀再溶于CaCl2溶液(5mM)中，終體積為200ml。將30ml該溶液對5升12.5mM Bis-tris pH6.0緩沖液透析4小時，再對5升透析16小時。終體積為68ml。
將23ml透析液上樣于Q-Sepharose HP柱(Pharmacia，26mmφ，100mm床高)上。.用12.5mM Bis-tris pH6.0緩沖液平衡柱。400ml起始緩沖液通過該柱，然后進行0.25M NaCl在12.5mMBis-tris pH6.0緩沖液中的線性梯度洗脫。總梯度體積為540ml。每10ml一份收集。在0.16M NaCl時過氧化物酶在20ml中洗下。將4ml上樣于一Sephadex G25 SF(16mmφ400mm)柱上，在0.1M磷酸鈉pH7中以4ml/分流速裝柱。每2ml一份進行收集。過氧化物酶被洗脫在6ml中。
過氧化物酶穩定性的測試條件酶 25nM過氧化氫 0.2mM溫度 30℃pH 10.5碳酸鹽緩沖液 20mM
試劑22mM pH10.5碳酸鹽緩沖液將1.807g Na2CO3和0.416gNaHCO3溶于去離子水中達終體積1升。檢查pH值。
H2O22.2mM過氧化物酶溶液從Sephedex G25 SF得到的合并流份用22mM pH10.5碳酸鹽緩沖液稀釋至OD404＝0.0030。(這相當于27.5nM)。
操作將碳酸鹽緩沖液預熱至30℃。制備過氧化物酶溶液。立即取過氧化物酶溶液樣品，稀釋并進行ABTS分析。將5ml過氧化物酶溶液與0.5nml 2.2mM H2O2混合，將混合物置于30℃水浴中。4、8、12和16分鐘后，取樣、稀釋并進行ABTS分析。將殘余活性與一級衰變匹配，并計算半衰期。
過氧化氫穩定性試驗的結果列于下表1中。
表1
<p>序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱Novo Nordisk A/S，NN(B)街道Navo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國家丹麥(F)郵政編碼(ZIP)DK-2880(G)電話+4544448888(H)傳真+4544490555(I)電傳37173(ii)發明名稱過氧化物酶變體2(iii)序列數1(iv)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(v)本申請資料申請號(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度343個氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(vi)原始原源(A)生物體灰蓋鬼傘(B)菌株IFO8371(xi)序列描述SEQ ID NOlGln Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Cys Pro Gly Gly Gln Ser1 5 10 15Thr Ser Asn Ser Gln Cys Cys Val Trp Phe Asp Val Leu Asp Asp Leu20 25 30Gln Thr Asn Phe Tyr Gln Gly Ser Lys Cys Glu Ser Pro Val Arg Lys35 40 45Ile Leu Arg Ile Val Phe His Asp Ala Ile Gly Phe Ser Pro Ala Leu50 55 60Thr Ala Ala Gly Gln Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Gly Ser Ile Ile65 70 75 80Ala His Ser Asn Ile Glu Leu Ala Phe Pro Ala Asn Gly Gly Leu Thr85 90 95Asp Thr Val Glu Ala Leu Arg Ala Val Gly Ile Asn His Gly Val Ser100 105 110Phe Gly Asp Leu Ile Gln Phe Ala Thr Ala Val Gly Met Ser Asn Cys115 120 125Pro Gly Ser Pro Arg Leu Glu Phe Leu Thr Gly Arg Ser Asn Ser Ser130 135 140Gln Pro Ser Pro Pro Ser Leu Ile Pro Gly Pro Gly Asn Thr Val Thr145 150 155 160Ala Ile Leu Asp Arg Met Gly Asp Ala Gly Phe Ser Pro Asp Glu ValVal Asp Leu Leu Ala Ala His Ser Leu Ala Ser Gln Glu Gly Leu Asn180 185 190Ser Ala Ile Phe Arg Ser Pro Leu Asp Ser Thr Pro Gln Val Phe Asp195 200 205Thr Gln Phe Tyr Ile Glu Thr Leu Leu Lys Gly Thr Thr Gln Pro Gly210 215 220Pro Ser Leu Gly phe Ala Glu Glu Leu Ser Pro Phe Pro Gly Glu Phe225 230 235 240Arg Met Arg Ser Asp Ala Ieu Leu Ala Arg Asp Ser Arg Thr Ala Cys245 250 255Arg Trp Gln Ser Met Thr Ser Ser Asn Glu Val Met Gly Gln Arg Tyr260 265 270Arg Ala Ala Met Ala Lys Met Ser Val Leu Gly Phe Asp Arg Asn Ala275 280 285Leu Thr Asp Cys Ser Asp Val Ile Pro Ser Ala Val Ser Asn Asn Ala290 295 300Ala Pro Val Ile Pro Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp Ile Glu Val Ser305 310 315 320Cys Pro Ser Glu Pro Phe Pro Glu Ile Ala Thr Ala Ser Gly Pro Leu325 330 335Pro Ser Leu Ala Pro Ala Pro340
權利要求
1.一種在堿性條件下提高了對過氧化氫穩定性的過氧化物酶變體，其特征在于在SEQ ID No1中所示氨基酸序列編碼的灰蓋鬼傘過氧化物酶這一親本過氧化物酶的48-56，76，109，214，239，258-262，264，266-272氨基酸殘基區中插入、缺失或取代一個或多個氨基酸殘基。
2.根據權利要求1的過氧化物酶變體，其中按如下取代一個或多個氨基酸殘基K48S，V53K，AH109K，E214L，E239A，V，L，I，P，F，W，M，G，S，T，C，Y，N，Q，D，K，R，H，特別是 E239K，G，S，L，Q，M，W258F，H，M261A，V，L，I，P，F，W，G，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，H，特別是 M261F，V，I，L，Q，M268A，V，L，I，P，F，W，G，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，H，特別是 M268F，V，I，L，Q，Y272A，V，L，I，P，F，W，G，S，T，C，M，N，Q，D，E，K，R，H，特別是 Y272F。
3.一種在堿性條件下提高了對過氧化氫穩定性的過氧化物酶變體，其中SEQ ID No1中所示氨基酸序列編碼的灰蓋鬼傘過氧化物酶這一親本過氧化作酶的一個或多個氨基酸殘基被取代如下G72Q，A91C，N92K，Q118E，M125A，P，W，G，S，T，C，Y，N，D，E，K，R，H，特別是 M125S，T，S147Q，I152C，P155C，M166A，P，W，G，S，T，C，Y，N，D，E，K，R，H，特別是 M166S，T，N192K，I195K，V206R，K218R，F229G，A230C，M242A，P，W，G，S，T，C，Y，N，D，E，K，R，H，特別是 M242S，T，S244C，S252P，M276A，P，W，G，S，T，C，Y，N，D，E，K，R，H，特別是 M276S，T，K278R，M279A，P，W，G，S，T，C，Y，N，D，E，K，R，H，特別是 M279S，T，A304E，V314P，K41R＋K48R，V53K＋Q118E，V53A＋E239G，I152C＋A91C，P155C＋A230C，M166F＋E239K，G167N＋V176L，E214L＋E239L，R241E＋E239K，S244C＋P155C，E239K＋M242I＋Y272F，M166F＋E239K＋M242I＋Y272F，M125L＋M166F＋E239K＋M242I＋Y272F。
4.一種過氧化物酶變體，它是權利要求1-3的任一項過氧化物酶變體的片段。
5.一種漂白組合物，其含有權利要求1-4任一項的過氧化酶變體和過氧化氫或過氧化氫前體，如過硼酸鹽或過碳酸鹽，或產生過氧化氫的酶系統，如氧化酶或和其底物，或過氧羧酸或其鹽。
6.根據權利要求5的漂白組合物，其中過氧化物酶變體的量相當于洗滌液中濃度為0.01到20PODU/ml，過氧化氫或過氧化氫前體或產生過氧化氫的酶系統或過氧羧酸或其鹽的量相當于洗滌液中過氧化氫的濃度最高為20mM H2O2。
7.根據權利要求5或6的漂白組合物，其另外含有可氧化底物如有機化合物，如酚類化合物或吩噻嗪的衍生物或吩噁嗪的衍生物。
8.根據權利要求7的漂白組合物，其中可氧化底物的量相當于洗滌液中濃度為0.1μM到100μM。
9.一種洗滌劑組合物，其包含表面活性劑、權利要求1-4中任一項的過氧化物酶變體和過氧化氫或過氧化氫前體，如過硼酸鹽或過碳酸鹽，或產生過氧化氫的酶系統，如氧化酶和其底物，或過氧羧酸或其鹽。
10.根據權利要求9的洗滌劑組合物，其中過氧化物酶變體的量相當于洗滌液中濃度為0.01-20PODU/ml過氧化氫或過氧化氫前體或產生過氧化氫的酶系統或過氧羧酸或其鹽的量相當于洗滌液中過氧化氫的濃度為最高20mM H2O2。
11.根據權利要求9或10的洗滌劑組合物，其另外含有可氧化底物如有機化合物，如酚類化合物，或吩噻嗪的衍生物或吩噁嗪的衍生物。
12.根據權利要求11的洗滌劑組合物，其中可氧化底物的量相當于洗滌液中濃度為0.1μM到100μM。
全文摘要
本發明涉及顯示極佳過氧化氫穩定性的灰蓋鬼傘過氧化物酶新變體。
文檔編號C11D3/39GK1133062SQ9419374
公開日1996年10月9日 申請日期1994年10月13日 優先權日1993年10月13日
發明者A·H·佩德森, J·文德, A·斯文德森, J·R·徹里, M·拉姆薩, P·施奈德, B·R·詹森 申請人:諾沃挪第克公司