高靈敏單線態氧磷光探針的制備及其應用的制作方法
本發明涉及溶液中單線態氧(1O2)的測定，具體地說是一類含有蒽環衍生物配體的一種雙核釕金屬配合物單線態氧磷光探針的制備及其應用。
背景技術：
單線態氧是氧分子處于高能激發態的一種不穩定的存在形式，單線態氧作為有機化學中一種珍貴試劑，在許多光化學和光生物反應，如光降解、污染物的光轉化、化學發光、生物體氧化老化、甚至是光致癌作用等過程中，都扮演著十分重要的角色。在有機合成中，單線態氧使得在高度立體專一的有機化合物中引入氧變得極為容易。在生物體系中，單線態氧對生命體系有著重大的影響，單線態的生理學氧化作用越來越受到研究者的關注。單線態氧在細胞損傷和凋亡中起著重要的作用，它可能造成對機體的強氧化性損傷，從而引起機體脂質過氧化作用的發生，導致生物膜、小動脈、DNA、蛋白質和中樞神經系統的損傷，加快機體的衰老和死亡,因此被認為是體內重要的毒性物種,引發與氧化損傷有關的疾病，如白內障、肺水腫、糖尿病、肌肉萎縮、營養缺乏、精神病和腫瘤萌生等[(a)K.Briviba,L.O.Klotz,H.Sies,Toxic and signaling effects of photochemically or chemically generated singlet oxygen in biological systems,Biol.Chem.,1997,378,1259.b)J.R.Wagner,P.A.Motchnik,R.Stocker,H.Sies,B.N.Ames,The oxidation of blood plasma and low density lipoprotein components by chemically generated singlet oxygen,J.Biol.Chem.,1993,268,18502.]。單線態氧在細胞的增生、分化、凋亡等調控中也起重要作用，被認為是一種新的第二信使[(a)R.W.Redmond,I.E.Kochevar,Spatially resolved cellular responses to singlet oxygen,Photochem.Photobiol.,2006,82(5),1178-1186.(b)N.L.Oleinick,R.L.Morris,I.Belichenko,The role of apoptosis in response to photodynamic therapy:what,where,why,and how,Photochem.Photobiol.Sci.,2002,1,1–21.]。相反，人們也可以利用單線態氧的強氧化性質去殺死惡性腫瘤細胞或組織，達到治愈癌癥的目的。實驗發現，當惡性腫瘤細胞獲取并結合單線態氧敏化劑藥物的能力顯著大于正常組織時，通 過光照后，藥物分子產生的單線態氧就能選擇性地殺死腫瘤細胞。醫學上用亞甲基藍光敏法產生的單線態氧來對血漿消毒和腫瘤的光動力學診斷，這種光動力學治療技術在腫瘤的診斷和治療中具有廣泛的應用前景。單線態氧與人類健康和疾病密切相關，是當前生命科學和化學科學交叉研究的熱點。
由于單線態氧在光化學和光生物過程中具有如此重要的地位，1O2檢測倍受關注，特別是生物體系中1O2的檢測越來越引起科研工作者的關注。研發高靈敏度和選擇性好的單線態氧的小分子熒光探針具有重要意義，它能實時地給出單線態氧靶向細胞體系內生物大分子的重要空間分布信息，能夠適時準確地檢測體內單線態氧的含量,對于某些疾病的預防、診斷以及病理的研究都有十分重要的指導意義[K.Tanaka,T.Miura,N.Umezawa,Y.Urano,K.Kikuchi,T.Higuchi,T.Nagano,Rational design of fluorescein-based fluorescence probes,Mechanism-based design of a maximum fluorescence probe for singlet oxygen,J.Am.Chem.Soc.,2001,123(11),2530.]。目前已報道的用于檢測單線態氧的方法主要有以下幾種：(1)磷光光度法，檢測單線態氧的標準方法，利用單線態氧自身淬滅在1268nm處產生的近紅外磷光進行檢測，此法對生物體無侵害，選擇性高，但靈敏度低、檢出信號弱、無法用于很低濃度1O2的檢測[K.Andersen,Z.Cao,P.R.Ogilby,L.Poulsen,I.Zebger,J.Phys.Chem.A.2002,106,8488.]。(2)化學捕獲吸光光度法，利用9,10-二苯基蒽(DPA)與1O2的特征性反應生成穩定的內過氧化物引起DPA吸收光譜的變化，通過檢測DPA吸收光譜的變化來測量1O2，此法選擇性好，靈敏度雖比1268nm磷光探測高得多[M.J.Steinbeck,A.U.Khan,M.J.Karnovsky,Extracellular production of singlet oxygen by stimulated macrophages quantified using 9,10-diphenylanthracene and perylene in a polystyrene film,J.Biol.Chem.,1993,268(21),15649.]，但此法是基于吸收光譜，所以靈敏度仍然較低。(3)有機熒光探針法，利用熒光信號為檢出手段的有機熒光探針法包括兩類：(a)利用1O2與帶有蒽環的熒光素類探針分子專一性反應，使得探針由原來的非熒光性分子變為強熒光性分子，從而用于1O2的檢測(N.Umezawa,K.Tanaka,Y.Urano,K.Kikuchi,T.Higuchi,T.Nagano,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1999,38,2899；K.Tanaka,T.Miura,N.Umezawa,Y.Urano,K.Kikuchi,T.Higuchi,T.Nagano,J.Am.Chem.Soc.2001,123,2530.)。該方法檢測時間短，靈敏度高， 但不適用于低pH值環境和實時檢測。(b)利用熒光探針分子間的能量傳遞，激發探針分子發出強的遲滯熒光，進而用于檢測1O2(A.A.Krasnovskii,C.Schweitzer,H.Leismann,C.Tanielian,E.A.Luk’yanets,Quantum Electron.,2000,30,445；A.A.Krasnovskii,M.E.Bashtanov,N.N.Drozdova,O.A.Yuzhakova,E.A.Luk’yanets,Quantum Electron.,2002,32,83.)。這類探針主要有酞菁染料和紫菜嗪衍生物等，當接收到單線態氧的能量后能在700nm附近發出熒光用于檢測。(4)化學發光探針法，這是一類基于光誘導電子轉移機理的單線態氧熒光探針(X.H.Li,G.X.Zhang,H.M.Ma,D.Q.Zhang,J.Li,D.B.Zhu,J.Am.Chem.Soc.2004,126,11543.)，這類探針檢測速度快且具有很高的靈敏度和很好的選擇性，但水溶性差，不利于生物體系1O2的測定。(5)稀土熒光探針，袁景利小組基于稀土熒光配合物的長壽命熒光特征，制備了一系列稀土熒光探針，利用時間分辨熒光檢測技術測定單線態氧已取得較好的效果(袁景利，宋波，王桂蘭，譚明乾，一種基于銪配合物的單線態氧熒光探針及其應用，中國發明專利，申請號200510130851.9；袁景利，宋波，王桂蘭，一種單線態氧銪配合物熒光探針及其應用，中國發明專利，申請號：200510045768.1；袁景利，宋波，王桂蘭，一種鋱配合物單線態氧熒光探針及其應用，中國發明專利，申請號200510045767.7)，這類配合物的激發波長處于紫外區，測定1O2時，對生物體系有損傷(B.Song.G.L.Wang.M.Q.Tan.J.L.Yuan.New J.Chem.2005,29,1431.)。最近報道了一個錸(I)配合物的單線態氧磷光探針(Y.J.Liu,K.Z.Wang，Eur.J.Inorg.Chem.,2008,5214.)，并申請了系列專利公開了一系列釕或銥配合物的單線態氧磷光探針(高水溶性釕金屬配合物單線態氧熒光探針及其制備和應用，專利號：ZL 2011 1 0204287.6；Hdppz配體的釕配合物作為單線態氧熒光探針的應用”，專利號：ZL2011101593710；釕和銥金屬配合物單線態氧熒光探針的制備及其應用，專利號：ZL 2008 1 0240591.4.),最近也有其他研究組報道釕配合物單線態氧的磷光探針(Z.Q.Ye,B.Song,Y.J.Yin,R.Zhang,J.L.Yuan,Development of singlet oxygen-responsive phosphorescent ruthenium(II)complexes,Dalton Trans.2013,4214380.)。但這些探針的靈敏度仍需改進。
技術實現要素：
本發明的目的是開發可見光激發，靈敏度高的新型1O2熒光探針。
本發明的技術方案如下：
一種含有蒽環衍生物配體的釕雙核配合物，其結構式為[Ru(L2)2(H2L1)Ru(L2)2]Xk，其中X為抗衡陰離子，X為負一價離子時，k＝4；X為負二價離子時，k＝2。L＝bpy或phen等氮雜雙齒配體；bpy、phen和H2L1其結構式分別如下式所示：
上述抗衡陰離子多為負一價的離子，例如Cl-、ClO4-、PF6-、NO3-、CF3SO3-、BF4-。
本發明的配合物的具體例子例如：
配合物[Ru(bpy)2(H2L1)Ru(bpy)2]Cl4的結構如下式所示：
上述配合物[Ru(bpy)2(H2L1)Ru(bpy)2]Cl4可通過下述方法制備得到的：
先由文獻方法合成的9,10-蒽二醛(Ryu,D.；Park,E.；Kim,D.S.；Yan,S.H.；Lee,J.Y.；Chang,B.Y.；Ahn,K.H.,J.Am.Chem.Soc.,2008,130,2394；Kim,H.S.；Moon,H.S.；Jang,D.O.,Superamol.Chem.,2006,18,97；Klanderman,B.H.,J.Org.Chem.,1966,31,2618.)和1,10-鄰菲啰啉-5,6-二酮在乙酸銨/乙酸存在下縮合合成關鍵配體H2L1；然后H2L1與Ru(bpy)2Cl22H2O在乙二醇中反應后，經Al2O3柱色譜提純。
本發明的以過渡金屬釕或銥為中心離子，以蒽環衍生物為配體的配合物具有單線態氧熒光探針的性能，適用于中性和堿性體系中1O2的定性和/或定量測定。
該配合物的單線態氧熒光探針的應用過程為：在中性或堿性溶液中，利用所述的配合物作為熒光探針捕獲體系中的1O2并與單線態氧作用生成所述配合物的內過氧化物，體系的熒光強度顯著增強，通過可見光激發的熒光測定法可以檢測體系中的1O2。具體步驟是：
1.在已知的能有效的產生單線態氧的中性或堿性體系中加入本發明的配合物，在一系列的單線態氧濃度條件下，通過可見光激發測定體系的熒光強度和吸光度，得到相對應的熒光量子效率，獲得熒光量子效率相對于單線態氧濃度的標準曲線；
2.在含所述配合物的中性或堿性緩沖溶液中加入一定量的待測溶液，通過可見光激發測定體系的熒光強度和吸光度，計算得到其熒光量子效率；
3.以步驟2測得的熒光強度的對數值為縱坐標，以單線態氧的對數濃度做橫坐標作圖，線性部分即為測定單線態氧濃度的標準曲線。
本發明公開的單線態氧磷光探針可見光激發，且與單線態氧反應后生成其內過氧化物熒光強度增強幅度大的單線態氧熒光探針。本發明的探針具有如下優點：
1.適用于中性和堿性體系中1O2的測定。
2.具有較高的單線態氧檢測靈敏度，最低檢測為3.12-2.7nM。
3.具有較好的選擇性，其它活性氧物種(H2O2,·OH，ONOO-)引起體系熒光信號增強的幅度很小。
附圖說明
圖1示意了在中性和堿性體系中單線態氧對配合物[Ru(bpy)2(H2L1)Ru(bpy)2]Cl4(5μM)吸收光譜的影響，其中：(a)是在pH＝7.0的50mM磷酸鹽緩沖溶液中的吸收光譜的變化；(b)是在pH＝9.95的0.1M碳酸鹽緩沖溶液中的吸收光譜的變化。圖1(a)和(b)的插圖分別示意了在中性和堿性體系中的配合物[Ru(bpy)2(H2L1)Ru(bpy)2]Cl4(5μM)的熒光強度與體系中單線態氧濃度之間的關系。
圖2示意了在中性和堿性體系中單線態氧對配合物[Ru(bpy)2(H2L1)Ru(bpy)2]Cl4(5μM)發光光譜的影響，其中：(a)是在pH＝7.0的50mM磷酸鹽緩沖溶液中的熒光光譜的變化；(b)是在pH＝9.95的0.1M碳酸鹽緩沖溶液中的熒光光譜的變化。圖2(a)和(b)的插圖分別示意了在中性和堿性體系中的配合物[Ru(bpy)2(H2L1)Ru(bpy)2]Cl4(5μM)的熒光強度與體系中單線態氧濃度之間的關系。
圖3示意了在中性和堿性體系中的配合物[Ru(bpy)2(H2L1)Ru(bpy)2]Cl4(5μM)的熒光量子效率與單線態氧濃度之間的關系，其中：(a)是在pH＝7.0的50mM磷酸鹽緩沖溶液中；(b)是在pH＝9.95的0.1M碳酸鹽緩沖溶液中。
圖4示意了中性和堿性體系中配合物[Ru(bpy)2(H2L1)Ru(bpy)2]Cl4(1.67μM)與活性氧物種([ROS]＝0.53μM)的作用，其中：(a)是在pH＝7.0的50mM磷酸鹽緩沖溶液中；(b)是在pH＝9.95的0.1M碳酸鹽緩沖溶液中。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明進一步說明。
實施例一、配體H2L1的合成：
78mg(0.33mmol)9，10-蒽二醛和140mg(0.66mmol)1,10-鄰菲咯啉-5,6-二酮和500mg(0.33mmol)醋酸銨溶于20ml醋酸中，N2保護下回流6h。反應后將溶液加入冰水中，放置一夜，出現大量黃色沉淀。抽濾，干燥。甲醇洗，干燥。所得粗產品溶解度非常差，不易提純。
實施例二、[Ru(bpy)2(H2L1)Ru(bpy)2]Cl4的合成：
H2L1(0.0307g,0.05mmol)、Ru(bpy)2Cl2·2H2O(0.0520g,0.1mmol)于10ml乙二醇中，氮氣保護下140℃攪拌反應12小時，反應溶液由最初的紫色變成深紅色，冷卻。將乙二醇旋出，產物用固體CH2Cl2/CH3OH(體積比20/1)溶解，用中性Al2O3(200-300目)柱層析分離,洗提劑為體積比20～50/1CH2Cl2/CH3OH，收集主要的紅色帶，旋蒸除去溶劑。將所得固體用乙腈/乙醚擴散重結晶，得紅色固體0.045g，產率56.9％。基質輔助激光解析電離飛行時間質譜：m/z＝360.9([M－4Cl －]+)，M＝C80H54N16Cl4Ru2，計算值：360.0([M－4Cl－]+)。氫核磁共振譜(δH，ppm， 400MHz，DMSO-d6)：9.20(d，J＝7.36Hz，2H)，9.03(d，J＝6.88Hz，2H)，8.91(d，J1＝8.34Hz，J2＝11.98Hz，8H)，8.25(t，J＝7.96Hz，4H)，8.16(m，8H)，7.97(s，8H)，7.91(d，J＝5.40Hz，4H)，7.72(d，J＝5.48Hz，4H)，7.64(m，8H)，7.43(s，4H)。紅外光譜(KBr，cm-1)：3422br,1596w,1461w,1443w,1384s,1353s,767m，726w。元素分析[C80H54N16Cl4Ru2·4CH3CN·18.5H2O(F.W.＝2079.46)]計算值：C，50.79；H，4.99；N，13.46％；實測值：C，50.39；H，4.23；N，14.05％。
實施例三 單線態氧傳感性質和測定
以[Ru(bpy)2(H2L1)Ru(bpy)2]Cl4為例，介紹本發明配合物作為熒光探針在中性和堿性溶液中檢測單線態氧的方法和檢測性能。
中性體系中1O2的測定：首先在含有10mM NaOCl的pH＝7.0的磷酸鹽緩沖溶液中加入配合物，然后在該體系中加入H2O2，H2O2/NaOCl體系在中性溶液中單線態氧產率幾乎是100％(A.M.Held,D.J.Halko,J.K.Hurst,J.Am.Chem.Soc.1978,100,5732–5740.)。隨著H2O2的加入，體系中不斷產生1O2，所產生的1O2與配合物作用，配合物中的蒽環在350nm-400nm之間的吸收不斷降低，證明蒽環是與1O2反應的活性基團，同時體系熒光強度逐漸增強。
堿性體系中1O2的測定：在含有10mM Na2MoO4的pH＝9-11的碳酸鹽緩沖溶液中加入配合物，然后在體系中加入H2O2，H2O2/Na2MoO4體系在堿性溶液中能有效的產生單線態氧(K.Tanaka,T.Miura,N.Umezawa,Y.Urano,K.Kikuchi,T.Higuchi,T.Nagano,J.Am.Chem.Soc.,2001,123,2530-2536；M.Q.Tan,B.Song,G.L.Wang,J.L.Yuan,Free Radic.Biol.Med.,2006,40,1644–1653.)。隨著H2O2的加入，體系不斷產生1O2，所產生的1O2與配合物作用，配合物中的蒽環在350nm-400nm之間的吸收不斷降低，證明蒽環是與1O2反應的活性基團，同時體系熒光強度逐漸增強。
配合物在中性和堿性溶液中對單線態氧均有較好的檢測性能，參見圖1～圖2，中性條件下的單線態氧是由H2O2/NaClO體系在pH＝7.0的50mM磷酸鹽緩沖溶液產生的；堿性環境中單線態氧可由H2O2/Na2MoO4體系在pH＝9.95的0.1M的碳酸鹽緩沖溶液產生。測定用儀器為GBC Cintra 10e紫外-可見分光光度計和Cary Eclipse熒光分光光度計。在中性(堿性)緩沖溶液中加入H2O2體系即會產 生1O2，隨著1O2與配合物的作用，蒽環部分在350nm-400nm之間的吸收不斷降低，如圖1所示，證明蒽環是與1O2反應的活性基團。在未加入H2O2時體系幾乎沒有熒光發射，隨著1O2濃度的增加，在464nm光激發下體系在610nm處的熒光發射逐漸增強，如圖2所示(圖2中箭頭所指方向為1O2濃度增加的方向)，中性和堿性的溶液中有單線態氧和無單線態氧存在時熒光強度比分別達5.4和7.6，量子效率增加分別達到7.6和8.8。體系的熒光增強是由于配合物與1O2作用生成其內過氧化物從而影響熒光體的發射性質，改變了其發光性能從而發出較強的熒光。在464nm光激發下體系的在610nm處熒光發射強度與1O2濃度之間的關系如圖3所示，中性與堿性緩沖液中的發光強度的對數值對單線態氧濃度對數值作圖結果分別示于插圖中，模擬插圖中的線性部分分別得方程：lgI＝3.56+0.328lg[1O2](n＝15,r＝0.986)and lgI＝3.82+0.403lg[1O2](n＝15,r＝0.993)。將插圖中的直線部分作為標準曲線，可以以配合物為探針在中性和堿性條件下測定任一未知體系中的單線態氧濃度。
配合物與活性氧物種的作用實驗中，配合物與H2O2,·OH，ONOO-等活性氧物種作用時體系熒光強度變化很小，而配合物與1O2作用后體系的熒光大大增強，如圖4所示，這表明配合物對1O2具有很好的選擇性。在中性和堿性條件下對1O2的檢測最低濃度根據背景標準偏差的三倍計算分別為7.6nM和5.2nM，表明該配合物對1O2具有很高的靈敏度。
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