6)加入 AW2溶液700yl，12000g離屯、Imin，清洗2次；
[0050] 7)棄收集管廢液后，12000g離屯、2min去除殘留乙醇；
[0051 ] 8)用100μΙ buffer TE(預熱至65°C)洗脫獲得總RNA。
[0052] 2.3反轉錄獲得〇0臟
[0053] 采用TYanscriptor First Strand cDNA Synthesis kit(Roche 04897030001)進 行反轉錄。首先，在500ng的總RNA中加入50mM olig(dT)180.5yl和600mM Random Primer 1 μ1，并用DEPC水補足體積至6.化1。將該混合液至65°C加熱lOmin，然后立刻至于冰上2min。 再在反應體系中加入5x Transcriptor Reaction buffer 2μ1，1ηιΜ dNTP ΙμLΚ及Rnase inhibitor ?ου,Reverse Transcriptase 5U進行反轉錄。轉錄條件為25°C10min，55°C 40min，85°C5min。最后獲得cDNA于-20°C凍存備用。
[0054] 2.4PCR擴增和產物純化
[00財對Statla和Static的全長CDS擴增，采用高保真酶PrimeSTAR Max DM Polymerase(Takara R045A)進行擴增。反應體系中包含SXPrimeSTAR Max Premixl2.扣1， 上下游引物各lOpmol W及模板50ngAU的cDNA 0.化1，其余使用去離子水補足至25μ1 ePCR 反應條件:94°C預變性2min; 95°C30s，60°C30s，72°C3min運行45個循環，最后在72°C繼續延 伸lOmin獲得目的擴增產物。
[0056] PCR產物純化采用AxyPrep PCR clean-up kit(A巧gen AP-PCR-50)進行回收。根 據試劑盒的實驗手冊進行操作，具體實驗步驟如下：
[0057] 1)在PCR反應液中，加3倍體積的Buffer PCR-A;混勻后，轉移到制備管中，12000g 離屯、Imin，棄收集管濾液；
[005引 2)加700μ1 Buffer W2洗涂第一次，12000g離屯、Imin，棄收集管濾液；
[0059] 3)加500μ1 Buffer W2洗涂第二次，12000g離屯、Imin，棄收集管濾液；
[0060] 4)12000g離屯、Imin，去除殘留的洗涂液；
[0061] 5)制備管置于潔凈的1.5ml離屯、管，在制備管膜中央加30μ1去離子水(預熱至65 °0，室溫靜置1111^;
[0062] 6)12000g離屯、Imin洗脫獲得純化產物；
[0063] 7)使用naro化OP2000測定純化產物的濃度。
[0064] 2.5PCR純化產物和質粒載體雙酶切，割膠純化
[006引 采用Κρη Kinvitrogen 15232-010)和Sac iKinvi化ogen 15240-901)對PCR產 物和載體進行雙酶切。反應體系為lOx Buffer 6μ1，Κρη I和Sac II各祉1，模板(PCR產物或 質粒)祉g，再用去離子水補足至60μ1。然后置37°C酶切過夜。
[0066] 酶切后的產物采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen AP-GX-50G)進行割膠純 化。具體步驟如下：
[0067] 1)在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，并稱取凝膠重量，并將該重量換算 作為一個凝膠體積(如lmg =化1體積）；
[006引 2)加入3個凝膠體積的Buffer DE-A，混合均勻后于50°C加熱lOmin，間斷混合(每 2-3min)，直至凝膠塊完全烙化；
[0069] 3)加0.5倍Buffer DE-A體積的Buffer DE-B，混合均勻；
[0070] 4)將步驟C中的混合液加入到DNA制備管中，12000g離屯、Imin，棄濾液；
[0071] 5)加500μ1 Buffer Wl，12000g離屯、30s，棄濾液；
[0072] 6)加700μ1 Buffer W2，12000g離屯、30s，棄濾液；
[0073] 7)W同樣的方法再用700μ1 Buffer W2洗涂一次12000g離屯、Imin，棄廢液；
[0074] 8)12000g離屯、Imin，去除殘留的乙醇；
[0075] 9)將制備管置于潔凈的1.5ml離屯、管中，在制備膜中央加30μ1去離子水(預熱至65 °0，室溫靜置1111^;
[0076] 10)12000g離屯、Imin洗脫獲得純化的DNA;
[00八]11)使用Naro化OP2000測定純化產物的濃度。
[0078] 2.6雙酶切后的PCR和質粒純化產物連接
[0079] 酶切回收的PCR產物與載體大片段采用T4DNA連接酶（Invi化Ogenl5224-〇17)連 接，連接總體積20μ1，具體操作步驟如下：
[0080] 1)按照插入片段與載體大片段的摩爾比3:1，計算插入片段質量：
[0081 ]插入片段(ng)=插入片段的堿基數X載體大片段的質量(0. lyg) X 3/載體大片段 的堿基
[0082] 其中插入片段StaUa堿基數為2263bp，S化tl師咸基數為2149bp;
[0083] pcDNA4/T0/myc-His(B)酶切大片段為 507 化P。
[0084] 2)連接體系的配置(共20μ1) 裁體大尸!巧 化1 μΚ 插入片段 使用a)升算結果(摩爾比3: 1)
[0085] IQxLigalion 民caciion Buffer 2 口1 T4 DNA 連接酶(?υ/μ1) 1 μ1 dcilhO 午;20 μΙ
[0086] 3)混勻離屯、，室溫放置化。
[0087] 2.7連接產物的轉化
[0088] 采用感受態細胞D冊a(Tiangen CB101)進行轉化實驗，具體步驟如下：
[0089] 1)將感受態細胞D冊α從-80度取出至冰上解凍1 Omin;
[0090] 2)吸取2.6中連接產物化1加入10化1感受態細胞中，輕輕混勻后冰浴3〇111111;
[0091] 3)將冰浴后的感受態細胞離屯、管置42°C水浴加熱90s，期間不要搖動管；
[0092] 4)快速將離屯、管轉移到冰上，使細胞冷卻2min;
[0093] 5)每管加入800μ1 LB液體培養基(培養基事先加溫至37°C)，混勻后37°C，220巧m 振蕩培養45min;
[0094] 6)將適當體積(200ul/90mm平皿）已轉化的感受態細胞平鋪到含有氨節青霉素或 者卡那霉素的LB的瓊脂平板上，平板放置室溫下直至表面液體被吸收。
[0095] 其中pcDNA4/T0/my C-化S (B)質粒轉化的細菌接種LB-氨節青霉素平板，pEGFP-N質 粒轉化的細菌接種LB-卡那霉素平板；
[0096 ] 7)倒置平皿，于37°C培養箱中培養12~16h。
[0097] 2.8質粒的鑒定
[0098] 1)隨機挑取5個克隆，根據質粒抗性基因接種于5ml LB-氨節青霉素或者LB-卡那 霉素液體培養基中，37°C，220rpm振蕩過夜培養；
[0099] 2)采用小量質粒提取試劑盒(Tiangen DP103-02)提取重組質粒，步驟簡述如下：
[0100] a)將5ml菌液收集至離屯、管底部，盡量去除上清；
[0101] b)依次加入溶液P1、P2和P3,離屯、取上清；
[0102] C)將上清液加入收集管中央，吸附后離屯、；
[0103] d)用去蛋白液PD洗涂收集管1次，漂洗液PW洗涂2次；
[0104] e)高速離屯、2~3min，去除殘留的漂洗液；
[0105] f)使用50μ1去離子水(預熱至65°C)洗脫質粒DNA。
[0106] 3)重組質粒Κρη I/Sac II酶切，使用20μ1 體系包括lOx Buffer 2μ1，Κρη I和Sac II各2U，模板(PCR產物或質粒)2yg，再用去離子水補足至20μ1。水浴37°C，過夜。
[0107] 4)將酶切產物點樣于1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外照相；
[0108] 5)酶切鑒定的條帶數目及大小與預期相符的質粒送上海英驗生物技術有限公司 進行一代sanger測序。測序引物詳見表1;
[0109] 6)測序序列拼接使用Vector NTI Advance軟件，版本號11.5;
[0110] 7)使用 Genbank 數據庫中 blast 工具（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)，對插入片段 CDS 區序列和 Statla(NM_007315.3)或者 Statie(NM_139266.2)序 列進行al ignment，觀察是否存在堿基突變。
[0111] 2.9質粒的大量提取
[0112] 對于測序正確的克隆利用無內毒素質粒大提試劑盒(Tiangen DP117)進行質粒的 大量制備，具體步驟說明如下：
[0113] 1)將一個單菌落自平板挑出，培養在5ml的含氨節或卡那霉素的LB培養液，37°C， 30