高抗草甘膦特變基因及其改良方法和應用的制作方法

專利名稱：高抗草甘膦特變基因及其改良方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程領域，具體的說，本發明涉及一種改良抗草甘膦基因的 方法、抗草甘膦基因及其編碼的蛋白質，以及利用這些改良的抗草甘膦基因獲得轉基因抗 草甘膦植物的方法。本發明可以運用在作物的育種、也可以運用在植物細胞培養的篩選。
背景技術：
草甘膦是一種非常重要的除草劑，它是抑制植物中芳香族氨基酸生物合成中的一 種重要的酶，即5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)。草甘膦是一種極廣譜的除草 劑，對農作物也同樣具備殺傷力。因此為了能夠在農作物生長時選擇性地除草，農作物需要 獲得具有抗草甘膦的能力。草甘膦能夠抑制大部分細菌中芳香族氨基酸生物合成中的5-烯醇丙酮莽草 酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)。但部分細菌的EPSPS已發現對草甘膦具有抗性，并且被分 離獲得。植物可以通過轉基因表達細菌的抗性EPSPS而獲得抗草甘膦的能力。農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens sp CP4)禾口 Salmonella typhimurium CT7 的 EPSPS 在植物 中表達而獲得的抗性已在生產中應用(美國專利453590，4769061，5094945)。但是為了提 高轉基因農作物的抗性水平和增加抗性基因的多樣性，生產應用中仍然需要新的抗草甘膦 基因和以此為基礎的轉基因抗草甘膦植物。hkDeinococcus radiodurans Rl獲得的EPSPS基因具有相當的抗草甘膦能力(中 國專利2009100981 . X)。2009年申請的申請號2009100981 . X的發明專利《一種抗草甘 膦基因及其應用》提供了抗草甘膦基因，其中基因G1174所編碼的蛋白質的氨基酸序列如該 專利的SEQ ID NO :2所示。盡管Λ radiodurans Rl的EPSPS的抗草甘膦能力比較高，但是 獲得抗性更高的EPSPS改良基因仍然十分必要。提供轉基因植物的抗性水平能夠提高草甘 膦的使用劑量，從而可以減緩抗性雜草的發生，避免使用過程中由于劑量問題而造成藥害。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種改良抗草甘膦EPSPS基因的方法和提供一 種抗草甘膦基因。這種抗性基因具有比Λ radiodurans Rl天然的EPSPS基因更高的抗草 甘膦能力。利用這種基因可以用來產生轉基因抗草甘膦植物，也可作為植物細胞培育中的 蹄選標記O為了解決上述技術問題，本發明是通過這樣的技術方案來實現的本發明提供一種通過特變獲得高抗草甘膦的G1174特變基因(高抗草甘膦特變基因)的方法，在第95到 114位的氨基酸序列(Pro Gly Asn Ala Gly Ala Val Ala Arg Phe Leu Met Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly)中引入2個或者2個以上的氨基酸特變，然后選擇高抗草甘膦的突 變體。特別是引入2個或者2個以上如下位點的特變1)第99號甘氨酸；幻第100號丙氨 酸；3)第104號苯丙氨酸；4)第106號甲硫氨酸；5)第107號甘氨酸。本發明同時也提供一種G1174抗草甘膦特變基因(高抗草甘膦特變基因)，其編碼的蛋白質包括至少2個以下位點的特變1)第99號氨基酸從甘氨酸特變成為丙氨酸；2)第 100號氨基酸從丙氨酸特變成為苯丙氨酸，或者蘇氨酸，或者甲硫氨酸，或者絲氨酸；3)第 104號氨基酸從苯丙氨酸特變成為亮氨酸或者絲氨酸；4)第106號氨基酸從甲硫氨酸特變 成為亮氨酸或者絲氨酸；5)第107號氨基酸從甘氨酸特變成為丙氨酸。本發明進一步提供一種抗草甘膦G1174的特變基因(高抗草甘膦特變基因)，其編 碼的蛋白質的第95到114位的氨基酸序列特變成為如下的任何一種1) SEQ ID NO 4 ； 2) SEQ ID NO 5 ； 3) SEQ ID NO 6 ； 4) SEQ ID NO 7 ； 5) SEQ ID NO 8 ； 6) SEQ ID NO 9 ； 7) SEQ ID NO: 10; 8) SEQ ID NO :11; 9) SEQ ID NO :12; 10) SEQ ID NO 13; 11) SEQ ID NO 14; 12)SEQ ID NO 15; 13)SEQ ID NO :16， 14)SEQ ID NO 17, 15)SEQ ID NO: 18,16)SEQ ID NO 19, 17)SEQ ID NO :20, 18)SEQ ID NO :21, 19)SEQ ID NO :22, 20)SEQ ID NO :23, 21) SEQ ID NO :24。本發明還提供了一種高抗草甘膦特變基因，該基因的核苷酸序列為SEQ ID N0 26 SEQ ID NO 30中的任意一種。本發明還提供了 一種載體，其包含上述高抗草甘膦特變基因。本發明還提供了上述高抗草甘膦特變基因的用途通過轉基因在植物中表達，從 而使植物獲得抗草甘膦能力。植物為水稻、玉米、棉花、小麥、大麥、高粱、油菜、大豆、草坪草 或牧草等。來自 Deinococcus deserti VCDl 15 和 Deinococcus geothermalis 的 EPSPS S@ (基因庫YP_002785524 和 ΥΡ_604470,專利申請 200910098129. X 中提供的多肽 SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO 5)和本發明所用的G1174同源性比較高，它們所編碼的蛋白質和G1174 相比，在相應于G1174的第95到114位的氨基酸序列是完全相同的。本發明同時也提供 一種改良這些同源基因以及其他與Gl 174氨基酸序列相同性至少有75%的抗草甘膦多肽的 方法。這些多肽中相對應于G1174中如下位點可以引入至少如下2個位點的特變從而篩 選獲得抗草甘膦能力更高的蛋白質1)第99號氨基酸從甘氨酸特變成為丙氨酸；幻第100 號氨基酸從丙氨酸特變成為苯丙氨酸或者蘇氨酸或者甲硫氨酸或者絲氨酸；3)第104號氨 基酸從苯丙氨酸特變成為亮氨酸或者絲氨酸；4)第106號氨基酸從甲硫氨酸特變成為亮氨 酸或者絲氨酸；5)第107號氨基酸從甘氨酸特變成為丙氨酸。本發明進一步提供了編碼高抗性的EPSPS蛋白質突變體的代表性核苷酸序列 SEQ ID NO 26,或者 SEQ ID N0:27，或者 SEQ ID N0:28，或者 SEQ ID N0:29，或者 SEQ ID NO :30。這些基因在5，端包含了編碼葉綠體信號肽的DNA片段。利用本發明提供的抗草甘膦基因氨基酸序列可以設計并且合成有利于在植物中 表達的核苷酸序列(Campbell和Gowri，Plant Physiol. 92:1-11)，并進一步構建能夠 在植物中表達的人工基因表達框。能夠在植物中表達的人工基因表達框包括啟動子、帶有 葉綠體信號肽的抗草甘膦基因和終止子。在植物中表達和產生抗草甘膦能力所需要的啟動 子、葉綠體信號肽和終止子是已經有的技術。例如，在轉化單子葉植物時啟動子可以是玉米 WDiqutin-I啟動子，或者水稻Actin啟動子；而終止子可以是來自根癌農桿菌終止子(Nos) 或者其他終止子；引導抗草甘膦蛋白質進入葉綠體的信號肽可以是Rubisco的亞基的信號 肽(de Castro Silva Filho 1996 Plant Mol. Biol. 30 767-780)、植物 EPSPS 基因信號 肽(Archer 1990 J. Bioenerg. Biomemb. 22 (b) 789-810)等。編碼葉綠體信號肽的 DNA片段連接在一個抗草甘膦基因在5’端，并且在一個表達閱讀框內。這個表達構件可以通過 農桿菌(如^ro如cteri 菌株LAB4404)、基因槍方法或則其他方法整合到植物的基因組 中并且獲得表達，從而獲得抗草甘膦轉基因植株。植物轉化的技術和方法是已知和成熟的。 不同植物的轉化的方法和步驟有所不同。但是，通常通過農桿菌或基因槍導入植物的未成 熟胚、成熟胚、未分化的愈傷組織或原生質體。然后用1到5 mM的草甘膦培養基進行篩選培 養。再進行分化而獲得轉化芽，經過生根培養基培養就可以獲得可以種植的轉基因苗。進 一步，抗草甘膦轉基因植物可以通過噴施草甘膦篩選。本發明還提供了一種質粒，這種質粒包含上述抗草甘膦的核苷酸序列分子，并且 功能性地與控制植物中表達的核苷酸序列連接而構成表達框。本發明還提供了一種對植物進行改造的方法包括利用植物基因轉化技術將上述 抗草甘膦基因表達框導入植物細胞，再將其分化培育成相應的轉基因植株。所獲得的植株 具有抗草甘膦能力。植物可以是水稻、玉米、棉花、小麥、大豆、油菜、高粱、大麥、草坪草或牧 草。這些植物的轉化技術是已經現有的技術。本發明還提供了利用上述抗草甘膦基因的核苷酸序列分子，在植物轉基因細胞培 養中作篩選標記。本發明的又一個方面是提供抗草甘膦基因用來作為植物轉基因的篩選標志。上述 能夠在植物細胞中表達的抗草甘膦人工基因可以與目的基因表達框構建在同一個植物轉 化質粒的同一個DNA轉化片段上。目的基因可以是任何有價值的基因。這個植物轉化質粒 可以通過基因槍、農桿菌方法或則其他方法導入植物組織，而含有合適濃度的草甘膦(如 1-5 mM)培養基則可以選擇性地殺死沒有導入DNA轉化片段的植物細胞，從而選擇了含有 目的基因的植物細胞。本發明的抗草甘膦基因的核苷酸序列可以有多種不同的變異，包括但不限于1) 利用同一個氨基酸的不同密碼子而獲得的不同的核苷酸序列，這些序列編碼相同活性的蛋 白質多肽；2)通過導入核苷酸序列的其他變異但是仍然編碼具有抗草甘膦能力的蛋白質 的核苷酸序列。這種變異可以是隨機的變異，也可以是針對性的點變異，還可以是插入或者 缺失變異。本領域的一般技術人員就能夠通過分子生物學的方法產生上述變異。
本發明適用于所有植物，包括雙子葉和單子葉植物。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此。 本發明的以下實施例所使用的分子生物學和生物化學方法均為已知的技術。在 Ausubel 編寫的 John Wiley and Sons 公司出片反的 Current Protocols in Molecular Biology,禾口 J. Sambrook 等編寫 Co Id Spring Harbor Laboratory Press (2001)出片反白勺 Molecular Cloning: A Labortory Manual, 3rd ED.等文獻均有詳細的說明。
實施例1、EPSPS基因的表達
ifeiflococciAs rai/ioi/tfra/ ·^的EPSPS基因(核苷酸序列SEQ ID NO 1)通過上海生工(上 海)人工合成獲得，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO 2.。這個基因被稱為G1174基因， 其核苷酸序列編碼第95到114氨基酸的核苷酸片段的二端分別設計了 XmaI和KpnI酶切位點。PMD19載體(購于TAKARA公司)被用來表達Gl 174，以測定其抗草甘膦能力。通 過一般的分子生物學方法將G1174克隆到PMD19，獲得了 PMD19-M-1174質粒載體，SEQ ID NO :3是其全部序列，其中插入的G1174基因序列為2218-3531。轉化了 PMD19和 PMD19-M-1174的大腸桿菌TG-I細胞分別在LB培養液(酵母提取物5. Og,蛋白胨10. Og, NaCl 10. Og,瓊脂15. Og,蒸餾水定容至1. 0L, pH7. 0)中37° C振蕩培養16小時以后， 離心收集獲得大腸桿菌細胞，經過SDS-PAGE分離，利用Gl 174的抗體進行Western檢測，結 果發現PMD19樣品沒有信號而PMD19-M-1174檢測到了明顯的信號，說明這個載體能夠表達 G1174蛋白質。實施例2、EPSPS突變體文庫的獲得
為了篩選抗性水平更高的EPSPS突變體，對G1174編碼的95-114氨基酸的核苷酸片段 進行突變。合成如下2個核苷酸簡并引物
94—114F :Ggg aac gcg NNg NNg gtg gcc cgc NNc ctg NNg gNc gtg gcg gcg ctg acg age ggt ac (N 代表 A\t\g\c)。94-114R: C GCT CGT CAG CGC CGC CAC GNC CNN CAG GNN GCG GGC CAC CNN CGC GTT CCC (N 代表 A\t\g\c)。混合以上2個核苷酸簡并引物的Tris-HCl溶液，用T4多聚核苷酸激酶進行5‘端 磷酸化，然后65° C 20分鐘，然后冷卻到22° C，獲得能夠和SmaI和KpnI酶切的載體連 接的雙鏈DNA片段。這個DNA片段進一步和經過了 SmaI和KpnI酶切的載體PMD19-M-1174 混合，利用了 DNA連接酶連接，導入大腸桿菌TG-1，從而獲得包含不同G1174突變體的突變 體表達文庫。實施例3、EPSPS突變體的抗性篩選
配置含60mM或者IOOmM草甘膦的M 63培養基。M63的配方如下每升M63 13. 6g KH2PO4，2 g (NH4) 2S04，0. 5 mg FeS04_7H20，2.4 mg MgCl2, 10 g glucose, 10 mg Thiamine-HCl和25 mg L-Proline,40 g瓊脂糖，其余為蒸餾水，ρΗ7· 0。Μ63培養基在完 成高溫高壓殺菌以后，在溫度下降到55° C時，添加草甘膦到最后濃度60mM或者100mM。將包含不同Gl 174突變體的突變體表達文庫涂在含60mM草甘膦的M 63培養基上 培養。72小時以后觀察生長情況。原始基因Gl 174在60mM草甘膦的M63培養基上生長非 常緩慢，72小時以后不能看到明顯的菌落。但是，部分G1174突變體能夠在培養72小時以 后長出可以看到的菌落。將抗草甘膦的突變體克隆進一步在草甘膦含量為100 mM的M 63培養基上培育。 如下克隆能夠在72小時長出菌落，它們分別是G1174-A，G1174-B, G1174-C，G1174-D, G1174-E，G1174-F; G1174-G, G1174-H, Gl174-1， Gl174-J, G1174-K, G1174-L， G1174-M, G1174-N, G1174-0, G1174—P, G1174-Q, G1174-R, G1174—S, G1174—T, G1174—U, G1174-V, G1174-W。實施例4、高抗草甘膦Gl 174特變位點的分析
在IOOmM草甘膦上能夠正常生長的克隆可能包含一個抗草甘膦性能比原始基因G1174 更加高的突變體。因此測定了實施例3獲得的抗草甘膦克隆的特變區域的核苷酸序列。結 果發現這些基因的特變結果如下(從第95到114號氨基酸)G1174PGNAGAVARFLMGVAALTSGTG1174--A PGNAGAVARLLMAVAALTSGT(SEQ IDNO4)G1174--B PGNAGMVARSLLGVAALTSGT(SEQ IDNO5)G1174--C:PGNAAAVARLLMAVAALTSGT(SEQIDNO6)G1174--D PGNAAMVARSLMAVAALTSGT(SEQ IDNO7)G1174--E PGNAGLVARSLLGVAALTSGT(SEQIDNO8)G1174--F:PGNAAFVARSLMGVAALTSGT(SEQIDNO9)G1174--G:PGNAASVARFLMGVAALTSGT(SEQ[D NO 10)G1174--I:PGNAATVARLLMGVAALTSGT(SEQIDNO11)G1174-J:PGNAAMVARSLMGVAALTSGT(SEQIDNO12)G1174--K:PGNAGFVARSLMGVAALTSGT(SEQ[D NO 13)G1174--L:PGNAATVARFLMGVAALTSGT(SEQ ID NO 14)G1174--M:PGNAAMVARLLMGVAALTSGT(SEQ[D NO 15)G1174--N:PGNAGAVARLLLGVAALTSGT(SEQIDNO16)G1174--0:PGNAGTVARFLLAVAALTSGT(SEQIDNO17)G1174--P:PGNAGAVARLLLAVAALTSGT(SEQIDNO18)G1174--R:PGNAGTVARFLTGVAALTSGT(SEQIDNO19)G1174--S:PGNAGTVARLLSGVAALTSGT(SEQIDNO20)G1174--T:PGNAGTVARLLLGVAALTSGT(SEQIDNO21)G1174--U:PGNAAMVARSLLAVAALTSGT(SEQIDNO22)G1174--V PGNAAAVARLLMGVAALTSGT(SEQIDNO23)G1174--W:PGNAAFVARSLMAVAALTSGT(SEQIDNO24)
這些高抗草甘膦的突變體的特變主要包括1)第99號氨基酸從甘氨酸特變成為丙氨 酸；2)第100號氨基酸從丙氨酸特變成為苯丙氨酸或者蘇氨酸或者甲硫氨酸或者絲氨酸； 3) 104號氨基酸從苯丙氨酸特變成為亮氨酸或者絲氨酸；4) 106號氨基酸從甲硫氨酸特變 成為亮氨酸或者絲氨酸；5) 107號氨基酸從甘氨酸特變成為丙氨酸。特別是這些突變體普 遍具有2個或者以上的氨基酸特變。以前的研究已經發現在大腸桿菌EPSPS的第96號氨基酸(相應于本發明中G1174 的第99號氨基酸)從甘氨酸特變成為丙氨酸能夠提高抗草甘膦能力，但是這個突變體酶的 ySftPilST (GenBank accession no. X00557; Kishore et al. 1986; Padgette et al. 1991)。為了研究能否僅僅將基因G1174的第99號氨基酸從甘氨酸特變成為丙氨酸而獲 得高的抗草甘膦能力，本發明通過點特變的方法獲得了 99號氨基酸從甘氨酸特變成為丙 氨酸的Gl 174特變基因G1174-G99A。為了比較G1174-G99A和本發明的G1174-A、G1174-F和G1174-V等突變體的抗 草甘膦能力，能夠表達以上這些突變體的PMD19載體導入了大腸桿菌TG-1，在LB培養基上 37° C培養16小時，獲得單個克隆。然后將每個突變體的5個克隆轉接到含IOOmM草甘膦 的M63培養基上，37° C培養48小時，觀察生長情況。結果發現，表達G1174-G99A的克 隆生長明顯比表達G1174-A、G1174-F和G1174-V的克隆慢。同時這些表達克隆轉接到含 IOOmM草甘膦的M63培養液(不包含瓊脂糖，其他成分和M63培養基相同)，37° C振蕩培養48 小時。測定 0D600，結果發現，G1174-G99A 是 0. 24，G1174-A 是 0. 73，G1174-F 是 0. 65， G1174-V是0. 53。因此本發明提供的抗草甘膦突變體比僅僅第99號的甘氨酸到丙氨酸特 變體表現更高的抗性。實施例5、G1174-A 基因，G1174-C 基因，G1174-L 基因，Gl 174-0 基因和 G1174-V 基因在植物中表達的表達框的構建
通過人工合成獲得了適于在單子葉植物中表達的密碼子優化的G1174的人工基因 (SEQ ID NO 25,其包括了 5，端編碼葉綠體信號肽的核苷酸序列)。這個人工基因的DNA 片段的5’端帶有一個BamHI位點，3’端帶有一個BioI位點。利用現有的特變方法分別引 進了相應的特變，獲得了具有G1174-A，G1174-C，G1174-L，Gl 174-0和G1174-V的突變位 點的Gl 174特變基因(核苷酸序列分別SEQ ID NO: 26，SEQ ID NO: 27，SEQ ID NO: 28， SEQ ID NO: 29，和 SEQ ID NO: 30)。啟動G1174特變基因的啟動子是玉米的ubiquitin-1啟動子。這個啟動子是 通過PCR從玉米基因組中獲得。PCR引物分別是ZmUbiF (GCGAAGCTTGCATGCCTACAGTGC AGCGTGACCCGGTCGTGC, 力Π 了 HindIII 位點，下戈Ij 線表示)，禾Π ZmUbiR (GTGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCA GAAGTAACACCAAACAACAG,力卩了 BamHI 位點，下劃線表示)。G1174特變基因經過XhoI和BamHI酶切，PCR獲得的玉米ubiquitin-Ι啟動子經過 HindIII和BamHI酶切，同時連接到經過了 HindIII和XhoI酶切的pCambial300載體，分 別獲得 T-DNA 載體 pCAM1300-1174A，pCAM1300_1174C，pCAM1300-1174L，pCAM1300_11740 和pCAM1300-1174V。這個載體中Gl 174特變基因的終止子是來自載體本身的CaMV的35S 基因的終止子。實施例6、水稻的轉化
轉基因植物的獲得方法是采用現有技術(盧雄斌龔祖塤1998生命科學10: 125-131 ；劉凡等，2003分子植物育種1:108-115)。選取成熟飽滿的“秀水110”種子去 殼，誘導產生愈傷組織作為轉化材料。分別取含載體pCAM1300-1174A，pCAM1300_1174C， PCAM1300-1174L, pCAM1300-11740和pCAM1300_1174V的農桿菌劃板，挑單菌落接種準備 轉化用農桿菌。將待轉化的愈傷組織放入適當濃度的農桿菌液中(含乙酰丁香酮)，讓農桿 菌結合到愈傷組織表面，然后把愈傷組織轉移到共培養基中，共培養2 3天。用無菌水沖 洗轉化后的愈傷，轉移到含適當抗生素的篩選培養基上，篩選培養(2 mM草甘膦)兩個月(中 間繼代一次)。把篩選后，生長活力良好的愈傷轉移到預分化培養基上培養20天左右，然后 將預分化好的愈傷組織移到分化培養基，14小時光照分化發芽。2 - 3周后，把抗性再生植 株轉移到生根培養基上壯苗生根，最后將再生植株洗去瓊脂移植于溫室，作為鑒定材料。實施例7、玉米的轉化
玉米的轉化方法已經比較成熟，例如Frame等描述了利用農桿菌轉化玉米的方法 (Plant Physiol, 2002，129 :13-22 )。分別取含載體pCAM1300_1174A，pCAM1300_1174C， PCAM1300-1174L, pCAM1300-11740和pCAM1300_l 174V的農桿菌劃板，挑單菌落接種準備 轉化用農桿菌。取授粉后8 — 10天的Hi-II玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小為1.0 — 1.5mm)。將含有T-DNA載體的農桿菌與未成熟胚共培育共培養2 — 3天(22°C)。轉移未成 熟胚到愈傷誘導培養基上(200mg/L的Timentin殺農桿菌暗培養10 — 14天。將所 有的愈傷轉到帶有2 mM草甘膦的篩選培養基上，28°C暗培養2 — 3周。
轉移所有的組織到新鮮草甘膦的篩選培養基上，28°C暗培養2 — 3周。然后，轉移 所有篩選后成活的胚性組織到再生培養基上，28°C暗培養10 - 14天，每皿一個株系。轉移 胚性組織到新鮮的再生培養基上，^rc光照培養10 - 14天。轉移所有發育完全的植株到 生根培養基上，26°C光照培養直到根發育完全，然后移植到溫室中單株培養，檢測轉基因 玉米的抗除草劑能力。實施例8、轉基因水稻的抗草甘膦能力測定
從PCAM1300-1174A， pCAM1300_1174C， pCAM1300_1174L， pCAM1300_11740 和 PCAM1300-1174V以及pCAM1300_G1174 (對應原始的基因G1174)獲得的轉基因水稻中分別 選擇12個不同的轉基因水稻株和同品種“秀水110”的非轉基因株種植在溫室中培育(溫度 15-25°C)。在苗高大約10 cm時，噴濃度為0.4% (W/V)的草甘膦，40 mL/平方米。8天后檢 查，結果如表1。結果表明這些本發明特變基因的抗草甘膦能力良好，優于原始基因G1174。表1 轉基因水稻噴施草甘膦以后的成活率。
權利要求
1.一種通過人工特變獲得高抗草甘膦G1174基因特變體的方法，其特征是在基因 Gl 174編碼的蛋白質的第95到114位的氨基酸序列中引入2個或者2個以上的氨基酸特 變，然后選擇高抗草甘膦的突變體。
2.根據權利要求1所述的通過人工特變獲得高抗草甘膦Gl174基因特變體的方法，其 特征是1)、這種抗草甘膦基因編碼的蛋白質的氨基酸序列與G1174具有至少75%的相同 性；2)、在對應于基因G1174編碼的蛋白質的95到114位的氨基酸序列中引入2個或者2 個以上的氨基酸特變，然后選擇高抗草甘膦的突變體。
3.根據權利要求2所述的通過人工特變獲得高抗草甘膦Gl174基因特變體的方法，其 特征是在以下任意2個或2個以上的位點同時特變1)、第91號甘氨酸；2)、第92號丙氨 酸；3)、第96號苯丙氨酸；4)、第98號甲硫氨酸；5)、第99號甘氨酸。
4.根據權利要求3所述的通過人工特變獲得高抗草甘膦Gl174基因特變體的方法，其 特征是同時發生以下任意2個或2個以上的位點的特變1)、第91號氨基酸從甘氨酸特變成為丙氨酸；2)、第92號氨基酸從丙氨酸特變成為苯丙氨酸或者蘇氨酸或者甲硫氨酸或者絲氨酸；3)、第96號氨基酸從苯丙氨酸特變成為亮氨酸或者絲氨酸；4)、第98號氨基酸從甲硫氨酸特變成為亮氨酸或者絲氨酸；5)、第99號氨基酸從甘氨酸特變成為丙氨酸。
5.利用權利要求1、所述方法獲得的高抗草甘膦特變基因編碼的蛋白質，其特征是 所述蛋白質的第95到114位的氨基酸序列為SEQ ID NO :4 SEQ ID NO 24中的任意一種。
6.一種高抗草甘膦特變基因，其特征是所述基因的核苷酸序列為SEQ ID NO 26~ SEQ ID NO 30中的任意一種。
7.一種載體，其特征是包含權利要求6所述的高抗草甘膦特變基因。
8.如權利要求6所述高抗草甘膦特變基因的用途，其特征是通過轉基因在植物中表 達，從而使植物獲得抗草甘膦能力。
9.根據權利要求8所述的高抗草甘膦特變基因的用途，其特征是所述植物為水稻、 玉米、棉花、小麥、大麥、高粱、油菜、大豆、草坪草或牧草。
全文摘要
本發明公開了一種通過人工特變獲得高抗草甘膦G1174基因特變體的方法和應用在基因G1174編碼的蛋白質的第95到114位的氨基酸序列中引入2個或者2個以上的氨基酸特變，然后選擇高抗草甘膦的突變體。本發明還公開了一種高抗草甘膦特變基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO26~SEQ ID NO30中的任意一種。上述高抗草甘膦特變基因的用途是通過轉基因在植物中表達，從而使植物獲得抗草甘膦能力。
文檔編號A01H5/00GK102146371SQ201110009329
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月17日 優先權日2011年1月17日
發明者徐曉麗, 李新蘭, 林朝陽, 沈志成 申請人:杭州瑞豐生物科技有限公司