專利名稱：植物抗/耐草甘膦基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物分子生物學與植物遺傳工程領域，具體地說，本發明涉及三種植物源抗/耐草甘膦基因以及該基因編碼的蛋白質。通過遺傳轉化的方法使該基因在植物中表達而使植物獲得對草甘膦的抗性能力，從而可以利用草甘膦于作物田間選擇性地防除雜草。本發明也可以運用在作物育種、植物細胞培養的篩選。
背景技術：
草甘膦(glyphosate)分子式為C3H8NO5P，是一種高效、廣譜、低毒、低殘留、不破壞土壤環境、對大多數植物具有滅生性的除草劑。具有對人畜無毒，自然條件下雜草和農作物對它產生抗性的頻率較低，低土壤殘留量等特點，市場潛力巨大。
草甘膦毒性作用機理主要是竟爭性抑制EPSP合酶即5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)，該酶廣泛存在于真菌、細菌、藻類、高等植物體內，但不存在于動物體內。草甘膦是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的類似物，二者的分子式極為相似，它能與PEP競爭性結合EPSP合酶，形成EPSP合酶· 3-磷酸莽草酸(S3P) ·草甘膦的復合物，阻斷EPSP的合成，從而阻斷芳香族氨基酸的合成，導致植物死亡。然而草甘膦無選擇性地殺死作物和雜草，限制了它在農業生產上的使用，因此為了能夠在農作物生長期間應用草甘膦選擇性地除草，農作物需要獲得具有抗/耐草甘膦的能力。盡管草甘膦能抑制大部分植物和細菌中芳香族氨基酸合成過程中5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)，但已發現部分細菌的EPSPS對草甘膦不敏感，被分離出來，生產實踐中也發現有些植物具有對草甘膦的耐藥性。通過轉基因表達細菌或有草甘膦抗性植物的EPSPS基因而獲得抗/耐草甘膦的能力。農桿菌CP4和SalmonellatyphimuriumCYl的EPSPS在植物中表達而獲得的抗性已在生產中應用(美國專利453590，4769061,5094945)。抗草甘勝putida^Zymomonas mobilis ^XJiiKlebsiellapneumoniae等EPSPS基因也申請了專利保護。在植物中也發現了由于EPSP合酶單個氨基酸位點突變造成其對草甘膦具有抗藥性。馬來西亞的牛筋草、澳大利亞的瑞士黑麥草和智利的多花黑麥草對草甘膦的抗藥性即是草甘膦靶標酶EPSPS基因106位氨基酸由脯氨酸突變為絲氨酸或蘇氨酸所致(Powles，2006)。抗草甘膦牛筋草EPSPS的編碼基因發生了變化，牛筋草敏感生物型EPSPS基因的第319個核苷酸堿基為胞嘧啶C，而抗性生物型中突變成了胸腺喃唳T,使第106位脯氨酸變為了絲氨酸(Baerson et al.，2002)。Ng等發現抗性生物型中同時存在胞嘧啶C突變成了鳥嘌呤A，導致其第106位脯氨酸變為蘇氨酸(NG etal, 2003)。另外還有多個位點的甘氨酸被天門冬氨酸、蘇氨酸被丙氨酸、脯氨酸被亮氨酸取代的例子，說明EPSPS存在多個與PEP結合的活性位點。通過這些有效位點的基因突變，降低了 EPSPS對草甘膦的親和性，從而增強了雜草對草甘膦的抗性。孟山都公司已經對抗草甘膦牛筋草的EPSPS基因申請了專利保護。但是為了提高轉基因農作物的抗性水平和增加抗性基因的多樣性，生產應用中仍然需要新的抗/耐草甘膦基因和以此為基礎的抗/耐草甘膦植物。
發明內容
本發明的目的是為了解決現有技術中存在的缺陷，提供一種基于自然界的植物天然耐性為基礎，經過前期對大量植物進行的草甘膦耐性篩選得到的新的抗/耐草甘膦基因。為了達到上述目的，本發明提供了三種具有草甘膦耐性的基因(LsEPSPS)LsEPSPSU LsEPSPS2 和 LsEPSPS3，核苷酸序列分別為 SEQ ID NO U SEQ ID NO :3 和 SEQID NO :5。利用上述LsEPSPSl、LsEPSPS2和LsEPSPS3三種核酸序列，可以用來人工引入一個或多個變異，然后通過草甘膦篩選變異分子，而獲得保持有抗/耐草甘膦能力的變異分子。例如利用低保真PCR的方法可以產生很多LsEPSPSl、LsEPSPS2和LsEPSPS3的變異分子，而 這些變異分子可以通過草甘膦篩選獲得繼續保持有抗/耐草甘膦能力的變異分子。本發明還提供了一種抗/耐草甘膦蛋白質多肽，該抗/耐草甘膦蛋白質多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6或與上述氨基酸序列相比具有不小84%相同性的氨基酸序列。本發明還提供了核苷酸序列為編碼上述蛋白質多肽的基因，該基因與LsEPSPSl、LsEPSPS2、LsEPSPS3和上述得到的保持有抗/耐草甘膦能力的變異分子統稱為抗/耐草甘膦基因(LsEPSPS)。本發明還提供了一種能夠與上述蛋白質多肽結合的抗體。SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4 和 SEQ ID NO :6 分別表示為 SEQ ID NO USEQ ID NO:3和SEQ ID NO :5編碼的氨基酸序列。這三種氨基酸序列均包含四個特異性位點，麥冬中為144m, 184i, 232a以及273m，土麥冬和闊葉土麥冬中為146m, 186i, 234a以及275m，相當于大腸桿菌EPSP合酶氨基酸序列中70、107、153以及192位。氨基酸序列SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 6表示的蛋白質多肽包括信號肽和成熟蛋白兩部分。氨基酸序列同源性相當高的蛋白質一般具有相同的功能，因此與SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :6相比具有84%相同性的氨基酸序列都可能對草甘膦有抗性。利用本發明的基因編碼的氨基酸序列，可以設計和人工合成密碼子優化的有利于在植物中表達的核酸序列。例如 Campbell 和 Gowri (1990)的報道(Plant Physiology, 92:1-11)。本發明還提供了一種包含抗/耐草甘膦基因的表達載體，所述表達載體為原核表達載體或植物轉化質粒。構建包含表達構件的原核表達載體時，表達構件包括啟動子和抗/耐草甘膦基因，載體質粒可以是PET系列、pMAL - p2X或pRSET_A等。在原核生物表達系統中，啟動子可以是T7噬菌體啟動子或者Iac (乳糖啟動子)、trp (色氨酸啟動子)、PL和PR( λ噬菌體的左向和右向啟動子)以及tac (乳糖和色氨酸的雜合啟動子)等強啟動子。利用抗/耐草甘膦基因進一步構建包含表達構件的植物轉化質粒時，表達構件包括啟動子，帶有葉綠體信號肽的抗/耐草甘膦基因和終止子。在轉化單子葉植物時啟動子可以是玉米Ubiqutin啟動子,或者水稻Actin啟動子,或者其他啟動子。而終止子可以是根據根癌農桿菌終止子或者其他終止子。抗/耐草甘膦的LsEPSPS基因在5’端連接一個在同一個表達閱讀框內表達的編碼信號肽的DNA片段，這個信號肽可以引導LsEPSPS蛋白質進入葉綠體。這個信號肽可以是Rubisco的亞基的信號肽(de castro Silva Filho1996 Plant Mol . Biol . 30 : 767 一 780 )，或者植物 EPSPS 信號肽(Archer 1990 J
Bioenerg. Biomemb . 22 ( b ) : 789 — 8 10 )，或者其他能使 EPSPS 發揮功能的信號肽，或者無信號肽。這個表達構件可以通過農桿菌〔如Agrobacterium菌株LAB 4404 )轉入整合到植 物的基因組中，穩定遺傳和表達。本發明還提供了包含所述抗/耐草甘膦基因的植物細胞，以及包含該植物細胞的抗/耐草甘膦植株。本發明還提供了所述抗/耐草甘膦基因在制備抗/耐草甘膦植株方面的用途，以及所述抗/耐草甘膦基因作為植物轉基因篩選標記的用途。利用抗/耐草甘膦基因制備抗/耐草甘膦植株，可通過含有LsEPSPS表達構件的植物轉化質粒獲得。植物轉化的方法和步驟各種植物有所不同，同種植物不同的品種也可能有所不同。但是植物轉化的技術和方法是已知和成熟的。通常通過農桿菌或基因槍導入植物的未成熟胚、成熟胚、未分化的愈傷組織或原生質體。然后用不同濃度的草甘膦培養基進行篩選培養。再進行分化而獲得轉化芽，經過生根培養基培養就可以獲得可以種植的種苗。也可以通過花粉介導法，通過農桿菌導入植物的花粉從而獲得轉基因的種子。更進一步，草甘膦可以噴施在轉化苗及其后代篩選除去未轉化植株和后代分離失去LsEPSPS基因的植株。具體可通過以下步驟制備
(1)利用DNA充足技術，構建含有所述抗/耐草甘膦基因的植物轉化質粒；
(2)將步驟(I)中構建的植物轉化質粒通過基因槍或農桿菌浸染方法或花粉介導法導入植物組織，利用草甘膦培養基篩選含有抗/耐草甘膦基因的植物細胞；
(3)將步驟(2)中篩選的植物細胞進行分化獲得轉化芽，經過生根培養獲得植物種苗，從而得到所述抗/耐草甘膦植株。植物可選取水稻、玉米、棉花、小麥、大豆、馬鈴薯、甘薯、谷子、高粱、大麥、油菜、甘蔗、煙草、草坪草(狗牙根、結縷草、黑麥草、早熟禾、暖地大葉草、剪股穎、海濱雀稗)或牧草(紫苜蓿、紅三葉草、雀稗)、蔬菜(青菜、白菜、黃瓜、芹菜、辣椒、茄子)、花卉(月季、康乃馨、菊花)。抗/耐草甘膦基因作為植物轉基因篩選標記時，通過己知的分子克隆技術可以使LsEPSPS在植物細胞中表達，通常構建一個在植物中表達的表達構件。這個表達構件包括啟動子、帶有葉綠體信號肽的LsEPSPS和終止子。這個表達構件可作為篩選標志被克隆到植物轉化質粒。植物轉化質粒通常還含有目的基因和其他DNA序列。植物轉化質粒可以通過基因槍或農桿菌浸染方法或花粉介導法導入植物組織，而含有合適濃度的草甘膦培養基則可以選擇性地殺死沒有導入質粒DNA的植物細胞，從而選擇含有LsEPSPS和目的基因的植物細胞。本發明適用于所有植物，包括雙子葉和單子葉植物。本發明相比現有技術具有以下優點本發明基于自然界的植物天然耐性為基礎，經過前期大量植物對草甘膦的耐性篩選，代替依賴于在長期草甘膦環境中生存的植物或微生物的抗性生物型篩選，發現了百合科植物麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬的草甘膦耐藥性，并利用RACE技術分別克隆它們的EPSPS基因，進一步在疋coli (大腸桿菌)中證明了這個EPSPS基因的抗/耐草甘膦能力及其在發展轉基因抗/耐草甘膦農作物中的用途。為培育抗/耐草甘膦除草劑作物提供了新的選擇，增加抗/耐草甘膦除草劑轉基因技術的多樣性，從而降低了抗/耐除草劑轉基因技術的生態風險；再則，由于本發明的基因是植物本身來源，在培育抗/耐草甘膦除草劑作物后的生態環境和食品安全風險要低于不同生物類別的異源基因。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。實施例I.麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬的草甘膦抗性實驗
選取長勢均勻的麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬，進行噴霧處理。草甘膦濃度設置為0、375、750、1500、3000、6000、12000、24000ai. g/ha，試驗按照設計用量處理供試植物材料，每一處理重復四次。噴藥后觀察植株受損傷程度，每周調查并記錄藥害等級，繪制抑制率曲線并進行Logistic回歸分析，計算ED5tl值。重復三次。結果發現，麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬的草 甘膦抗性分別是一般植物的4. 73、5. 06和5. 8倍。實施例2. EPSPS基因的克隆
以土麥冬總RNA反轉錄產物為模板，利用EPSPS基因保守序列設計引物，進行RT-PCR反應，將擴增得到的片段克隆至PMD19-T載體中，進行測序及BLAST。得到保守區的序列后，再通過RACE (rapid-amplification of cDNA ends)技術，進行EPSP合成酶基因的全長克隆。以接頭引物AP進行麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬RNA的反轉錄，利用已經得到的基因保守區序列設計基因特異性引物，并與3’端的特異引物進行RT-PCR 反應。根據已經得到的目的基因片段，利用TdT末端轉移酶法進行5’端的克隆。設計基因特異性引物反轉錄后進行單引物的擴增，然后純化擴增產物，用dCTP和TdT對純化的擴增產物加尾，使用錨定引物進行PCR擴增帶有dC尾的產物，最后使用巢式重新擴增初步PCR產物。將擴增得到的序列進行克隆測序。最后，將保守區、3’端序列，5’端序列進行拼接，獲得土麥冬EPSPS基因的cDNA的全長序列。這個基因的核苷酸序列為SEQ ID NO : I，被命名為LsEPSPSl，其編碼的氨基酸為 SEQ ID NO :2。麥冬和闊葉土麥冬EPSPS基因的克隆方法同上，麥冬EPSPS基因的核苷酸序列為SEQ ID NO : 3，被命名為LsEPSPS2，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO : 4，闊葉土麥冬EPSPS基因的核苷酸序列為SEQ ID NO : 5，被命名為LsEPSPS3，其編碼的氨基酸序列為SEQID NO : 6。實施例3.麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬EPSPS基因編碼氨基酸序列的分析比對 通過MAGA軟件分析比較了與麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬EPSP合酶體制性較高的約260
條EPSPS合酶氨基酸序列，發現麥冬、土麥冬與闊葉土麥冬的EPSP合酶的氨基酸序列與其他植物相比存在四處特異的氨基酸，分別是144m，184i，232a以及273m (相當于大腸桿菌EPSP合酶的70、107、153及192位，土麥冬和闊葉土麥冬中為146m, 186i, 234a以及275m)，這些位點的氨基酸在麥冬、土麥冬與闊葉土麥冬中均保守，但在其他植物的相同位點均不存在。正是由于這些氨基酸的存在導致了麥冬、土麥冬與闊葉土麥冬對草甘膦的耐藥性。144和273位的Met中含有甲硫基一SCH3，其他氨基酸中均不含有，可能由于甲硫基的存在導致EPSP合酶結構發生改變。184位的Ile與其他植物中的Val和Thr相比，R基團多一個一CH2—，可能由于一CH2—的增加致使同一位點所需的空間體積增大，使得與草甘膦的結合的空間位阻增大。232位的Ala與其他植物中的Val相比，少了兩個一CH3，使得R基團長度和空間位阻都減少，可能造成EPSP合酶結構發生改變。將麥冬的EPSP合酶的氨基酸序列(共516個氨基酸)進行二級結構預測，并與已知的EPSP合酶主鏈圖進行比較，發現整個氨基酸部位總共有12個螺旋(除信號肽)，第144位甲硫氨酸位于第2和第3個螺旋的轉角處，大約處于第3區；第184位異亮氨酸位于第3個 螺旋上；第232位丙氨酸位于第4和第5螺旋的第2個折疊處；第273位甲硫氨酸位于第5和第6個螺旋的折疊處。144Met與草甘膦結合位點22Lys以及S3P結合位點23Ser、27Arg較為接近；184Ile與草甘膦結合位點96Gly、94Asn同處于第三個螺旋上，其增加的主鏈長度可能會草甘膦結合的空間位阻增大從而降低草甘膦與EPSP合酶的親和性；232Ala與124Arg很接近；273Met與其空間構像可能會影響169Ser、170Ser、171Gln以及197Ser都處于第5個結構域。這四個位點均處于底物與酶的結合有關的區域，此四個氨基酸的變化，可能導致EPSP合酶結構的變化，使其與底物的結合程度發生變化，從而導致草甘膦的耐藥性。實施例4. 土麥冬EPSPS基因在大腸桿菌中的表達
LsEPSPS基因克隆在載體PET-28a中并轉入大腸桿菌BL21(DE3)獲得克隆TRl。克隆TRl的閱讀框在PET系統的T7啟動子的控制下而獲得表達。克隆TRl和PET_28a (空載體，對照)在LB中培養，當OD6tltl達到O. 6時，分別將含克隆TRl和PET-28a在37°C含Kan的LB液體培養基中生長至OD值O. 4左右，1%的接種量接入草甘膦濃度分別為 0、1500、3000、4500、6000、7500、9000、10500 以及 12000ai. g/ha 的含Kan的LB液體培養基中，同時加IPTG至終濃度為I mmol/L，12 16h后測OD值，從而得到克隆TRl和PET-28a在不同草甘膦濃度下的生長曲線并進行Logistic回歸分析，實驗結果發現在7500和9000ai. g/ha濃度下，克隆TRl的0D% (0D值占對照的百分比)值約為70%和60%，而空載體PET-28a的0D%僅為對照的20%和1%，說明在7500和9000ai. g/ha濃度下，轉LsEPSPS基因菌株對草甘膦的抗性大大高于空載菌株。根據Logistic方程，轉LsEPSPS基因菌株的ED50值也大大高于空載體PET-28a。這些說明LsEPSPS具有抗/耐草甘膦能力。實施例5.真核表達載體的構建
一般地含有35S啟動子的植物表達載體比較適合外源基因向雙子葉植物的轉移，啟動效率很強，容易在轉基因后代中轉錄和表達，但35S啟動子不適合在單子葉植物中發揮作用；單子葉轉基因植物主要使用actin、emu、ubquitin promoter三種啟動子,它們來源于單子葉植物，比較適合外源基因向單子葉植物的轉移。終止子較常用的是胭脂堿合成酶基因終止子N0S，標記基因可以是新霉素磷酸轉移酶(npt II )、氯霉素乙酰轉移酶基因(cat)、熒光素酶基因(luc)、綠色熒光蛋白基因(gfp)或者β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)等等。以植物表達載體pBI121-LsEPSPS的構建為例利用DNA重組技術，將LsEPSPS基因克隆至植物表達載體PBI121中，通過酶切、電泳鑒定LsEPSPS基因已成功構建到植物表達載體PBI121中；然后將重組質粒pBI121-LsEPSPS通過凍融法導入根癌農桿菌EHA105中，Kan平板篩選陽性克隆，生長的單菌落進行PCR鑒定，證明重組質粒已轉入根癌農桿菌EHA105中。對于不同的植物可選擇不同的表達載體，也可對其進行重組和改造，例如替換或增加啟動子、終止子或標記基因。實施例6.轉基因擬南芥的抗性鑒定
用花序浸染法轉化野生型擬南芥，通過篩選獲得轉基因擬南芥植株。以非轉基因和轉基因的擬南芥組培苗的莖作為外植體在進行愈傷組織的誘導，培養基為6-BA2. Omg/L和NAA0. lmg/L的MS培養基。在愈傷生長2 3周后，進行草甘膦處理。將通過Kan抗性篩選的轉基因抗性愈傷組織和野生愈傷組織分別接種到草甘膦的濃度為O mg/L、50mg/L、IOOmg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L 和 1000mg/LMS 培養基中，然后于 25°C，16h/8h 進行光、暗交替培養，兩周后統計結果。對照擬南芥愈傷組織在草甘膦濃度為50 mg/L時，已變黃并逐步壞死。而轉基因擬南芥愈傷組織在600mg/L時仍可以正常生長，當濃度達SOOmg/ L時生長才受到抑制，褐化變黃。由此可見，轉基因植株的抗性基因提高了對照擬南芥愈傷組織對草甘膦抗性12倍以上。實施例7.離體EPSP合酶活性測定
稱取麥冬、土麥冬、闊葉土麥冬以及野生擬南芥幼苗O. 5 g，加150 ml提取緩沖液A[100mmol/L 的 Tris pH 7. 5,1 mmol/L 的 EDTA、10% (V/ V)的甘油、I mg/L 的 BSA、10 mmol/L 的維生素 C(Vc)、1 mmol/L 的苯脈(benzamidine)、5 mmol/L 的 DTT、20 mg/mlPVPP],研磨勻漿，用6層紗布過濾，12000rpm、4°C下離心20 min，上清液為EPSP合成酶的粗酶液。40 μ I酶促反應體系(50 mmol/L 的 HEPESpH7. 5、1 mmol/L 的(NH4) 6M07024、I mmol/L 的 PEP、2mmol/L 的 S3P、I mg/L 的 BSA，草甘膦濃度設置為 O、100、200、500、800、1000 以及 2000umol/L)于25°C下預熱5 min，加入10 μ I酶液，25°C下酶促反應15min，迅速放入沸水中停止酶促反應，冷卻至室溫，再參照Lanzetta和Alvarez (1979)的方法加800 μ I孔雀石綠鹽酸鹽顯色反應30min，后再加100 μ I 34%的檸檬酸鈉溶液，30min后于660 nm的分光光度計上測定0D660值。結果發現，野生型擬南芥EPSP合酶活性在500 umol/L時出現明顯的下降，麥冬EPSP合酶活性在800 umol/L時出現明顯的下降，土麥冬和闊葉土麥冬EPSP合酶活性在1000 umol/L時才出現明顯的下降。進行Logistic回歸分析并計算ED50值,擬南芥、麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬EPSP合酶的ED5tl值分別為776、1077、1010以及1503umol/L，由此可見，麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬EPSP合酶的活性明顯高于野生型擬南芥。實施例8.轉變基因抗/耐草甘膦油菜的獲得
目前常用的轉基因方法主要有農桿菌介導轉化法、激光微束穿刺法、PEG法、電擊法、微注射法和花粉介導法。以花粉介導法為例介紹轉基因抗/耐草甘膦油菜的獲得。進入油菜盛花期后，選取主莖或一次分枝上10 15個I 2 d內將要開放的花蕾徒手去雄，并摘除所選莖或分枝上其他花蕾，然后套袋。同時在同一品種中選取第2天將開放的花序進行套袋，以備第2天取粉用。翌日上午當天開放的套袋植株的花粉約0.4g，懸浮在25 ml 7. 5%的蔗糖溶液中，進行第I次超聲波處理，然后在溶液中加入20 μ g含EPSPS基因的質粒DNA進行第2次超聲波處理。第2次處理后，在溶液中加入10 μ L 1/10000(ff/V)硼酸，然后用處理過的花粉授在前一天去雄的油菜柱頭上，套袋并掛牌，同時標注授粉花蕾數。授粉后5 6 d去袋，使處理的授粉株充分發育。采收種子。實施例9.轉基因抗/耐草甘膦玉米的獲得
在溫室對受體材料以7 d為周期分期播種，玉米試材按試驗需要進行控制授粉，授粉后10 13 d，取玉 米幼胚作為轉化受體。用次氯酸鈉消毒玉米棒后，剝出幼胚(剝幼胚時要謹慎，不要創傷胚)，用侵染液(加AS)清洗幼胚4遍，然后加入一定濃度的農桿菌菌液，放置10 30 min，取出后用滅菌濾紙吸干，放到共培養培養基上，在25°C (黑暗)共培養2 5山然后將幼胚轉移到靜息培養基，在28°C條件下暗培養7 d。侵染和共培養環節菌液濃度0D500=0. 3 O. 5，侵染時間10 min)、共培養時間3 d。從靜息培養基上把幼胚移入含有草甘膦的抗性篩選培養基上，暗培養。先在含10 mg/L除草劑低選擇壓下培養14 d,再經過80 mg/L除草劑高壓選擇，第3次篩選濃度加大至160 mg/L。每次繼代注意淘汰呈褐色和水潰化的愈傷組織，并把生長正常的愈傷組織用鑷子夾碎，分開選擇培養。在繼代篩選過程中注意經常觀察發現污染或農桿菌復出的立即移出，未污染材料繼續培養。另外，經常把出現褐化污染的組織塊剔出或轉移好的未被污染的組織塊到新的相同培養基上。組織塊膨大后，經常把大塊組織剝小，連續繼代篩選3次后，將選擇到的抗性愈傷組織轉到再生I培養基上，恢復培養15 d或更長時間(暗培養)。再將抗性愈傷組織轉到再生II培養基上發芽，培養條件為28°C，每日3 000 Ix光強下，光照12 h。待再生的玉米植株長到3片葉時，可將幼苗分移植到含生根培養基的瓶中，在室內培養。當幼苗長出較粗的根后，將幼苗從罐頭瓶中取出，用水沖凈培養基，移栽于混有營養土和蛭石(I 3)的小花盆中，當玉米又長出2 3片新葉時，可將其移入大田或大花盆中，待長出三四葉后提取葉片DNA進行PCR檢測。確定含有轉入的LsEPSPS基因。實施例10.轉基因抗/耐草甘膦棉花的獲得
大量提取植物表達載體質粒DNA，選擇次日將開放的花蕾進行自交。由于棉花是常異交植物，天然異交率在10%左右，因而外來花粉往往會造成品種間的混雜。在開花前一天，可見花冠快速伸長，黃色或乳白色的花冠呈指狀突出于花蕾，次日即開放成為花朵。選擇這樣的花蕾，于指狀花冠的前端用細線扎緊，并將細線的另一端系于鈴柄，作為收獲時的標記；在開花后20 24h左右即次日，選擇果枝和花位較好的幼子房作為轉化對象。一般選擇每個果枝的第一和第二個果節位的花朵進行轉基因操作。這些果節上的棉鈴一般成鈴率較高，有利于收獲較多的種子；用50田微量進樣器作為微注射的工具。每次使用前和使用后，應以淡洗滌劑清洗，再用蒸餾水漂清；注射時，摘除或剝去花瓣，抹平花柱。在剝除花瓣時，注意不能損傷幼子房的表皮層，以免增加脫落率；用右手持微量注射器，左手輕扶摘除花瓣后的幼子房，從抹平花柱處沿子房的縱軸方向進針至子房長度的約三分之二處，并后退至約三分之一處。花粉管通道法轉化得到的棉花種子(Ttl代)收獲后于在溫室盆栽幼苗，在2 3葉期，以草甘膦胺鹽水劑噴灑棉花葉片(草甘膦施用量1000克/公頃)。一周后觀察植株生長狀況，拔除葉片表面有退綠斑點的植株。為獲得高抗草甘膦的轉基因棉株可連續進行3次篩選，時間間隔為10 14天。生長正常的被認為是獲得抗性基因的植株。共獲得3株。實施例11.轉基因抗/耐草甘膦煙草的獲得
農桿菌活化；共培養將侵染過的葉塊擺放在鋪有2層濾紙的煙草芽分化培養基(MS+IAAO. 5mg/L+6-BA2mg/L)上，25°C暗培養4天；抗性芽的篩選將經過共培養的煙草外植體轉移到抗性芽篩選培養基(MS+ IAAO. 5mg/L+6-BA2mg/L +KanlOO mg/L +Carb500mg/L)上，2 3周后即可生芽。生根待抗性芽長到Icm左右時，將其轉移到生根培養基(MS+KanlOO mg/L +Carb500mg/L)上，I 2周后即有不定根形成。將煙草無菌苗移溫室栽，長有6 8片真葉時，分別涂摸I %。、2 %。、3 %。、4%。、5 %。、6 %。濃度的早甘勝除早劑(商品名為農達Roundup) ο繼續 培養兩周觀察煙草的草甘膦抗性,敏感的植株葉片出現黃花,而抗性植株生長正常，共獲得了 5株。實施例12.轉基因抗/耐草甘膦黃瓜的獲得
菌株培養從平板上挑取含構建好的植物表達載體的根癌農桿菌單菌落接種于5 mlLB+50 mg/L卡那霉素(Kan)的培養液中，于28°C，200 r/min條件下培養16h后，轉接到新鮮的90 ml LB+50 mg/L卡那霉素的培養液中，在同樣的條件下繼續培養至對數生長期時(4 5h，OD ^ O. 8 I. 2)，用液體MS洗滌3次后，重懸于MS液體培養基中，使其OD值為O. 2 O. 3即可用于轉化。愈傷組織誘導和植株再生將黃瓜種子浸入75%的乙醇中處理30 S，再用次氯酸鈣溶液處理15 min，無菌水沖洗5次，播種在發芽培養基上，25°C黑暗萌發。取萌發2 3天的黃瓜子葉，切成5 _方塊，與處于對數生長期經MS培養基適當稀釋的農桿菌(含有LsEPSPS基因)共浸染一定時間，將浸染后的外植體置于再生培養基上，24 25°C暗培養2天，再轉至含羧芐青霉素和一定濃度草甘膦的誘芽培養基，24 25°C暗培養2 3周，進行愈傷組織分化。由子葉產生的愈傷組織獲得的抗性芽，轉至1/2MS培養基(含羧芐青霉素和一定濃度草甘膦)獲得轉化植株。實施例13.轉基因抗/耐草甘膦月季的獲得
月季成熟小葉外植體葉背朝下接種到添加了 2，4-D0. 5mg/L和pCAP3. Omg/L的愈傷組織誘導培養基上，光照條件下培養20d。將繼代20 30d的新鮮愈傷組織置于農桿菌菌液(OD600=O. 8)中侵染20min，，然后倒出愈傷組織，在無菌濾紙上適當晾干后接入含IOOuM AS、改良1/2MS鹽類的共培養培養基中，25°C黑暗條件下共培養，用EHA105浸染的培養物共培養3 4d，以愈傷組織周圍農桿菌長至肉眼可見菌落時為好。共培養結束后，愈傷組織用無菌水清洗I 2遍,在無菌濾紙上晾干后接入含70mg/L潮霉素和300mg/L頭孢霉素的選擇培養基，25°C黑暗條件下選擇培養，2 3周繼代一次，進行抗性愈傷的選擇和增殖。對選擇3個月的抗性愈傷組織進行⑶S反應檢測，一團抗性愈傷組織上的不同部分呈現深藍色，淺藍色或無藍色反應，表現為明顯的嵌合體。PCR檢測，抗性愈傷組織中能擴增出目的片段。對抗性愈傷組織進行擴繁，然后進行再生植株的誘導和檢測。實施例14.轉基因抗/耐草甘膦狗牙根的獲得
狗牙根莖節的分生能力強，選用含莖節長約O. 5 1.0 Cm的莖段為外植體。用自來水洗凈表面，70%酒精浸泡30s，無菌水沖洗3次，O. 1%氯化汞消毒lOmin，無菌水沖洗3次。取滅菌過的濾紙，吸干表面水分，接種于誘導培養基。愈傷組織的誘導以含2，4-D2mg/L+NAA3mg/L+6-BA0. 2mg/L的MS培養基。繼代培養2周，然后轉移至含6_BA3mg/L+KT4. Omg/LMS分化培養基。置于28°C、16h光照、光10 SOuEn^s—1的人工氣候室分化，每2周以相同培養基繼代I次。將分化的小植株接于含ΝΑΑ0. 3mg/L的MS生根培養基，經2周生根培養后移至不含激素的1/2MS培養基壯苗，爾后移栽。取OD6tltl O. 5的農桿菌菌液，25 V浸泡lOmin，用滅過菌的濾紙吸去多余菌液，放入MS誘導培養基，暗條件共培養2d，然后用含Carb500mg/L的無菌水清洗愈傷。50mg/L潮霉素用作篩選物質,經3輪篩選,再生的植株苗長約15cm時轉移至溫室煉苗2周，成活后進行⑶S組織化學染色和PCR鑒定，獲得了陽性植株，移栽在網室自然生長。實施例15.抗LsEPSPS單克隆抗體的制備
將含有重組載體的單克隆表達菌落TRl (由實施例4所述)置于LB培養液(含有氨節青霉素100mg/L)中，37°C，300rpm培養，至細菌生長達到對數生長晚期后，加入終濃度為 O.025mmol/L的IPTG，22°C低溫誘導表達8h，離心lOOOOrpm，lOmin，收集菌體，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸5min，進行12%SDS — PAGE鑒定，使之在大腸桿菌BL21 (DE3)中獲得高效表達。將制備的菌體經過超聲破碎之后，以4°C，12，OOOrpm離心20分鐘，收集上清，進行親合層析純化。采用純化的重組EPSPS抗原免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾臟B淋巴細胞小鼠骨髓瘤細胞SP2/0在聚乙二醇(PEG)作用下進行融合，通過ELISA篩選穩定分泌抗LsEPSPS的單克隆雜交瘤細胞株。將雜交瘤細胞株注入小鼠腹腔，生的腹水中含有高效價的單克隆抗體。用飽和硫酸銨法純化腹水IgG。實施例16.變異來源和蛋白表達來源LsEPSP分子的草甘膦抗性鑒定
LsEPSP可以用來人工引入個或多個變異而獲得保持有抗草甘膦能力的LsEPSP變異分子。例如利用低保真PCR的方法可以產生很多LsEPSP變異分子，而這些變異分子可以通過草甘膦篩選獲得繼續保持有抗草甘膦能力的LsEPSP變異分子。密碼子具有簡并性除了甲硫氨酸和色氨酸外，每一個氨基酸都至少有兩個密碼子。這樣可以在一定程度內，使氨基酸序列不會因為某一個堿基被意外替換而導致氨基酸錯誤。LsEPSP基因翻譯得到的氨基酸序列推導其編碼的堿基序列，會得到多條與LsEPSP相似的序列，此序列亦具有草甘膦抗性。將人工合成LsEPSP相似序列以及由于低保真PCR擴增得到的變異的LsEPSP基因構建好PBI121-LsEPSP的植物表達載體并用凍融法轉入農桿菌EHA105，制備好已轉化了相應質粒的農桿菌菌液10ml，在轉化前ld，轉入大瓶培養過夜，第2d取出使用時菌液的0D600應當在I. 2到I. 6之間。室溫下5000r/m離心15min,棄上清液,將農桿菌沉淀懸浮于相應體積的滲透培養基中，使0D600在0. 8左右。將上述農桿菌懸浮液注人噴霧器中，對準植物的地上部分進行噴灑，直到植株上有水珠滴下時為止。用保鮮膜將這些植物(T0代植物)罩起來以保持濕度，置入培養室中培養，2到3d后可去掉保鮮膜，轉化后Iw左右方可澆水。繼續培養至植物成熟，收種子(Tl代)放在干燥環境中Iw左右，進行轉化子的篩選。將成功轉化的植株進行抗性鑒定，其具備草甘膦抗性，可以作為轉基因篩選標記。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
1.植物抗/耐草甘膦基因，該抗/耐草甘膦基因的核苷酸序列為SEQID NO USEQ IDNO 3 或 SEQ ID NO :5。
2.抗/耐草甘膦蛋白質多肽，該抗/耐草甘膦蛋白質多肽的氨基酸序列為SEQID NO2、SEQ ID NO 4,SEQ ID NO :6或為與上述氨基酸序列相比具有不小于84%相同性的氨基酸序列。
3.抗/耐草甘膦基因，該基因的核苷酸序列為編碼權利要求2所述的抗/耐草甘膦蛋白質的核苷酸序列。
4.抗/耐草甘膦基因，其特征在于該基因通過以下步驟制備 (1)將核苷酸序列為SEQID NO USEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5的基因通過人工引入一個或多個變異獲得變異分子； (2)利用草甘膦篩選步驟(I)中得到的變異分子，獲得抗/耐草甘膦基因。
5.包含權利要求1、3或4任一所述的抗/耐草甘膦基因的表達載體，所述表達載體為原核表達載體或植物轉化質粒。
6.包含權利要求1、3或4任一所述的抗/耐草甘膦基因的植物細胞。
7.包含權利要求6所述的植物細胞的抗/耐草甘膦植株。
8.權利要求I、3或4任一所述的抗/耐草甘膦基因在制備抗/耐草甘膦植株方面的用途。
9.根據權利要求8所述的抗/耐草甘膦基因在制備抗/耐草甘膦植株方面的用途，其特征在于包括以下步驟 (1)利用DNA充足技術，構建含有所述抗/耐草甘膦基因的植物轉化質粒； (2)將步驟(I)中構建的植物轉化質粒通過基因槍或農桿菌浸染方法或花粉介導法導入植物組織，利用草甘膦培養基篩選含有抗/耐草甘膦基因的植物細胞； (3)將步驟(2)中篩選的植物細胞進行分化獲得轉化芽，經過生根培養獲得植物種苗，從而得到所述抗/耐草甘膦植株。
10.權利要求I、3或4任一所述的抗/耐草甘膦基因作為植物轉基因篩選標記的用途。
全文摘要
本發明公開了一種抗/耐草甘膦基因及其應用。該抗/耐草甘膦基因的核苷酸序列為SEQIDNO1、SEQIDNO3或SEQIDNO5及其編碼的氨基酸序列分別為SEQIDNO2、SEQIDNO4或SEQIDNO6。利用該來自于植物的抗/耐草甘膦基因制備抗/耐草甘膦植株，可以明顯的顯示出抗/耐草甘膦除草劑，這為培育抗/耐草甘膦除草劑作物提供了新的選擇，增加抗/耐草甘膦除草劑轉基因技術的多樣性，從而降低了抗/耐除草劑轉基因技術的生態風險。
文檔編號A01H5/00GK102816777SQ20121032680
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月6日 優先權日2012年9月6日
發明者強勝, 毛嬋娟, 陳世國, 戴偉民, 宋小玲 申請人:南京農業大學