專利名稱：一種人工合成的耐草甘膦基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種人工合成的耐草甘膦基因及其應用，特別涉及一種根據玉米偏好密碼子設計并合成的耐草甘膦基因及其應用。
背景技術：
目前在植物轉基因育種中所應用的外源基因如Bt、EPSPS等，大多來自原核生物，由于原核生物基因自身的特點，如I)AT含量較高，超過60%，造成基因表達的mRNA在植物體內極易被降解；2)存在類似真核基因的內含子切點、轉錄終止子序列，造成轉錄不完整、mRNA異常剪切等；3)密碼子與植物密碼子存在較大差異，造成蛋白翻譯效率降低；4)其結構與植物等真核生物差異顯著，如不含有真核生物基因的5’ -UTR序列和3’末端的PolyA加尾序列，導致基因在植物體內往往表達水平較低。例如，來自于蘇云金芽孢桿菌的野生型殺蟲蛋白基因在植物中的表達量非常低，其表達的毒蛋白只占總蛋白的O. 001%或者幾乎檢測不到。美國 Monsanto 公司的 Perlak(Perlak F J, Fuchs R L, Dean D A, et ai. Modification of the coding SEQ ID NO. uence enhances plant expressingof insect control protein genes. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88 :3324-3328)和 Iannacone 等(Iannacoe R, Grieco P D, Cellini F. Specific SEQ ID NO. uencemodification of a cry3B endotoxin gene result in high levels of expression andinsect resistance. Plant Mol Biol,1997,34 :485-496)在不改變韋蛋白氛基酸序列的前提下，分別對殺蟲蛋白基因和cryIII基因進行了改造，選用植物偏愛的密碼子，増加GC含量，并去除原序列中存在的polyA和富含AT的ATTTA序列等不穩定元件序列，使轉基因植株中毒蛋白的表達量增加了 30 100倍，高達可溶性蛋白的O. 02 1%，獲得了明顯的抗蟲效果。雜草是農作物生產的大害，自1942年出現近代雜草防治技術以來，化學除草劑有了很大的發展。草甘膦類除草劑是ー種廣譜性、非選擇性除草剤，它通過抑制EPSPS (5-烯醇丙酮酰草酸-3_磷酸合酶，是植物體內芳香族氨基酸合成途徑中的ー個重要酶)的活性，阻斷了植物莽草酸途徑的生物合成，強烈抑制細胞分裂，對許多一年生和多年生雜草都具有強烈的抑制作用。由于草甘膦易于被微生物分解，在土壤中無殘毒，對動物無毒害，自從1976年Roundup研制成功以來，得到了廣泛的應用。但是，由于玉米等禾本科作物對草甘膦敏感，使其應用受到限制。因此，將耐草甘膦基因轉入玉米，不但可以擴大草甘膦的使用范圍，而且可降低生產成本，保護玉米免受藥害，最終達到增產增收的目的。盡管耐草甘膦基因G2-aroA已在2004年被發現，并在宿主熒光假單胞菌G2及大腸桿菌中都能高效表達，表現高耐草甘膦的特性(Yichen Sun, MinLin and Yiping Wang. Novel AroA witn high tolerance to blyposate, encoded by agene oi Pseudomonas putida 4G_lisolated from an extremeIypoIluted environmentin China. Aplied and environmental microbiology. 2005, 71 (8) :4771-4776),但其在植物，特別是重要的糧食作物中由于表達量較低而沒有被利用，因此急需對其在植物中的應用進行研究，如進行密碼子優化，以加速其應用到農業生產中。
發明內容
本發明的目的是提供ー種DNA分子，該DNA分子是耐草甘膦基因。本發明所提供的DNA分子，名稱為mG2-aroA，其核苷酸序列為序列表中序列2。根據需要，所述DNA分子的核苷酸序列也可為序列表中序列2的第1-1335位。所述DNA分子的核苷酸序列還可為與序列表中序列2或序列2的第1-1335位至少具有98%的同一性，且編碼序列9所不蛋白質(命名為G2_aroA蛋白)。其中，序列2由1338個核苷酸組成，其末尾處為兩個終止密碼子。序列2的第
1-1335位為編碼序列，編碼序列9所示的G2-aroA蛋白。序列9由444個氨基酸組成。 含有所述DNA分子的重組載體、重組宿主菌、重組細胞系或轉基因植物也屬于本發明的保護范圍。根據需要，所述重組載體既可為克隆載體，也可為表達載體；在本發明的一個實施例中，所述重組載體具體為PS3300-UMG2。在本發明的一個實施例中，所述重組宿主菌為攜帶有所述DNA分子的農桿菌，如LBA4404。所述重組細胞系可以為真核細胞，也可以為原核細胞，如植物細胞系。所述轉基因植物(如玉米)包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。由所述DNA分子轉錄所得的RNA也屬于本發明的保護范圍。上述DNA分子mG2-aroA在培育耐草甘膦轉基因玉米中的應用也屬于本發明的保護范圍。所述轉基因玉米包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。上述DNA分子mG2_aroA在提高玉米G2_aroA蛋白表達量中的應用也屬于本發明的保護范圍。所述G2-aroA蛋白為序列表中序列9所示的蛋白質。本發明針對原核生物耐草甘膦基因G2-aroA(序列I)在植物中表達較低的問題，在保持原氨基酸序列不變的前提下，采用玉米偏好性密碼子對其進行優化，去除影響RNA穩定性的結構(如polyA、重復序列、AT和GC串聯重復、RNAニ級結構、核糖體結合位點等)，増加GC含量等，使其在玉米中高效穩定表達。實驗證實，與原始G2-aroA基因(序列I)的轉基因玉米相比，本發明所提供的人工合成的耐草甘膦基因(序列2)的轉基因玉米，其G2-aroA蛋白的表達量明顯提高，每克(鮮重)葉片中G2-aroA蛋白的表達量可達15. 057 μ g，遠高于原始G2_aroA基因轉基因玉米的3.735yg。同時，與原始G2-aroA基因(序列I)的轉基因玉米相比，本發明所提供的人工合成的耐草甘膦基因(序列2)的轉基因玉米對草甘膦的耐受性也明顯提高，轉入mG2-aroA基因的T6代植株，在玉米5_6葉期噴施800ml/畝農達后，無明顯的藥害，表現正常，后期的生長期內均無藥害反應；而轉入G2-aroA基因的T6代植株，在800ml/畝農達處理后，藥害非常嚴重，植株均表現黃化、畸形，后期植株生長期內大部分表現雄穗不分化、雌穗不吐絲或者植株矮小。
圖I為載體pUC19-UG2的質粒圖譜。圖2為載體pCAMBIA3300的質粒圖譜。圖3為載體pS3300的質粒圖譜。
圖4為重組表達載體pS3300-UG2的質粒圖譜。圖5為重組表達載體pS3300-UMG2的質粒圖譜。圖6為重組載體pS3300-UG0的質粒圖譜圖7為T6代G2_aroA轉基因玉米的PCR鑒定圖譜。其中，泳道I為陽性對照；泳道2為DNA Marker (D2000);泳道3為空白對照組；泳道4為未轉基因的玉米植株(陰性對照2);泳道5-15為11株轉入G2-aroA基因的T6代轉基因玉米植株。圖8為T6代mG2-aroA轉基因玉米的PCR鑒定圖譜。其中，泳道I為陽性對照；泳 道2為DNA Marker (D2000);泳道3為空白對照組；泳道4為未轉基因的玉米植株(陰性對照2);泳道5-24為20株轉入mG2-aroA基因的T6代轉基因玉米植株。圖9為T6代G2_aroA轉基因玉米植株和T6代mG2_aroA轉基因玉米植株的草甘膦耐性田間鑒定圖。其中，A為mG2-aroA轉基因玉米植株、空載體轉基因植株和未轉基因植株；B為mG2-aroA轉基因玉米植株和G2_aroA轉基因玉米植株。A和B中，I所示一行玉米為mG2-aroA轉基因玉米植株；2所示一行玉米為G2_aroA轉基因玉米植株；3所示一行玉米為空載體轉基因玉米植株；4所示一行玉米為未轉基因的玉米植株。圖10為雙抗夾心ELISA檢測G2_aroA蛋白濃度的標準曲線。圖11為純化后G2_aroA蛋白SDS-PAGE電泳鑒定圖。其中，泳道I為蛋白Marker，自上到下依次為72KD、45KD、32KD、14. 4KD ;泳道2_4均為原核重組表達載體pET-28a-G2_aroA中表達后純化所得的G2-aroA蛋白，上樣量分別為5μ 1、10μ 1、15μ I。圖12為SDS-PAGE檢測純化后單克隆抗體的純度。其中，泳道I為蛋白Marker ；泳道2為純化后的單克隆抗體，較大的目的條帶為重鏈，較小的目的條帶為輕鏈。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、密碼子優化型耐草甘膦基因的獲得本實施例根據G2_aroA基因(中國專利，申請號03826892. 2，授權公告號CN100429311C)的氨基酸序列(核苷酸序列如序列表中序列I所示)，在保證氨基酸序列不變的前提下，首先采用玉米偏好密碼子對G2-aroA基因進行人工優化改造。盡量避免使用玉米稀有密碼子，并調整了密碼子的使用頻率(表I)。在此基礎上，去除DNA序列中存在的典型的造成植物基因轉錄本不穩定的富含AT序列，并去除了發夾結構，得到的新的核苷酸序列為序列表中序列2。序列2與G2-aroA基因(序列I)同源性只有84%，而G+C含量由原來的64. 83%降低到62. 07%。序列2所示基因即為密碼子優化型耐草甘膦基因，將其命名為mG2-aroA。密碼子在G2_aroA基因和mG2_aroA基因中的使用頻率見表I。為方便克隆，發明人在序列2的5’端引入BamHI酶切位點，在3’端引入Kpn I酶切酶切位點，最終序列如序列表中序列3所示。序列3的第7-1344位即為序列2。序列I、序列2的第1-1335位，以及序列3的第7-1341位均編碼序列，均編碼序列表中序列9所示蛋白，將該蛋白命名為G2_aroA蛋白。表I玉米優選密碼子標準
權利要求
1.DNA分子，其核苷酸序列為序列表中的序列2。
2.根據權利要求I所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中序列2的第1-1335位。
3.根據權利要求I或2所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子的核苷酸序列與序列表中序列2或序列2的第1-1335位至少具有98%的同一性，且編碼序列9所示蛋白質。
4.含有權利要求I或2或3所述DNA分子的重組載體。
5.含有權利要求I或2或3所述DNA分子的重組宿主菌。
6.含有權利要求I或2或3所述DNA分子的重組細胞系。
7.含有權利要求I或2或3所述DNA分子的轉基因植物。
8.由權利要求I或2或3所述DNA分子轉錄所得的RNA。
9.權利要求I或2或3所述的DNA分子在培育耐草甘膦轉基因玉米中的應用。
10.權利要求I或2或3所述DNA分子在提高玉米G2-aroA蛋白表達量中的應用；所述G2_aroA蛋白為序列表中序列9所不蛋白質。
全文摘要
本發明公開了一種人工合成的耐草甘膦基因及其應用。本發明所提供的基因的核苷酸序列為序列表中序列2。與所述原核生物耐草甘膦基因G2-aroA的轉基因玉米相比，本發明所提供的人工合成的耐草甘膦基因的轉基因玉米，其G2-aroA蛋白的表達量明顯提高；同時對草甘膦的耐受性也明顯提高。
文檔編號C12N15/84GK102676553SQ20121010707
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者劉素霞, 姜付坤, 宋哲, 連肖華, 鄧德芝, 韓庚辰 申請人:北京奧瑞金種業股份有限公司