一種檢測rage家族基因標簽單核甘酸多態性位點的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測人糖基終末化產物受體（RAGE）家族基因標簽單核甘酸多態性位點的方法及試劑盒，所述方法具體為：根據被證實的RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點，設計特異性擴增引物和測序引物，其中，所述特異性擴增引物中的一條用生物素標記；以待測標本的DNA為模板，用特異性擴增引物進行PCR反應，得PCR擴增物；將所得PCR擴增物采用堿變性分開成單鏈，取其中生物素標記單鏈PCR擴增產物純化后，與所述測序引物進行雜交反應，并分析結果；本發明所選取的RAGE靶序列，以及應用本發明的試劑盒能夠實現快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的檢測RAGE標簽單核甘酸多態性基因型，能夠滿足臨床檢驗實際工作的需要，利于RAGE基因檢測預測疾病的發生、發展風險。
【專利說明】一種檢測RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的方法及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，具體涉及適用于雙重PCR結合雙重焦磷酸測序技術檢測RAGE家族基因標簽SNP位點的試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002]糖基化終產物受體(RAGE)是一個細胞表面分子的免疫球蛋白超家族的有多重配體的成員。自1992年被成功分離以后，越來越多的研究表面RAGE在血管疾病的發病機制中起著重要作用。RAGE不僅在大血管病變的發生過程中起放大血管炎癥，加速動脈粥樣硬化的作用，還作為一個開關調控著參與血管病變的各種信號的傳遞過程。不同的生化因素及信號通路產生的信號分子最終都必須通過活化RAGE通路才能參與到糖尿病血管病變過程中去。近幾年，RAGE在膿毒癥發病機制中的作用也日益受到重視。動物實驗發現，盲腸結扎穿孔所致的膿毒癥模型中，RAGE+小鼠的存活率顯著高于野生型小鼠。即使在致膿毒癥模型24小時后注射RAGE的單克隆抗體，仍然可以顯著降低小鼠的死亡率。Bopp C等也發現膿毒癥患者血漿sRAGE水平顯著升高，且與患者臨床結局密切相關。這些研究結果提示，RAGE是膿毒癥發病環節中的重要分子。
[0003] 單核甘酸多態性(SNP)是指染色體上單個核苷酸變異引起的群體中DNA序列多態性，具有密度高、遺傳穩定、易于自動化分析等特點，被認為是繼限制性片段長度多態性、微衛星多態性之后的第三代遺傳標記，可用于基因定位、多態性分析等方面，是研究疾病遺傳易感性、疾病診斷、藥物篩選等的常用指標。目前已發展了 20余種SNP檢測方法，如直接測序法、探針雜交法、飛行質譜分析法、限制性片段長度多態性分析法等，但因這些方法的費用、準確性和適用規模等方面的缺點，局限了基因多態性與疾病發生、發展和預后的遺傳關聯研究。而焦磷酸測序技術是新一代基于酶級聯反應的DNA序列分析技術，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協同作用下，將DNA單鏈上的每一個dNTP聚合與一次熒光信號釋放偶聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。該技術具有其獨特的優勢，無需電泳、DNA片段無需熒光標記；具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量、靈敏度高等特點，符合臨床大樣本檢測要求。
【發明內容】
[0004]本發明的目的之一在于提供RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的檢測方法，其能夠簡捷、直觀、準確的對RAGE標簽單核苷酸多態性基因型進行檢測和判讀結果。
[0005]為實現上述目的，本發明的技術方案為:
[0006]一種檢測RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的方法，具體包括以下步驟:1)特異性引物的設計，即根據被證實的RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點，設計特異性擴增引物和測序引物，其中，所述特異性擴增引物中的一條用生物素標記；2) PCR擴增，SP以待測標本的DNA為模板，用步驟I)所述的特異性擴增引物進行PCR擴增，得PCR擴增物；3)焦磷酸測序，即將步驟2)所得PCR擴增物采用堿變性使其分開成單鏈，取其中被生物素標記的單鏈PCR擴增產物純化后，與步驟I)所述測序引物進行雜交反應，并分析結果以判斷所述待測標本的RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點靶單核甘酸是否具備多態性。本技術方案的創新點主要在首次采用采用焦磷酸測序法檢測RAGE家族基因的單核甘酸多態性。
[0007]進一步，所述的一種檢測RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的方法，步驟I)中，所述的RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點包括:rsl800625和rs2070600位點。上述位點是通過如下方法獲得的:利用HapMap(http://www.hapmap.0rg)SNP數據庫(HapMapData Rel28Phase II+III, AuglO, on NCBI B36assembly, dbSNP bl26)下載 RAGE 基因及其上下游3kb范圍內中國北京漢族人群(CHB) SNP數據:1)檢索框輸入基因名查看各基因在HapMap定位，并上下游各延伸3kb ；2) “Reports&Analysis”的選項中選擇:Download SNPgenotype data ;3) “conf ig”中選擇中國北京漢族人群(Chinese Han Bei jing, CHB),獲取中國北京漢族人群RAGE家族各基因及其延伸區域內所有SNP位點。在TAGster軟件包目錄下打開程序運行窗口。按照構建bin和挑選標簽SNP標準(最小等位基因頻率≥0.05且SNP間連鎖關系r2≥0.8)設置參數，運行命令“fconverCTAGster”，即可出現研究區域的bin圖和對應bin的標簽SNP。利用NCBI下載各基因啟動子(基因上游3kb)區域SNP位點的序列。將野生型和突變型的序列分別提交到轉錄因子預測數據庫TFSEARCH (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html),得到可能與之結合的核轉錄因子,并比較SNP位點對轉錄因子結合的影響。綜合SNP間連鎖強度和生物信息學分析最終確定檢測的RAGE基因的rsl800625和rs2070600位點2個標簽SNP位點。
[0008]所述rsl800625位點的上游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，測序引物如SEQ ID NO:3所示；所述rs2070600位點的上游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，下游擴增引物的核苷酸序列如SEQID NO:5所示，測序引物如SEQ ID NO:6所示。
[0009]詳見下表:
[0010]
【權利要求】
1.一種檢測RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的方法，其特征在于，具體包括以下步驟: 1)特異性引物的設計 根據被證實的RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點，設計特異性擴增引物和測序引物，其中，所述特異性擴增引物中的一條用生物素標記； 2)PCR擴增 以待測標本的DNA為模板，用步驟I)所述的特異性擴增引物進行PCR擴增，得PCR擴增物； 3)焦磷酸測序 將步驟2)所得PCR擴增物采用堿變性使其分開成單鏈，取其中被生物素標記的單鏈PCR擴增產物純化后，與步驟I)所述測序引物進行雜交反應，并分析結果以判斷所述待測標本的RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點是否具備多態性。
2.根據權利要求1所述的一種檢測RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的方法，其特征在于:步驟1)中， 所述的RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點包括:rsl800625和rs2070600 位點。
3.根據權利要求2所述的一種檢測RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的方法，其特征在于: 所述rsl800625位點的上游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，測序引物如SEQ ID NO:3所示；所述rs2070600位點的上游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，下游擴增引物的核苷酸序列如SEQID NO:5所示，測序引物如SEQ ID NO:6所示。
4.根據權利要求2所述的一種檢測RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的方法，其特征在于:所述步驟2)中，所述PCR擴增為所述rsl800625位點和所述rs2070600位點組合進行雙重PCR擴增。
5.根據權利要求4所述的一種檢測RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的方法，其特征在于:所述步驟3)中，對所述rsl800625位點和所述rs2070600位點組合進行雙重焦磷酸測序。
6.用于檢測RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的特異性擴增引物，RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的焦磷酸測序引物，以及PCR反應液、PCR產物篩選液、焦磷酸測序反應液。
7.根據權利要求6所述的用于檢測RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的試劑盒，其特征在于，所述特異性擴增引物如SEQ ID NO: 1-2所示，和/或如SEQ ID N0:4_5所示。
8.根據權利要求6所述的用于檢測RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的試劑盒，其特征在于，所述測序引物如SEQ ID NO:3所示，和/或如SEQ ID N0:6所示。
9.根據權利要求6所述的用于檢測RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標記所述特異性擴增引物的生物素。
【文檔編號】C12Q1/68GK103642920SQ201310659976
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月9日 優先權日:2013年12月9日
【發明者】曾靈, 蔣建新, 杜娟, 王海燕, 顧瑋, 岳彩黎 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院