一種重組人α干擾素的制備方法

專利名稱：一種重組人α干擾素的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種干擾素的制備方法，特別是涉及一種應用柱上復性的方法制備重組人α干擾素的方法。
背景技術：
干擾素是由細胞分泌的小分子多肽，具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤和免疫調節等多種生物學活性。是當今應用前景較為廣闊的生物治療藥物之一，是迄今為止最早應用基因工程技術進行大規模商業化生產，并經長期臨床應用驗證的第一個細胞因子。按照干擾素的生化特性及在機體免疫方面所發揮的不同作用，被分為α、β、γ等三類。目前市場上應用最多的干擾素是重組人α干擾素。
通過細菌表達制備干擾素α的方法是已知的。常規方法基于蛋白質在大腸桿菌(E.Coli)中表達后以包涵體的形式或直接存在于細胞質中。對于以包涵體形式存在的干擾素，由于蛋白分子不能正確折疊而沒有生物活性，必須從細胞內分離出包涵體，采用高濃度變性劑溶解包涵體，然后除去變性劑或降低變性劑的濃度，使包涵體蛋白得以復性，再進行離子交換層析、親和層析、反相高效液相層析、分子排阻層析等步驟純化才能獲得可用于臨床的制品。其中包涵體蛋白的復性和純化是整個過程中的核心。
目前重組蛋白生產中普遍存在的問題是(1)復性效率低。傳統的復性方法包括稀釋法和透析法。稀釋復性法對樣品幾十倍，甚至上百倍的稀釋會使樣品的體積急劇增大，給后續的分離純化帶來很大的困難，而且復性過程中需要較大的復性容器。透析法耗時較長，而且要多次更換透析溶液。這兩種方法的共同缺點是蛋白質在復性過程中會發生聚集而產生大量沉淀，復性效率低，通常蛋白質的活性回收率只有5～20％，而且復性后的蛋白質溶液中含有大量的雜蛋白，需要進行進一步的分離純化。(2)生產成本高，設備投資大。由于復性和分離純化分別單獨進行，而且分離純化步驟多，每一步都需要有與之配套的設備，致使設備投資大，生產成本高。隨著生產規模的增加，這種弊端會愈來愈嚴重。
上世紀九十年代初，我國首先有報道將高效疏水相互作用色譜(HPHIC)用于變性蛋白的復性，很好的解決了上述問題，現已成功用于重組人干擾素γ、重組人粒細胞集落刺激因子、重組牛朊病毒等重組蛋白的純化工藝中。此后，排阻色譜法、離子交換色譜法和親合色譜法也有用于蛋白質的復性和同時純化中。但應用金屬螯合色譜法對重組人α干擾素同時進行復性和純化的方法尚未見報道。金屬螯合色譜法應用金屬離子Cu2+、Zn2+或Ni2+等可以與蛋白質分子中的色氨酸、組氨酸和半胱氨酸之間形成配價鍵的原理，使含有這些氨基酸的蛋白被這種金屬螯合親和色譜的固定相吸附。
與傳統的稀釋法及透析法比較，用金屬螯合色譜法進行干擾素復性的優點是①在進樣后可很快除去變性劑；②由于金屬離子對變性蛋白質的吸附，可明顯地減少、甚至完全消除復性過程中蛋白質聚集體和沉淀的產生，從而提高蛋白質復性的質量，顯著降低聚體和單體雜質含量；③在蛋白質復性的同時可使目標蛋白質與雜蛋白分離以達到純化的目的，使復性和純化同時進行；④便于回收變性劑，以降低廢水處理成本。簡言之，金屬螯合色譜法復性可以提高重組人干擾素α的純度、降低雜質含量，將蛋白復性和純化集成在一步操作完成，縮短了操作步驟和生產時間，減少了設備投資，使生產成本大大降低。

發明內容
本發明的目的是提供一種制備干擾素的方法。本發明進一步提供一種應用柱上復性的方法制備重組人α干擾素的方法。
具體步驟包括1)細菌細胞的發酵，2)包涵體的提取和純化，3)金屬螯合色譜法復性和純化包涵體，4)反相高效液相層析，5)離子交換層析，6)凝膠排阻層析。
本發明要求保護的方法用于制備重組人干擾素α2a，但對重組人干擾素α2b和重組人干擾素α1b等其它α型重組人干擾素也同樣有效。
本發明不限于使用大腸桿菌，也包括使用能夠表達包涵體形式的異源蛋白的任何原核微生物。
本發明的另一目的是依靠本方法可獲得重組人α干擾素，其含有的細菌污染物不高于0.0005％，且其它聚體或單體形式的雜質不高于1.0％。
發明詳述表達重組人α干擾素的大腸桿菌基因工程菌株按照常規方法獲得。簡要描述如下將人α干擾素基因片段連接入商業化原核表達質粒中，這些質粒包括但不限于pTrc、pBAD、pTac、pET、pT7、pL等；將重組質粒轉染入宿主菌，這些宿主菌包括但不限于DH5α、JM109、JM103、HB101等。
步驟1發酵本發明方法中進行發酵的菌株在使用之前以冷凍干燥物形式保存以維持其表達能力。使用時，用適當緩沖溶液溶解后接種于固體培養基上，擴大至所需要量后開始發酵。
發酵條件包括合適的培養基、溫度、pH值、溶解氧等。發酵培養基是商業化且可以有效使用的已知培養基。優選的是含有蛋白胨、酵母提取物、甘油、磷酸緩沖鹽等的混合培養基。培養基中添加一種或幾種抗生素。優選的是50-200μg/ml的氨芐青霉素。發酵溫度是適宜原核微生物生長的30-42℃。本發明中優選的是37℃。發酵期間pH應保持在中性(6.4-7.4)。發酵過程中罐壓為常壓，溶解氧保持在20-60％，優選的是50％。由于在攪拌下進行發酵，優選使用消泡劑。
發酵過程中，隨著微生物生長，培養物的光密度增加。根據光密度可以監測發酵進展程度。通常選擇測量光密度的波長為600nm。本發明的方法中，將微生物培養至對數期時開始誘導表達。通常微生物在這一時期600nm的光密度可達到1以上，本發明中優選的是光密度達到15以上時開始誘導。根據所選用的質粒，誘導的方法包括加入誘導劑或改變培養溫度。誘導時間2-10小時，本發明中優選的是加入誘導劑異丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導3-6小時。
誘導結束后，離心培養物，取細胞進行下列步驟。
步驟2提取和純化包涵體表達的重組人α干擾素以不溶解的包涵體的形式存在于細胞質中。因此，本發明提供了細胞裂解、包涵體回收和洗滌。
洗滌細胞并懸浮于適當的緩沖液中，優選含有0.001mol/L乙二胺四乙酸及其鈉鹽(EDTA)和二硫蘇糖醇(DTT)的中性或弱堿性(pH6.5-9.0)緩沖液。用凍/融、弗氏壓碎器、超聲處理或其它類似已知技術裂解細胞。向裂解后的細胞懸浮液中加入上述緩沖液。低溫(2-10℃)高速(10000-15000rpm)離心10-40分鐘，棄掉上清液，沉淀用上述緩沖液懸浮。重復離心和懸浮步驟。獲得的包涵體用含有DTT的變性劑溶解。本發明中優選的是含有0.001mol/L DTT的8mol/L尿素(pH6.5-9.0)。
步驟3包涵體的復性和純化溶解的包涵體裝入金屬螯合層析柱。可以使用任何商業化的金屬螯合層析介質，只要其容量、填料和流速的特征類似于Copper Chelate Sepharose層析柱、Zinc Chelate Sepharose層析柱等。本發明優選的是Copper Chelate Sepharose層析柱。應用含有DTT的變性劑洗滌并平衡該色譜柱，復性是通過降低變性劑的濃度并在適當濃度的氧化劑存在下實現的。本發明中優選的是用5-20倍柱體積的線性梯度由8mol/L尿素-0.001mol/L DTT過渡到0.05mol/L尿素-0.005mol/L谷胱苷肽，最后用0.15mol/L NaCl(pH2.5)洗脫蛋白。通過測定280nm的吸光度來自動監測各物質的洗脫。
步驟4反相高效液相層析收集富含活性形式的重組人α干擾素的來自前面步驟的組分裝入反相高效液相層析(RP-HPLC)柱上。可以使用任何商業化反相高效液相層析介質，只要其容量、填料和流速的特征與本發明所述方法條件相容。本發明中優選的是C18。應用有機溶劑梯度洗脫可以實現單體或聚體雜質及其它細菌污染物與目的蛋白的有效分離。本發明優選的是用5-20倍柱體積的線性梯度由0過渡到80％乙腈。
步驟5離子交換層析收集富含活性形式的重組人α干擾素的來自前面步驟的組分裝入離子交換層析柱上。可以使用任何商業化離子交換層析介質，只要其容量、填料和流速的特征與本發明所述方法條件相容。本發明中優選的是Q-Sepharose或DEAE-Sepharose。應用無機鹽等度洗脫可以除去部分雜質并將目的蛋白濃縮。本發明優選的是用0.1-0.3mol/L NaCl洗脫目的蛋白。
步驟6凝膠排阻層析收集富含活性形式的重組人α干擾素的來自前面步驟的組分裝入凝膠排阻層析柱上。可以使用任何商業化凝膠排阻層析介質，只要其容量、填料和流速的特征與本發明所述方法條件相容。本發明中優選的是Sephacyl S-200。應用凝膠排阻的特性可以除去單體或聚體雜質并去除殘余的有機溶劑或無機鹽。本發明優選的是用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫目的蛋白。
按照上述方法獲得的重組人α干擾素中大腸桿菌污染物不高于0.0005％，純度可達到99％以上，比活性可達到2×108國際單位/mg蛋白。
具體實施例方式
下面依靠實施例描述本發明，然而，實施例僅僅舉例說明，沒有限制的目的。
實施例1發酵下列步驟涉及發酵和誘導重組人α2a干擾素的方法。
材料培養基由下列組成(每1L)蛋白胨 12g酵母提取物 24g甘油 4mlKH2PO42.31g
K2HPO412.54g50％MgSO4.7H2O 4ml純化水加適量至1L。
大腸桿菌菌株是DH5αpETIFN。
接種取一管冷凍干燥的DH5αpETIFN懸浮于1ml上述培養基中。懸液涂布LB平板，37℃培養35-50小時后接種于含50μg/ml氨芐青霉素的上述培養基中，置搖床100-300轉/分、37℃培養5-10小時，再擴大至接種發酵罐的需要量。
在下列條件下實施發酵培養基上述培養基+50μg/ml氨芐青霉素+10μl/L消泡劑溫度37℃溶解氧50％pH6.4-7.4誘導在下列條件下實施誘導OD600大于15誘導劑1mM IPTG誘導時間3-6小時誘導期間pH值、溫度和溶解氧與發酵期間相同。
誘導結束后3000g離心20min收集菌體。
實施例2提取和純化包涵體材料
裂解液0.05mol/L Tris.HCl-0.001mol/L EDTA-0.001mol/L DTT(pH7.5)變性溶液0.05mol/L Tris.HCl-8mol/L尿素-0.001mol/L DTT(pH7.5)超聲處理裂解細胞。向裂解后的細胞懸浮液中加入裂解液。低溫(2-10℃)高速(14000rpm)離心30分鐘，棄掉上清液，沉淀用裂解液懸浮。重復離心和懸浮步驟3次。獲得的包涵體用變性溶液溶解。
實施例3包涵體的復性和純化材料和參數波長280nm層析介質Copper Chelate Sepharose上柱樣品溶解的包涵體，體積不超過柱體積的10倍流速1cm/min緩沖液A0.05mol/L Tris.HCl-8mol/L尿素-0.001mol/L DTT(pH7.5)緩沖液B0.05mol/L Tris.HCl-0.05mol/L尿素-0.005mol/L谷胱苷肽(pH7.5)緩沖液C0.15mol/L NaCl(pH2.5)溶解的包涵體裝入金屬螯合層析柱。用緩沖液A洗滌并平衡該色譜柱。接著用15倍柱體積的線性梯度由緩沖液A過渡到緩沖液B，最后用緩沖液C洗脫蛋白。通過測定280nm的吸光度來收集洗脫峰。
實施例4反相高效液相層析材料和參數波長280nm層析介質C18，30μm上柱樣品前面步驟(實施例3)含活性形式的重組人α干擾素的洗脫峰流速1.5cm/min緩沖液A0.1％三氟乙酸-水緩沖液B0.1％三氟乙酸-乙腈收集來自前面步驟的洗脫峰裝入反相高效液相層析(RP-HPLC)柱上。用15倍柱體積的線性梯度由100％緩沖液A過渡到80％緩沖液B。通過測定280nm的吸光度來收集洗脫峰。
實施例5離子交換層析材料和參數波長280nm層析介質Q Sepharose上柱樣品前面步驟(實施例4)含活性形式的重組人α干擾素的洗脫峰流速1cm/min緩沖液A0.02mol/L Tris.HCl(pH7.0)緩沖液B0.02mol/L Tris.HCl-0.15mol/L NaCl(pH7.0)收集來自前面步驟的洗脫峰裝入離子交換層析柱上。用緩沖液A洗滌并平衡色譜柱，用緩沖液B洗脫目的蛋白。通過測定280nm的吸光度來收集洗脫峰。
實施例6凝膠排阻層析材料和參數波長280nm層析介質Sephcryl S-200上柱樣品前面步驟(實施例5)含活性形式的重組人α干擾素的洗脫峰流速0.5cm/min緩沖液0.01mol/L PB(pH7.0)收集來自前面步驟的洗脫峰裝入凝膠排阻層析柱上。用緩沖液洗滌并平衡色譜柱后洗脫目的蛋白。通過測定280nm的吸光度來收集洗脫峰。
實施例7污染物、純度和比活性測定殘余大腸桿菌蛋白測定
用抗大腸桿菌菌體蛋白抗體包被酶標板，封閉后加入樣品和菌體蛋白標準品，37℃孵育2小時，洗板后加入HRP酶聯抗大腸桿菌菌體蛋白抗體，37℃孵育1小時，洗板后加入底物，37℃孵育40分鐘，加入硫酸終止液終止反應，將酶標板放入酶標儀中，選擇492nm波長進行檢測，以標準品濃度A為X值，OD492nm為Y值，輸入回歸方程y＝a+bx中，計算得上述制備的重組人干擾素α2a樣品中菌體蛋白殘留量為0.0003％。
純度測定制備SDS-PAGE電泳膠，分離膠濃度為12.5％，濃縮膠濃度為4.5％。樣品和樣品緩沖液按3∶1的比例混勻后100℃水浴3-5分鐘，向加樣孔中加入樣品10μg。以恒流10mA開始電泳，當溴酚藍染料前沿進入分離膠后將電流調至20mA，直至溴酚藍染料到達分離膠底部。電泳膠進行考馬斯亮藍染色。用掃描儀進行掃描處理，上述制備的重組人干擾素α2a純度為99.6％。
比活性測定將生長24～48h的Wish細胞配成細胞濃度為2.5-3.5×105個/ml的細胞懸液，加到96孔細胞培養板上，每孔100μl。在含5％CO2的37℃孵箱中培養4-6h后，每孔加入4倍系列稀釋的干擾素樣品100μ1，樣品稀釋用含7％牛血清的RPMI1640培養液，37℃，5％CO2條件下培養18-24h。棄上清，用含3％小牛血清的RPMI1640培養液稀釋的VSV病毒(100TCID50)攻擊，然后于含5％CO2的37℃孵箱中培養20-24h。棄去培養板中的上清液，每孔加入50μl的結晶紫染色液，室溫放置30分鐘，用流水小心沖去染色液，并用濾紙吸干殘留水分。每孔加入100μl脫色液脫色，測定每孔A570和A630值。用量反應平行線法計算樣品活性。按Lowry法測定樣品的蛋白濃度，計算樣品的比活性。上述制備的重組人干擾素α2a的比活性2.3×108IU/mg蛋白。
權利要求
1.一種制備重組人α干擾素的方法，包括下列步驟1)對含有編碼人干擾素α的核苷酸序列的大腸桿菌進行發酵，2)提取包涵體，3)應用親和層析柱進行復性和純化，4)反相高效液相層析，5)離子交換層析，6)凝膠排阻層析，其特征在于步驟(3)中包涵體的復性在親和層析柱上完成并同時實現包涵體純化。
2.根據權利要求1的方法，其中所述的重組人α干擾素是重組人干擾素α2a。
3.根據權利要求1的方法，其中所述的親和層析柱是金屬螯合柱。
4.根據權利要求1和3的方法，其中所述的金屬螯合柱是銅離子螯合柱。
5.根據權利要求1、3、4的方法，其中所述的在銅離子螯合柱上進行復性的條件是降低變性劑的濃度并添加適當的氧化劑。
6.根據權利要求1、3、4、5的方法，其中所述的變性劑是尿素，還可以是鹽酸胍、十二烷基硫酸鈉，其中的氧化劑是谷胱苷肽。
7.根據權利要求1的方法，其中所述的離子交換層析介質是Q-Sepharose，還可以是DEAE-Sepharose、Source 15 Q、Source 30 Q。
8.根據權利要求1的方法，其中所述的反相高效液相層析介質是C18，還可以是C4、C8、Source 15 RPC、Source 30 RPC。
9.根據權利要求1的方法，其中所述的凝膠排阻層析介質是SephacrylS-200，還可以是Sephacryl S-100、Sephacryl S-300、Superose 12、Superose 6、Sephadex G-150、Sephadex G-200、Superdex 200。
全文摘要
本發明公開了一種干擾素的制備方法。該方法包括對含有編碼人干擾素α的核苷酸序列的大腸桿菌進行發酵后提取包涵體，應用親和層析柱對包涵體進行復性和純化，之后進行離子交換層析、反相高效液相層析和凝膠排阻層析獲得高純度的重組人α干擾素。
文檔編號C12P21/02GK1876811SQ200510046590
公開日2006年12月13日 申請日期2005年6月6日 優先權日2005年6月6日
發明者陸軍, 趙會林, 婁競 申請人:沈陽三生制藥股份有限公司