一種nk和/或nkt細胞的培養方法

專利名稱：一種nk和/或nkt細胞的培養方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種NK和/或NKT細胞的培養方法。
背景技術：
NK細胞，是骨髓來源的淋巴細胞，可以識別并殺死病毒感染的細胞或轉化的惡性細胞。NK細胞是體內快速反應細胞，能迅速被募集至損傷部位，在體外I小時、體內4小時即可見到殺傷效應。NK細胞的功能是其他免疫細胞無法替代的，其殺傷腫瘤細胞的效應無MHC限制，因此稱為自然殺傷活性；而且，NK細胞通過分泌IFN-gamma以及與DC相互作用促進Thl型T細胞活化。體外培養的NK細胞包括⑶56弱表達和⑶56強表達伴隨⑶16表達或不表達細胞群。CD56強表達細胞群通過非MHC限制途徑殺傷腫瘤細胞；而CD56弱表達且⑶16+細胞群則通過⑶16-Fc途徑直接產生ADCC，且腫瘤相關抗原的刺激能進一步促進ADCC。鑒于NK細胞在抗腫瘤免疫中的重要功能，有必要開發一種有效的體外培養并大量擴增具有腫瘤殺傷活性的NK細胞的方法。 現有的NK細胞體外培養方法盡管已比較成熟，能夠培養出對腫瘤細胞殺傷性很高的NK細胞，但增殖數量還不夠滿意。IL-2、IL-15和IL-7可以通過與NK細胞表面的多聚蛋白體受體的結合而刺激細胞活化、增殖。此外，一些研究還發現這三種細胞因子與NK細胞的分化相關。然而，在培養基中僅添加IL-2、IL-15只能使NK細胞擴增10倍左右，并且通常需要飼養層細胞共同培養，操作復雜，細胞得率低。RetroNecinn是TAKARA Bio Inc的專利產品，屬于重組人纖維連接蛋白片段，它含有人纖維連接蛋白CS-I位點和central cell-binding domain,分子量約為63K,其生理活性為參與細胞的附著、伸展、分化和增殖。RetroNectin的CS-Isite及centralcell-binding domain可與T細胞表面的VLA結合,從而刺激細胞大量繁殖。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種培養NK和/或NKT細胞的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟將離體的NK和/或NKT細胞接種到如下培養體系A中培養，即得到增殖的NK和/或NKT細胞；所述培養體系A為如下I)或2):I)所示培養體系A由抗⑶3抗體、Retronectin、培養基和誘導因子組成；2)所示培養體系A由抗⑶3抗體、培養基和誘導因子組成。所述抗⑶3抗體與所述培養基的配比為5 μ g 5ml;所述Retronectin與所述培養基的配比為25 μ g : 5ml;所述誘導因子為IL-2和IL-15 ；所述IL-2在所述培養體系A中的濃度為800-1200IU/ml，所述IL-2在所述培養體系A中的濃度具體為1000IU/ml ；
所述IL-15在所述培養體系A中的濃度為18ng/ml-22ng/ml,所述IL-15在所述培養體系A中的濃度具體為20ng/ml。I)所示培養體系A中的所述抗⑶3抗體和Retronectin由緩沖液A提供每2ml所述緩沖液A按照如下方法制備將25 μ g Retronectin、5 μ g抗⑶3抗體和濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補至2ml ；2)所示培養體系B中的所述抗⑶3抗體由緩沖液B提供每2ml所述緩沖液B按照如下方法制備將25 μ g Retronectin和濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補至2ml ；所述培養時間為70小時-74小時，所述培養時間具體為72小時，所述培養溫度為350C -38°C，所述培養溫度具體為37°C，所述培養所需CO2的濃度為4. 5% -5. 5% (體積百分含量)，所述培養所需CO2的濃度具體為5% (體積百分含量)。 在所述培養步驟后，還包括如下步驟將所述培養得到的細胞移入不含有抗⑶3抗體和Retronectin的培養體系B中繼續培養，得到增殖的NK和/或NKT細胞；所述培養體系B和所述培養體系A的區別為不含有抗⑶3抗體和Retronectin，其它組分和各組分濃度均相同。所述緩沖液A、所述緩沖液B和所述誘導因子均為獨立包裝。所述培養基為10% (體積百分含量)離體血漿的T503培養基，即為10% (體積百分含量)自體血漿的T503培養基；所述抗⑶3抗體為單抗或者多抗；所述抗⑶3抗體具體為Anti-⑶3 (單抗)。所述離體的血漿與所述離體的NK和/或NKT細胞來源于同一物種；所述物種具體為人或動物；所述離體的血漿與所述離體的NK和/或NKT細胞來源于同一個體。本發明的另一個目的是提供一種用于培養NK和/或NKT細胞的培養體系。本發明提供的用于培養NK和/或NKT細胞的培養體系，所述培養體系A為如下I)或2)I)所示培養體系A由抗⑶3抗體、Retronectin、培養基和誘導因子組成；2)所示培養體系A由抗⑶3抗體、培養基和誘導因子組成。所述抗⑶3抗體與所述培養基的配比為5 μ g : 5ml;所述Retronectin與所述培養基的配比為25 μ g : 5ml;所述誘導因子為IL-2和IL-15 ;所述IL-2在所述培養體系A中的濃度為800_1200IU/ml，所述IL-2在所述培養體系A中的濃度具體為1000IU/ml ；所述IL-15在所述培養體系A中的濃度為18ng/ml_22ng/ml，所述IL-15在所述培養體系A中的濃度具體為20ng/ml。I)所示培養體系A中的所述抗⑶3抗體和Retronectin由緩沖液A提供每2ml所述緩沖液A按照如下方法制備將25 μ g Retronectin、5 μ g抗⑶3抗體和濃度為0. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補至2ml ；
2)所示培養體系B中的所述抗⑶3抗體由緩沖液B提供每2ml所述緩沖液B按照如下方法制備將25 μ g Retronectin和濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補至2ml ；所述培養基為含10% (體積百分含量)離體血漿的T503培養基；所述抗⑶3抗體為單抗或者多抗；所述抗CD3抗體具體為Anti_CD3。所述緩沖液A、所述緩沖液B和所述誘導因子均為獨立包裝。所述抗⑶3抗體具體為Anti-⑶3。Anti-⑶3為抗⑶3抗體，為單克隆抗體，購自寶日醫生物技術(北京)有限公司進口產品，原產地古巴分子免疫學中心，商品名愛歐山，進口藥品注冊證號S20030084。 所述離體的血漿與所述離體的NK和/或NKT細胞來源于同一物種；所述物種具體為人或動物；所述離體的血漿與所述離體的NK和/或NKT細胞來源于同一個體。本發明的實驗證明，本發明的方法中，將RetroNectin引入NK細胞的培養體系，利用NK和NKT細胞同樣表達VLA的特點，通過Retronectin的刺激達到細胞大量增殖的效果，⑶3mAb可通過與T細胞表面的TCR結合刺激細胞增殖，由于NKT細胞表面也表達TCR分子，因此在培養體系中，還加入了⑶3mAb刺激細胞增殖。Retronectin和⑶3mAb還可以共同作用激活酪氨酸激酶PP125FAK，通過Ras途徑刺激細胞的增殖和分化。因此，將提取自外周血的PBMC經過磁珠分離富集后，獲得高純度的CD56+細胞，在體外培養體系中加入Retronectin和⑶3mAb兩種蛋白共同刺激，同時輔以IL-2和IL-15兩種因子誘導，建立一個可獲得大量具有高殺傷活力的NK和NKT細胞的培養方法。


圖I為磁珠富集前外周血⑶3和⑶56細胞表型分析圖2為磁珠富集后將用于培養的細胞⑶3和⑶56表型結果圖3為細胞培養14天的增值倍數圖4為細胞培養14天各組細胞⑶3，⑶16，⑶56表型圖5為細胞培養14天各組細胞中NK、NKT、T細胞的比例圖6為細胞培養14天各組細胞殺傷實驗結果圖7為細胞培養14天總細胞的殺傷效率
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、NK細胞的分離和培養I、蛋白包被Retronectin購自寶日醫生物技術(北京)有限公司，目錄號T200H ；Anti-⑶3為抗⑶3抗體，為單克隆抗體，購自寶日醫生物技術(北京)有限公司進口產品，原產地古巴分子免疫學中心，商品名愛歐山，進口藥品注冊證號S20030084 ；
濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液按照如下方法配制將8gNaCl、0. 2g KC1、
I.44g Na2HPO4 和 0. 24g KH2PO4 溶于 1000ml 去離子水中。每2ml包被液A按照如下方法制備將25 μ g Retronectin、5 μ g Anti-Q)3和濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液，用PBS緩沖液補至2ml ；每2ml包被液B按照如下方法制備將25 yg Retronectin和濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液，用PBS緩沖液補至2ml。在培養前一天分別用包被液A和包被液B包被培養瓶，4°C包被過夜(12h)，得到培養瓶I和培養瓶2。2、PBMCs 的分離I)注射器預吸入Iml肝素，抽取人外周血30ml，得到離體的人外周血。 2)將離體的人外周血，用水平轉子離心，2000rpm，20分鐘，得到下層的血細胞和上層的血漿，吸取上層血漿，56°C滅活30min，保存于4°C待用，得到自體血漿。用等體積濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液重懸下層的血細胞，得到血細胞懸液。3)在50ml離心管中預先加入人淋巴細胞分離液(Ficoll)(購自天津血液研究所，TBD200ml)，按照血細胞懸液Ficoll為2 : I (體積比)的比例將25ml血細胞懸液緩慢加在ficoll上層，保持兩種液體之間存在清晰的液面。水平離心，2000rpm，20分鐘，吸取中間白色層面的細胞，加入IOml濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS中，1200rpm離心10分鐘，棄去上清。濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS重復洗滌細胞2次，計數，得到3. 3X IO7個PBMCs。將PBMCs細胞標記⑶3和⑶56抗體(產品均來自美國貝克曼庫爾特公司。⑶3即為CD3-ECD目錄號頂2705U，單克隆抗體，克隆號UCHTl ;CD56即為CD56-PECY5目錄號頂2654U，單克隆抗體，克隆號_01(順1(-1))，41避光孵育301^11。每管加入4ml PBS,1000RPM離心5min，棄上清，細胞用400 μ I PBS重懸，上機流式細胞檢測，結果如圖I所示，CD56+細胞占 11. 1%ο3.磁珠分選CD56+細胞I)將上述獲得的PBMC按每IO7個細胞加入80μ I磁珠buffer和20 μ I標記⑶56磁珠(標記⑶56磁珠及磁珠buffer購自德國美天旖公司。標記⑶56磁珠目錄號130-050-401 ;磁珠 buffer 由 MACS BSA Stock Solution (目錄號130-0910376)與 MACSRinsing Solution (目錄號130-091-222) I 20 混合配得)，4°C孵育 15 分鐘。2)加入2ml磁珠buffer, IOOOrpm離心10分鐘，棄去上清，調整細胞濃度為2 XlOVml ο3)將磁珠吸附柱(磁珠吸附柱購自德國美天旖公司，目錄號130-041-401)置于磁場中，加入Iml磁珠buffer潤透吸附柱,緩慢將細胞滴入柱中，加入3ml磁珠buffer洗去未標記⑶56磁珠的細胞。4)吸附柱脫離磁場，加入Iml磁珠buffer，快速推動助推器收集CD56+細胞。5)經過⑶56磁珠陽選后，獲得細胞4.6X106個，占總PBMC的13.9%，⑶56+細胞計數為I. 25X 107。將管中收集的細胞標記⑶3和⑶56抗體，4°C避光孵育30min。每管加入4ml PBS,1000RPM離心5min，棄上清，細胞用400 μ I PBS重懸，上機流式細胞檢測，結果顯示，⑶56+的細胞占到了 99%，其中NK細胞占21%，NKT細胞占78% (圖2)。4、接種細胞I)蛋白包被的培養瓶I和培養瓶2分別用PBS小心沖洗3次。2)將步驟3獲得的⑶56+細胞分為三組，A組細胞加入未包被的培養瓶3中，加入5ml含10% (體積百分含量)自體血漿的T503培養基(購自寶日醫生物技術(北京)有限公司，目錄號GT-T503)，調整細胞濃度為5X105/ml，再加入IL-2(購自北京四環生物制藥有限公司，終濃度為1000IU/ml)和IL-15 (購自美國Santa Cruz公司，目錄號sc-4607,終濃度為20ng/ml)；B組細胞加入蛋白包被的培養瓶2 (接受Retronectin單一蛋白刺激)中，加入5ml含10% (體積百分含量)自體血漿的T503培養基，調整細胞濃度為5 X 105/ml，再加入 IL-2(終濃度為 1000IU/ml)和 IL_15(終濃度為 20ng/ml)；C組細胞加入蛋白包被的培養瓶I (接受Retronectin和Anti-⑶3兩種蛋白刺激)中，加入5ml含10% (體積百分含量)自體血漿的T503培養基，調整細胞濃度為5 X105/ml，再加入 IL-2(終濃度為 1000IU/ml)和 IL_15(終濃度為 20ng/ml)；以上3組細胞均放入37°C,5% CO2細胞培養箱中。5、細胞脫瓶I)將上述3組細胞于刺激72小時后反復沖洗培養瓶底將細胞充分吹散成分散狀態，并分別計數；2)將3組刺激后的細胞均分別移入無蛋白包被培養瓶中繼續培養，37°C，5% CO2細胞培養箱中培養，加入含10% (體積百分含量)自體血漿的T503培養基，調整細胞數為2. 5 XlOVml，再加入 IL-2(終濃度為 1000IU/ml)和 IL-15 (終濃度為 20ng/ml)；3)每兩天細胞計數并調濃度為2. 5X105/ml、補液、補因子。經過14天的培養，臺盼藍計數法檢測A、B和C三組細胞的擴增倍數，結果如圖3所示，培養4、6、8、10、12、14天A組細胞擴增倍數分別為1,2. 14,2. 68,6. 43、10. 57、17. 86 ；培養4、6、8、10、12、14天B組細胞的擴增倍數分別為1,3. 8、17、55、74、97 ;培養4、6、8、10、12、14天C組細胞的擴增倍數分別為1,3. 1,11. 9,47. 62,190,371. 43 ;A、B、C組經過14天的培養的擴增細胞倍數分別為18倍、97倍和371倍。可以看出，B組細胞由于增加了Retronectin的刺激，增殖效果有了明顯的提高。C組細胞在接受兩種蛋白刺激后，增殖效果較僅接受Retronectin刺激B組又有了較大的提高。將經過14天的培養得到的A、B、C三組細胞分別標記⑶3、⑶16 (即為⑶16-FITC目錄號6604894，單克隆抗體，克隆號3G8)和CD56抗體，4°C避光孵育30min。每管加入4ml PBS, 1000RPM離心5min，棄上清，細胞用400 μ I PBS重懸，上機流式細胞檢測，結果如圖4和圖5所示，圖4看出，三組細胞培養后絕大多數細胞為NK細胞和NKT細胞。圖5看出，A組細胞的NK細胞、NKT和T細胞(非NK樣的T細胞群)比例分別為15. 6%,84. 8%,0. 5%；Β組細胞的NK細胞、NKT和T細胞(非NK樣的T細胞群)比例分別為27·5%、71·7%、0·6% ;C組細胞的NK細胞、NKT和T細胞(非NK樣的T細胞群)比例分別為 5. 4%,89. 9%,4. 5% ；B組細胞與A組細胞相比，NK細胞比例提高，提示Retronectin蛋白具有刺激NK細胞的增殖的作用。促進增殖的機制可能是Retronectin通過結合NK細胞表面的VLA從而刺激其增殖。C組細胞與B組細胞相比，NKT的比例更高，因為Anti-⑶3是通過⑶3-TCR復合物起到協同刺激作用的，因此NKT的增殖更為明顯。同時，C組細胞相比較于其他兩組。⑶3表達陽性的細胞比例明顯提高，其中還出現了 4. 5%的非NK樣的T細胞群。這部分細胞可能是在利用磁珠進行分選時摻雜進來的T細胞，在接受了 CD3mAb的刺激后細胞數量被放大產生的。將培養14天得到的A、B、C組細胞分別記作NK_A、NK-B, NK-C細胞。實施例2、NK細胞體外殺傷實驗I、準備工作I)提前培養人胰腺癌JF305細胞(可從上海復祥生物科技有限公司購買)和人結腸癌HCTl 16細胞；

2)配置含5% (體積百分比)FBS的無酚紅1640培養基；2、調整細胞濃度并加入96孔板中I)PBS洗滌細胞3次，每次IOOOrpm離心5分鐘，棄去上清。用含5% (體積百分比)FBS的無酚紅1640培養基調整腫瘤細胞JF305濃度為2X 105/ml ；2) PBS洗滌細胞3次，每次1200rpm離心5分鐘，棄去上清。依照效靶比為10 1，20 1,40 I的比例用含5% FBS的無酚紅1640培養基調整由實施例I得到的NK-A、NK-B、NK-C 細胞濃度均分別為 2X107ml，4X106/ml，8X106/ml ；3)板中加入不同濃度的NK-A、NK-B、NK_C細胞，每孔50ul。4)在已加入NK-A、NK-B, NK-C細胞的孔中分別加入人胰腺癌JF305，每孔50ul。5)加入空白背景對照(加入的是5% FBS無酚紅1640)每孔50 μ I。6)補齊體積，不足100 μ I的孔補入50μ I含5% FBS1640培養基。腫瘤細胞和NK細胞共孵育4小時。每孔加入20 μ IMTS標記染色。等待4小時，等顏色有明顯梯度差別時酶標儀檢測，檢測波長為490nm。細胞殺傷率=(ODs^l ODmis)/ODmam X 100%, OD 為吸光值。結果如圖6所示，在效靶比為10/1，20/1和40/1時，針對JF-305細胞的殺傷率A組細胞(NK-A)為 14. 6%，29. 6%和 54. 5% ；B 組細胞(NK-B) % 48. 5%, 55. 8%,63. 6% ；C組細胞(NK-C)為22. 9%，47. 5%，62. 6%。14天的細胞表型顯示，B組的NK細胞含量較高，因而產生的殺傷效果較明顯；另一方面，C組的NK細胞比例低于B組，而NKT比例較高，但NKT的直接殺傷效果不及NK，因此B組能夠產生更明顯的效果。以上兩個因素使體外4小時的殺傷結果為相同數量效應細胞情況下，B組細胞具有最好的殺傷結果。比較總殺傷效率(總殺傷效率=相同細胞時的殺傷效率X擴增倍數)，結果如圖7所示，針對JF-305細胞的總殺傷效率A組細胞(NK-A)為14. 64%,29. 63%,54. 47% ；B 組為 48. 54%,55. 75%,63. 6% ；B 組細胞(NK-B)為 14. 64%,29. 63%,54. 47% ；B 組為48. 54%,55. 75%,63. 6% ；C組的總殺傷效率要遠遠好于其他兩組，擴增倍數的優勢在這里得到了體現。采用同樣的方法檢測對HCTl 16細胞殺傷力，結果與對JF-305細胞的趨勢相同。
權利要求
1.一種培養NK和/或NKT細胞的方法，包括如下步驟 將離體的NK和/或NKT細胞接種到如下培養體系A中，培養，即得到增殖的NK和/或NKT細胞； 所述培養體系A為如下I)或2): 1)所示培養體系A由抗CD3抗體、Retronectin、培養基和誘導因子組成； 2)所示培養體系A由抗CD3抗體、培養基和誘導因子組成。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于 所述抗⑶3抗體與所述培養基的配比為5 ii g 5ml; 所述Retronectin與所述培養基的配比為25 y g : 5ml ； 所述誘導因子為IL-2和IL-15 ； 所述IL-2在所述培養體系A中的濃度為800-1200IU/ml，所述IL-2在所述培養體系A中的濃度具體為1000IU/ml ； 所述IL-15在所述培養體系A中的濃度為18ng/ml-22ng/ml，所述IL-15在所述培養體系A中的濃度具體為20ng/ml。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于 1)所示培養體系A中的所述抗CD3抗體和Retronectin由緩沖液A提供 每2ml所述緩沖液A按照如下方法制備將25iig Retronectin、5ii g抗⑶3抗體和濃度為0. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補至2ml ； 2)所示培養體系B中的所述抗CD3抗體由緩沖液B提供 每2ml所述緩沖液B按照如下方法制備將25iig Retronectin和濃度為0.01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補至2ml ； 所述培養時間為70小時-74小時，所述培養時間具體為72小時，所述培養溫度為350C -38°C，所述培養溫度具體為37°C，所述培養所需CO2的濃度為4. 5% -5. 5% (體積百分含量)，所述培養所需CO2的濃度具體為5% (體積百分含量)。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 在所述培養步驟后，還包括如下步驟 將所述培養得到的細胞移入不含有抗CD3抗體和Retronectin的培養體系B中繼續培養，得到增殖的NK和/或NKT細胞； 所述培養體系B和所述培養體系A的區別為不含有抗⑶3抗體和Retronectin，其它組分和各組分濃度均相同。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于 所述緩沖液A、所述緩沖液B和所述誘導因子均為獨立包裝。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法,其特征在于 所述培養基為含10% (體積百分含量)離體血漿的T503培養基； 所述抗CD3抗體為單抗或者多抗； 所述抗⑶3抗體具體為Anti-⑶3 ； 所述離體的血漿與所述離體的NK和/或NKT細胞來源于同一物種； 所述物種具體為人或動物。
7.一種用于培養NK和/或NKT細胞的培養體系，所述培養體系A為如下I)或2):1)所示培養體系A由抗CD3抗體、Retronectin、培養基和誘導因子組成； 2)所示培養體系A由抗CD3抗體、培養基和誘導因子組成。
8.根據權利要求7所述的培養體系，其特征在于 所述抗⑶3抗體與所述培養基的配比為5 ii g 5ml; 所述Retronectin與所述培養基的配比為25 y g : 5ml ； 所述誘導因子為IL-2和IL-15 ； 所述IL-2在所述培養體系A中的濃度為800-1200IU/ml，所述IL-2在所述培養體系A中的濃度具體為1000IU/ml ； 所述IL-15在所述培養體系A中的濃度為18ng/ml-22ng/ml，所述IL-15在所述培養體系A中的濃度具體為20ng/ml。
9.根據權利要求7或8所述的培養體系，其特征在于 1)所示培養體系A中的所述抗CD3抗體和Retronectin由緩沖液A提供 每2ml所述緩沖液A按照如下方法制備將25iig Retronectin、5ii g抗⑶3抗體和濃度為0. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補至2ml ； 2)所示培養體系B中的所述抗CD3抗體由緩沖液B提供 每2ml所述緩沖液B按照如下方法制備將25iig Retronectin和濃度為0.01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補至2ml ； 所述培養基為含10% (體積百分含量)離體血漿的T503培養基； 所述抗CD3抗體為單抗或者多抗； 所述抗⑶3抗體具體為Anti-⑶3。
10.根據權利要求7-9中任一所述的培養體系，其特征在于 所述離體的血漿與所述離體的NK和/或NKT細胞來源于同一物種； 所述物種具體為人或動物。
全文摘要
本發明公開了一種培養NK和/或NKT細胞的方法。本發明提供了一種培養NK和/或NKT細胞的方法，包括如下步驟將離體的NK和/或NKT細胞接種到如下培養體系A中培養，即得到增殖的NK和/或NKT細胞；所述培養體系A由含有抗CD3抗體和/或Retronectin的緩沖液和誘導因子組成。本發明的實驗證明，將提取自外周血的PBMC經過磁珠分離富集后，獲得高純度的CD56+細胞，在體外培養體系中加入Retronectin和CD3mAb兩種蛋白共同刺激，同時輔以IL-2和IL-15兩種因子誘導，建立一個可獲得大量具有高殺傷活力的NK和NKT細胞的培養方法。
文檔編號C12N5/0783GK102676453SQ20111023550
公開日2012年9月19日 申請日期2011年8月16日 優先權日2011年3月17日
發明者趙平, 趙晨, 馬潔 申請人:中國醫學科學院腫瘤研究所