一株植物促生菌及其菌劑的生產方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一株防治植物病害、促進植物生長的解淀粉芽孢桿菌，及其菌劑的低成本生產方法，屬于微生物農藥和微生物肥料【技術領域】。本發明采用的菌株是從水草根際土壤中分離篩選出來的一株高效植物促生菌——解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）A3菌株，該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC?No.6676。本發明利用甘薯淀粉廢水作為發酵培養基，大規模培養解淀粉芽孢桿菌，制備具有防治植物病害、促進植物生長的菌劑，該工藝生產成本低廉，操作簡單，還可以使甘薯淀粉廢水得到資源化利用，減少污染排放。本發明生產的菌劑用于茶葉和蔬菜的生產，不僅可以提高產量，而且可以改善茶園和蔬菜的品質，顯示出廣闊的應用前景。
【專利說明】一株植物促生菌及其菌劑的生產方法和應用
【技術領域】:
[0001]本發明涉及一株高效拮抗植物病原菌、促進植物生長的解淀粉芽孢桿菌，及其低成本生產方法和使用方法，屬于微生物農藥和微生物肥料【技術領域】。
【背景技術】:
[0002]解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)以其具備產淀粉酶的潛力而得名。解淀粉芽孢桿菌在自然界中分布廣泛，是一種重要的生防菌，它通過產生抗生素、抗菌蛋白或多肽等活性物質來抑制植物病原細菌、真菌、病毒、線蟲，從而起到生物防治的作用；同時它也是一類重要的植物根際促生細菌，表現出對多種植物促進生長的作用。例如，Idriss等報道解淀粉芽孢桿菌FZB45菌株具有肌醇六磷酸酶(phytase)活性，可以在缺磷的條件下刺激植物生長(Microbiology，2002，148:2097-2109)。申莉莉等報道解淀粉芽孢桿菌Ba33菌株可以促進煙草生產并且抑制煙草花葉病毒的增殖(吉林農業大學學報，2010，32:383~386)。李超等還報道了一株具有溶藻作用的解淀粉芽孢桿菌菌株DCl (環境科學學報，31:1602-1608)。
[0003]中國發明專利(申請號:201010518034.1)中公開了一株解淀粉芽孢桿菌Lx-1l菌株，保藏編號為CGMCC N0.3789，對水稻細菌性條斑病有良好的防治效果，培養該菌株采用的培養基為:大豆粉1%，豆餅粉2%，淀粉0.5%，酵母膏0.2%，玉米漿0.22%，氯化鈉0.1%，碳酸氫鈣0.18%。中國發明專利(申請號:200810231406.5)中公開了一株解淀粉芽孢桿菌YN-1菌株，保藏編號為CGMCC N0.2328，能有效防治蘋果褐斑病、小麥紋枯病等真菌病害，并篩選出了成本低廉的工業用培養基，組成包括:葡萄糖8~12g/L，玉米粉l(Tl6g/L，黃豆餅粉l(Tl6g/L。中國發明專利(申請號:200910070709.8)中公開了一株解淀粉芽孢桿菌HN菌株，保藏編號為CGMCC N0.3261，能使養殖水體中的硝態氮、亞硝態氮、COD等含量明顯降低，該菌株的培養采用肉湯培養基。中國發明專利(申請號:201010264520.5)中公開了一株植物內生解淀粉芽孢桿菌TF 28菌株，保藏編號為CGMCC N0.4038，它能在植物體內定殖、繁殖和傳導，可產生抗菌蛋白和脂肽類抗生素兩種抗菌物質，具有防病促生作用，其液體培養基每1000mL由IOg胰蛋白胨、5g酵母浸粉、IOg NaCl配制而成。中國發明專利(申請號:200910273498.8)中公開了一株解淀粉芽孢桿菌EA19菌株，保藏編號為CCTCC M209316，對小麥根腐病菌、小麥根腐葉枯病菌、小麥全蝕病菌、小麥白絹病菌和小麥紋枯病菌均具有明顯的抑菌活性，其發酵培養基組成:葡萄糖20克，牛肉膏8克，L-谷氨酸鈉5克，MgSO4 0.5克，KCl 0.5 克，KH2PO4 I 克，FeSO4.6H20 0.15 毫克，MnSO4.H2O 5 毫克，CuSO4.5H20 0.16毫克，水1000毫升。中國發明專利(申請號:201110095116.4)中公開了一株解淀粉芽孢桿菌B-004菌株，保藏編號為CGMCC N0.4557，它對番茄采后早疫病菌具有明顯拮抗效果，其培養基中，碳源可為可溶性淀粉、藕粉、葡萄糖、乳糖、海藻糖、蔗糖等，氮源可為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、NH4NO3^ NH4Cl, (NH4)2SO4等，其他營養源可為含鉀、鐵、鋅、鈉、錳、鎂及鈣之類的金屬鹽等。
[0004]綜上所述，具有拮抗植物病害的解淀粉芽孢桿菌的菌株較多，其培養方法也各不相同，但是，未見用于茶葉生產的菌株，也未見采用甘薯淀粉廢水培養解淀粉芽孢桿菌的報道。
【發明內容】
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[0005]本發明的目的是提供一株高效拮抗植物病原菌、促進植物生長的解淀粉芽孢桿菌，并提供一種能夠資源化利用甘薯淀粉廢水生產該微生物菌劑的方法，及菌劑的使用方法。
[0006]本發明所使用的菌株是由發明人從水草根際土壤中分離篩選出來的一株高效促進植物生長、拮抗植物病原菌的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) A3菌株，該菌株于2012年10月15日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為:CGMCCN0.6676，保藏單位地址:北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編:100101o
[0007]本發明所述的解淀粉芽孢桿菌微生物菌劑的生產方法如下:
[0008]1、甘薯淀粉廢水預處理:用氫氧化鈉水溶液或石灰水調節廢水的pH到6.8~
7.7，于110~126°C滅菌10~35分鐘。
[0009]2、液體種子制備:向裝有預處理好的甘薯淀粉廢水的三角瓶中接種斜面保藏的解淀粉芽孢桿菌，于25~37°C，120~200轉/分振蕩培養24~36小時，得到液體種子。 [0010]3、液態發酵:向裝有預處理好的甘薯淀粉廢水發酵罐中接種體積比為2%~15%的液體種子，于25~37°C，通無菌空氣培養15~36小時；培養好的發酵液經平板細菌計數，活菌數達到1.5X IO9CFU/毫升以上，所得發酵液可以作為液體菌劑直接使用。
[0011]4、固體菌劑制備:以過30目篩的生物碳(生物質熱解后剩余的固體物質，主要成分是碳)為載體，按照發酵液:生物碳為1:1~1: 5的重量比，將發酵液添加到生物碳中，充分混合均勻，得到固態菌劑，通風干燥至菌劑含水量30%以下，包裝，存放在陰涼干燥處，備用。
[0012]本發明所述的解淀粉芽孢桿菌微生物菌劑的使用方法如下:
[0013]1、將發酵液或固體菌劑用灌溉用水稀釋到活菌數為5X IO6CFU/毫升~5 X IO7CFU/毫升，混合均勻，按照每畝I~3立方米稀釋液的用量溝施入作物根部附近的土壤中；
[0014]2、將發酵液或固體菌劑加入有機肥中，混合均勻，使有機肥中的解淀粉芽孢桿菌活菌數為5 X IO6CFU/克~IX IO8CFU/克，按照每畝I~3噸的用量作為基肥施入土壤中。
【具體實施方式】:
[0015]由本發明提供的解淀粉芽孢桿菌能夠促進作物對養分的吸收和利用，并且能有效防治多種真菌類植物病害，本發明提供的技術方案生產的微生物菌劑應用于農業生產可以減少化肥和農藥的使用量，從而改善農田環境質量；而且生產成本很低，使高濃度廢水得到資源化利用，減少污染物排放。【具體實施方式】如下:
[0016]實施例1:甘薯淀粉廢水生產解淀粉芽孢桿菌微生物菌劑
[0017]甘薯淀粉廢水預處理:用石灰水調節廢水pH到7.5，于115°C滅菌20分鐘。
[0018]液體種子制備:向裝有預處理好的甘薯淀粉廢水的三角瓶中接種斜面保藏的解淀粉芽孢桿菌，于32°C，150轉/分振蕩培養26小時，得到液體種子。
[0019]液態發酵:向裝有預處理好的甘薯淀粉廢水發酵罐中接種5% (體積比)的液體種子，于32°C，通無菌空氣培養20小時；培養好的發酵液經平板細菌計數，活菌數達到
5.5 X IO9CFU/ 毫升。
[0020]菌劑制備:以過30目篩的生物碳為載體，按照發酵液:生物碳為1: 2的重量比，將發酵液添加到生物碳中，充分混合均勻，得到固態菌劑，通風干燥至菌劑含水量30%以下，包裝，存放在陰涼干燥處。
[0021]實施例2:解淀粉芽孢桿菌微生物菌劑應用于有機茶生產
[0022]在有機茶園選擇茶樹長勢均勻的試驗地2畝左右，實驗茶樹與基地其他茶樹管理保持一直，只是施肥有所不同。試驗地劃分為5塊，分別對應5個處理，每個處理之間都有設有2米左右的隔離行，將菌劑用自來水稀釋或直接將發酵液稀釋使用，5個處理分別為清水對照(CK)、淀粉廢水對照(FCK)、高濃度(2.5 X IO7CFU/毫升)溝施(H)、中濃度(1.8X IO7CFU/毫升)溝施(M)、低濃度(1.2X IO7CFU/毫升)溝施(L)，按照每平方米3升的菌劑稀釋液的量使用。各處理以相同的方式在冬季施用兩次菌劑，春季采收茶葉，結果表明:施用廢水稀釋液的對照春茶產量與清水對照無顯著差異，而使用菌劑的春茶產量顯著增加，其中，施用中濃度和高濃度菌劑的春茶產量相當，都比清水對照增產65%以上，施用低濃度菌劑的春茶產量也比清水對照增產30%左右。而且施用菌劑的茶葉中氨基酸含量顯著高于清水對照。
[0023]實施例3:解淀粉芽孢桿菌微生物菌劑用于防止黃瓜猝倒病
[0024]黃瓜猝倒病是由`真菌侵染引起的病害。采集多年種植黃瓜的溫室大棚中的土壤，混合均勻，裝入花盆中，設置2組花盆，每組10盆，至于15°C~20°C的溫室中，保持較高濕度和較低的光照強度。第I組花盆直接播種黃瓜種子，每盆15粒，作為對照。第2組播種黃瓜種子前向土壤中拌入重量比為0.2%的解淀粉芽孢桿菌微生物菌劑，然后每盆播種15粒種子。幼苗出土后統計總數，幼苗長出I片真葉后，2片真葉前統計倒伏苗總數。結果表明，對照幼苗倒伏率超過40%，而添加菌劑的實驗組，幼苗倒伏率低于5%。
【權利要求】
1.一株具有防治植物病害和促進植物生長的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),其特征在于:該株解淀粉芽孢桿菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCC N0.6676。
2.權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌生產微生物菌劑的方法，包括如下步驟: (1)甘薯淀粉廢水預處理:用氫氧化鈉水溶液或石灰水調節廢水的PH到6.8~7.7，于110~126°C滅菌10~35分鐘； (2)液體種子制備:向裝有預處理好的甘薯淀粉廢水的三角瓶中接種斜面保藏的解淀粉芽孢桿菌，于25~37°C，120~200轉/分振蕩培養24~36小時，得到液體種子； (3)液態發酵:向裝有預處理好的甘薯淀粉廢水發酵罐中接種體積比為2%~15%的液體種子，于25~37°C，通無菌空氣培養15~36小時；培養好的發酵液經平板細菌計數，活菌數達到1.5X IO9CFU/毫升以上，所得發酵液可以作為液體菌劑直接使用； (4)固體菌劑制備:以過30目篩的生物碳(生物質熱解后剩余的固體物質，主要成分是碳)為載體，按照發酵液:生物碳為1:1~1: 5的重量比，將發酵液添加到生物碳中，充分混合均勻，得到固態菌劑，通風干燥至菌劑含水量30%以下，包裝，存放在陰涼干燥處。
3.權利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌微生物菌劑的使用方法，包括: (I)將發酵液或固體菌劑用灌溉用水稀釋到活菌數為5 X IO6CFU/毫升~5 X IO7CFU/毫升，混合均勻，按照每畝I~3立方米稀釋液的用量溝施入作物根部附近的土壤中； (2 )將發酵液或固體菌劑 加入有機肥中，混合均勻，使有機肥中的解淀粉芽孢桿菌活菌數為5 X IO6CFU/克~IXlO8CFU/克，按照每畝I~3噸的用量作為基肥施入土壤中。
【文檔編號】C12R1/07GK103820348SQ201210461410
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年11月16日 優先權日:2012年11月16日
【發明者】白志輝, 周晨光, 張茉莉, 徐圣君, 陳月月, 肖潤林 申請人:中國科學院生態環境研究中心