一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法
【專利摘要】本發明涉及了一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法。該方法包括（1）樣品采集；（2）培養基制備；（3）截取吸頭的制備；（4）共培養菌株的制備；（5）絲狀真菌分離及共培養；（6）抗菌活性菌株篩選。本發明方法通過共培養的方式快速地篩選抗菌活性絲狀真菌，與純種培養篩選抗菌活性絲狀真菌相比，可以增加新穎抗菌活性菌株及抗菌活性物質的篩選幾率，并且整個篩選過程快速，操作簡單，能夠快速、直觀、高效的篩選到抗菌活性的絲狀真菌，為抗菌活性絲狀真菌的篩選研究提供了極大方便。
【專利說明】一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種微生物的快速分離方法，更具體的說是一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法。
【背景技術】
[0002]抗生素的長期廣泛使用導致耐藥性病原細菌種類增加，甚至出現“超級細菌”，新的感染性疾病也不斷涌現，致使新型抗菌物質的研究與開發迫在眉睫(李越中，陳琦.海洋微生物資源及其產生生物活性代謝產物的研究，生物工程進展，2000，20 (5): 28-31)。一直以來，放線菌被認為是活性次級代謝產物的最主要來源，但是近期的研究表明，絲狀真菌產活性次級代謝產物的潛力也非常巨大，因此篩選絲狀真菌活性次級代謝產物成為研究熱點(朱偉明，王俊鋒.海洋真菌生物活性物質研究之管見，菌物學報，2011，30 (2):218-228)
微生物活性次級代謝產物的篩選方法是制約新穎活性次級代謝產物篩選效率的關鍵步驟。分子生物學技術快速發展，通過構建宏基因組文庫篩選新型天然產物可以避開微生物的分離過程，擴大了天然產物篩選范圍。但是，目前環境大片段DNA的提取困難、基因在宿主細胞中不表達或表達量低、無法進行高通量的活性物質篩選等問題制約了宏基因組文庫的實用性。通過化學修飾或全化學合成可以獲得新穎抗生素，但是合成過程復雜，且造成環境污染。通過基因組發掘可以提高天然產物的發現效率，但是天然產物基因簇的功能鑒定一直是尚未解決的難題(白林泉，鄧子新.微生物次級代謝產物生物合成基因簇與藥物創新，中國抗生素雜志，2006，31(2): 80-86)。由此可見，對微生物進行調查，篩選新型次級代謝產物產生菌株，仍 然是一種重要的開發新型抗生素的途徑。
[0003]近期研究表明，兩種或多種微生物的共培養可以刺激微生物產生新穎的次級代謝產物，對新穎物質的開發有重要意義，提供了通過共培養提高新穎抗菌物質的篩選效率的可能性。(黃兵，劉寧，黃英，陳勁春.放線菌與枯草芽孢桿菌的共培養及其對活性次生代謝產物的影響，生物工程學報，2009，25(6): 932-940)。但是，目前對新穎抗菌物質的篩選方法多以單一的純菌種進行的篩選方法。通過共培養篩選新穎抗菌物質產生絲狀真菌，按傳統方法，首先分離絲狀真菌，對所有菌株和其它菌株共同液體培養發酵，制備發酵上清液或發酵液有機溶劑萃取液，進一步用濾紙片法、管碟法、打孔法測定抑菌活性(李小俊，成麗霞，吳彥彬，邊艷青.拮抗菌抗菌譜及發酵液拮抗能力測定的新方法，生物技術，2007，17(1): 55-58)。該方法成本高，周期長，勞動強度大。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供了一種成本低、操作簡單、周期短、效率高的通過共培養方式篩選抗菌活性絲狀真菌的方法。
[0005]本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法，其特點是:(1)樣品采集:用無菌取樣瓶采集水樣及土樣，迅速送至實驗室，4°c保存；
(2)培養基制備:營養瓊脂培養基:牛肉膏3g，蛋白胨IOg,NaCl 5g，蒸餾水1000 ml,pH7.2 ;PDA培養基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000 ml,自然pH ;若制備固體培養基平板，添加瓊脂20g/L ;121°C滅菌20min，待溫度降至60°C，加入過濾除菌的鏈霉素和氨芐青霉素至終濃度分別為100 mg/ml和50 mg/ml，混勻后倒平板；若分離是海洋樣品則上述培養中配制過程中，用海水代替蒸餾水；
(3)截取吸頭的制備:取Iml移液器吸頭，以寬口端為準，截取12_，其余部分鋸掉，邊緣打磨光滑，121°C滅菌20min ；
(4)共培養菌株的制備:從斜面中挑取AscAericAiacoli保存菌種,在厚度約為3mm營養瓊脂培養基平板上三區劃線，37°C倒置培養至出現單菌落；用截取吸頭的窄口端在Escherichia coli單菌落上打孔,使coli單菌落及培養基進入吸頭內；
(5)絲狀真菌分離及共培養:將所取樣品進行梯度稀釋，取50μ L不同稀釋度的稀釋液涂布在厚度約為4mm的PDA平板。30°C倒置培養l_5d，在絲狀真菌菌落形成初期，即菌落直徑小于截取吸頭寬口端前，用含有coli單菌落及培養基的截取吸頭寬口端在培養基上打孔，使絲狀真菌菌落和培養基保留在截取吸頭寬口端內，并使兩側培養基離開大約3mm的距離，30°C繼續培養3d ；
(6)抗菌活性菌株篩 選:將共培養吸頭寬口端向下置于51taphylococcus aureus、Escherichia coli ^Saccharomyces cere vi si ae ^Peni ci Ilium 等含菌指7]^平板，并用滅菌鑷子輕壓窄口端培養基，使吸頭內的絲狀真菌和Escherichia coli接觸。指示細菌用培養基為營養瓊脂培養基，真菌為PDA培養基。于指不菌適合的溫度培養后觀察，并用游標卡尺測定抑菌圈的大小，抑菌圈越大，菌株抗菌活性越強，從而快速篩選得到抗菌活性絲狀真菌。
[0006]本發明中涉及的菌株均來自于中國普通微生物菌種保藏中心，Escherichiacoli 的保藏號為 CGMCC 1.487，Staphylococcus aureus 的保藏號為 CGMCC 1.2465，Saccharomyces cerevisiae 的保藏號為 CGMCC 2.114, Peni ci Ilium expansum 的保藏號為CGMCC 3.3703。
[0007]本發明所述的一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法的步驟(5)中，通過截取吸M務E— coli和待篩選絲狀真菌共培養，并放于指示菌平板，指示菌培養后測定抑菌圈直徑，根據抑菌圈的有無和大小快速篩選抗菌活性菌株。
[0008]與現有技術相比，本發明的有益效果是:本發明方法通過共培養的方式快速地篩選抗菌活性絲狀真菌，與純種培養篩選抗菌活性絲狀真菌相比，可以增加新穎抗菌活性菌株及抗菌活性物質的篩選幾率，并且整個篩選過程快速，操作簡單，能夠快速、直觀、高效的篩選到抗菌活性的絲狀真菌，為抗菌活性絲狀真菌的篩選研究提供了極大方便。
【具體實施方式】
[0009]以下通過實例進一步說明本發明，以使本領域技術人員可以更好地理解本發明，而不構成對本發明權利的限制。
[0010]實施例1，一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法，
(I)樣品采集:用無菌取樣瓶采集海水樣及土樣，迅速送至實驗室，4°c保存；(2)培養基制備:營養瓊脂培養基:牛肉膏3g，蛋白胨IOg,NaCl 5g，蒸餾水1000 ml,pH7.2 ;PDA培養基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000 ml,自然pH ;若制備固體培養基平板，添加瓊脂20g/L ;用于絲狀真菌分離時，PDA培養基滅菌后待溫度降至60°C，加入過濾除菌的鏈霉素和氨芐青霉素至終濃度分別為100 mg/ml和50 mg/ml，混勻后倒平板；若為海洋樣品則上述培養中配制過程中，用海水代替蒸餾水；
(3)截取吸頭的制備:取Iml移液器吸頭，以寬口端為準，截取12mm，其余部分鋸掉，邊緣打磨光滑，121°C滅菌20min ；
(4)共培養菌株的制備:從斜面中挑取AscAericAiacoli保存菌種,在厚度約為3mm營養瓊脂培養基平板上三區劃線，37°C倒置培養至出現單菌落；用截取吸頭的窄口端在Escherichia coli單菌落上打孔,使coli單菌落及培養基進入吸頭內；
(5)絲狀真菌分離及共培養:將所取樣品進行梯度稀釋，取50μ L不同稀釋度的稀釋液涂布在厚度約為4mm的PDA平板。30°C倒置培養l_5d，在絲狀真菌菌落形成初期，即菌落直徑小于截取吸頭寬口端前，用含有coli單菌落及培養基的截取吸頭寬口端在培養基上打孔，使絲狀真菌菌落和培養基保留在截取吸頭寬口端內，并使兩側培養基離開大約3mm的距離，30°C繼續培養3d ；
(6)抗菌活性菌株篩選:將共培養吸頭寬口端向下置于51taphylococcus aureus、Escherichia coli ^Saccharomyces cere vi si ae ^Peni ci Ilium 等含菌指7]^平板，并用滅菌鑷子輕壓窄口端培養基，使吸頭內的絲狀真菌和Escherichia coli接觸。指示細菌用培養基為營養瓊脂培養基，真菌為PDA培養基。于指不菌適合的溫度培養后觀察，并用游標卡尺測定抑菌圈的大小；抑菌圈越大，菌株抗菌活性越強；從而快速篩選得到抗菌活性絲狀真菌。
[0011](7)菌株的培養特征及生理生化鑒定
真菌的鑒定參照《真菌鑒定手冊》(魏景超，上海:上海科學技術出版社，1979)和文獻(許玉林，鄭月霞，葉冰瑩，張積森，陳由強.一株纖維素降解真菌的篩選及鑒定，微生物學報，2013，40(2): 220 227)進行。
[0012]實施例2，實施例1所述的一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法的步驟(5)中，通過截取吸頭將coli和待篩選絲狀真菌共培養,并放于指示菌平板,指示菌培養后測定抑菌圈直徑，根據抑菌圈的有無和大小快速篩選抗菌活性菌株。
[0013]實施例3，對比實驗:
1.現有技術方法篩選。從連云港海域連島取海水、海泥，花果山上采集土壤和淡水樣品，通過稀釋涂布法利用PDA培養基分離絲狀真菌，海洋樣品中絲狀真菌分離培養基中用海水代替蒸餾水。將純化后的單菌落接種至PDA斜面培養后4°C保藏。共分離獲得絲狀真菌122株。將不同菌株接種至PDA液體培養基，30°C，160rpm培養2-3d，發酵液雙層濾紙抽濾后，上清液過0.22 //m微孔濾膜后為待測樣品，采用管碟法測定抑菌活性。每個牛津杯中加入 200 P L 發酵樣品，米用含 Staphylococcus aureus、Escheri chi a col1、Saccharomyces cerevisiae^ Penicillium expansum 指不菌平板，30°C 培養后觀察，共獲卷抵Staphylococcus atfreus活性菌株18株，抗fecAe—ricAia coli活性菌株13株，抗Saccharomyces cerevisiae 活性菌株 3 取,紙PeniciIIium expansum 活性菌株 8 株。
[0014]2.采用實施例1記載的本發明方法進行篩選。用上述同樣的海洋及陸源樣品，通過稀釋涂布法利用PDA培養基分離絲狀真菌。從斜面中挑取coli保存菌種，在厚度約為3mm營養瓊脂培養基平板上三區劃線，37°C倒置培養至出現單菌落；用截取吸頭的窄口端在coli單菌落上打孔,使coli單菌落及培養基進入吸頭內。在絲狀真菌菌落形成初期，即菌落直徑小于截取吸頭寬口端前，用含有Escherichia coli單菌落及培養基的截取吸頭寬口端在培養基上打孔，使絲狀真菌菌落和培養基保留在截取吸頭寬口端內，并使兩側培養基離開大約3mm的距離，30°C繼續培養3d。將此共培養微生物的截取吸頭寬口端置于含Staphylococcus aureus ^Escheri chi a col1、Saccharomyces cerevisiae^ Penicillium expansum 指不菌平板，30°C 培養后觀察，共獲得抗Staphylococcus aureus活性菌株22株，抗Escheri chi a coli活性菌株15株，抗Saccharomyces cerevisiae 活性菌株 6 取,紙PeniciIIium expansum 活性菌株 10 株。
[0015]從以上對比篩選實驗 可以看出，本發明方法顯著地提高了抗菌活性絲狀真菌的篩選效率。
【權利要求】
1.一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法，其特征在于，其步驟如下: (1)樣品采集:用無菌取樣瓶采集水樣及土樣，迅速送至實驗室，4°c保存； (2)培養基制備:營養瓊脂培養基:牛肉膏3g，蛋白胨IOg,NaCl 5g，蒸餾水1000 ml,pH7.2 ;PDA培養基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000 ml，自然pH ;制備固體培養基平板時，添加瓊脂20g/L ;用于絲狀真菌分離時，PDA培養基滅菌后待溫度降至60°C，加入過濾除菌的鏈霉素和氨芐青霉素至終濃度分別為100 mg/ml和50 mg/ml，混勻后倒平板；若為海洋樣品則上述培養基配制過程中，用海水代替蒸餾水； (3)截取吸頭的制備:取Iml移液器吸頭，以寬口端為準，截取12mm，其余部分鋸掉，邊緣打磨光滑，121°C滅菌20min ； (4)共培養菌株的制備:從斜面中挑取coli保存菌種，在厚度約為3mm營養瓊脂培養基平板上三區劃線，37°C倒置培養至出現單菌落；用截取吸頭窄口端在Escherichia coli單菌落上打孔,使coli單菌落及培養基進入吸頭內； (5)絲狀真菌分離及共培養:將所取樣品進行梯度稀釋，取50μ L不同稀釋度的稀釋液涂布在厚度為4mm的PDA平板；30°C倒置培養l_5d，在絲狀真菌菌落形成初期，即菌落直徑小于截取吸頭寬口端前，用含有coli單菌落及培養基的截取吸頭寬口端在培養基上打孔，使絲狀真菌菌落和培養基保留在截取吸頭寬口端內，并使兩側培養基距離大約3mm，3(TC繼續培養3d ； (6 )抗菌活性菌株篩選:將共培養吸頭寬口端向下置于51 taphylococcus aureus、Escherichia coli ^Saccharomyces cere vi siae ^Peni ci Ilium expansum 白勺含菌指 7]^ 平板，并用滅菌鑷子輕壓窄口端培養基，使吸頭內的絲狀真菌和Escherichia coli接觸；指示細菌用培養基為營養瓊脂培養基，真菌為PDA培養基；于指不菌適合的溫度培養后觀察,并用游標卡尺測定抑菌圈的大小，抑菌圈越大，菌株抗菌活性越強，從而快速篩選得到抗菌活性絲狀真菌。
2.根據權利要求1所述的一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法，其特征在于:步驟 (5)中通過截取吸頭將coli和待篩選絲狀真菌共培養,并放于指示菌平板，指示菌培養后測定抑菌圈直徑，根據抑菌圈的有無和大小快速篩選抗菌活性菌株。
【文檔編號】C12N1/14GK103966108SQ201410212913
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月20日 優先權日:2014年5月20日
【發明者】劉姝, 房耀維, 呂明生, 王淑軍, 焦豫良 申請人:淮海工學院