控制絲狀真菌發酵過程中生長形態的方法

專利名稱：控制絲狀真菌發酵過程中生長形態的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，涉及一種控制絲狀真菌發酵過程中生長形態的方法。 具體涉及在微生物生長的必需培養基中，以利用木質纖維素作為添加物，在發酵過程中控制絲狀真菌生長形態的方法。
背景技術：
絲狀真菌廣泛運用于工業化生產，其產品包括有機酸、酶制劑、抗生素、色素、小分子多肽等。在產業化生產中，深層發酵的絲狀真菌在通常情況下存在3種形態分散的菌絲體，球狀和團塊狀。不同形態的絲狀真菌會直接影響發酵體系中物性參數、基質傳遞等，所以形態對發酵產品的生成，發酵過程的控制至關重要，而且不同的產品對發酵的形態要求各不相同。例如在利用黑曲霉進行酶制劑生產的時候，常常需要將其生長形態控制為分散的菌絲體狀；而同樣利用黑曲霉進行殼聚糖發酵的時候，則菌球狀的形態更有利于產品產量的提高。分散的菌絲體利于絲狀真菌細胞的呼吸，傳質也較好，但流變性相對較差，利于酶制劑、抗生素等產品的生產；規則的、適宜大小球狀真菌則有利于有機酸、殼聚糖等產品的生產；而團塊狀的真菌在攪拌式發酵罐發酵過程中，會纏繞在攪拌器上或者附壁，造成傳質傳氧的限制，最終導致不能得到目標產品，發酵失敗，但是在進行轉盤上固定化絲狀真菌進行生產時，團狀的形態卻能夠很好的固定于轉盤等載體之上。由此可見，不同的發酵工程對絲狀真菌發酵的形態要求，差異是非常大的。因此，控制絲狀真菌形態的技術是發酵過程控制的熱點與重點。與此相對應的問題是，由于發酵過程的復雜性，以及菌球形態控制本身會受到多種因素的影響，比如說菌種自身的影響，生長營養環境的影響，發酵操作條件的影響等等， 最終使得絲狀真菌的形態的不能控制為理想的形態，或者菌球控制的重復性以及平行性不好。這就使得高效簡便的形態控制技術顯得尤其重要。在利用絲狀真菌產有機酸的過程中，球狀成為公認的最佳形態，在固定化技術迅速發展的今天，各種技術方案應運而生，控制菌體生長成為菌球的自固化技術也得到了巨大的發展。現有的各種技術方案中，各自存在自己的特點與缺陷。在菌種選育方面，通過菌種選育改變菌種的特性，或者進行代謝的改造，最終使所獲得的菌株能在各種培養條件下均能成為菌球。但是，菌種選育以及代謝工程的技術缺點是由于菌種突變的隨機性，使得篩菌的工作只能針對某種或某幾種特定的性狀進行篩選， 而且篩選周期沒有期限，存在菌種退化現象等。也有文獻 皆出(Driouch, H.，B. Sommer, et al. 2010. Morphology engineering of Aspergillus niger for improved enzyme production. Biotechnology and Bioengineering 105(6) : 1058-1068.)，利用微粒子在流場中與生產菌株的作用可以作為形態控制的有效策略。在利用黑曲霉產酶的時候，在發酵體系中加入二氧化硅等微粒子，有效將微生物體系的形態控制為絲狀，達到了高產的目的。其技術方案的出發點是，由于酶制劑發酵的特點，需要將絲狀真菌的形態控制為絲狀，從而有利于酶的生產，利用微粒子在流場中與生產菌株的作用，最終達到了控制絲狀真菌形態的目的。而且，其技術方案的前提是，該類型的菌種由于自身的生長特性，不因為環境的改變而能很好的形成菌球。在不同的發酵體系中，進行有機酸及其殼聚糖等產品的發酵生產時，球狀是最佳的生產形態，添加微粒子的技術路線并不能有效將絲狀真菌控制為菌球形態。另外，有文獻(Liu, Y·, W. Liao, et al. (2008). Study of pellet formation of filamentous fungi Rhizopus oryzae using a multiple logistic regression model. Biotechnology and Bioengineering 99(1) : 117-128.)綜合考察了孢子濃度、 葡萄糖、尿素、磷酸鹽，金屬離子的濃度、發酵體系PH、發酵體系的通風攪拌以及微粒子添加對絲狀真菌生長形態的影響，認為PH和接種量是影響絲狀真菌形態的主要原因，通過降低孢子濃度，嚴格調控PH范圍，有效將絲狀真菌控制為球狀。Fu (Fu，Y., Q. Xu, et al. (2009). A novel multi-stage preculture strategy of Rhizopus oryzae ME-F12 for fumaric acid production in a stirred—tank reactor. World Journal of Microbiology and Biotechnology 25(10) : 1871-1876.)通過調節發酵體系的 pH 以及多級培養的策略來控制米根霉的形態，通過三級培養有效將菌球的大小控制在0. 82mm的范圍。該技術方案的策略是，通過改變微生物生長環境，抑制微生物的生長，最終達到控制菌球形態的目的。這些技術路線的缺點在于，對PH的調節要求很高，常常要求將酸度調整精確到小數點后兩位，這就使得在工業放大的過程中存在兩個問題第一，技術路線對酸度的高度敏感，而在大規模生產中由于混合效果有限，使得在某個范圍內酸度達不到要求，最后導致發酵失敗；第二，儀器的監測范圍有限，使得儀器檢測失效，工業成本增加。另外，一些產品的特性要求一定的酸度范圍，也使該技術方案的應用受到限制。反應器的操作條件調控也是控制絲狀真菌形態的技術路線之一。常用的方法是控制發酵體系中通氣量的大小、通氣成分中氧氣及二氧化碳在整個通氣成分中比例的大小；調整STR發酵罐中攪拌速率，攪拌槳的類型，從而改變發酵體系中的流場特性和傳質傳氧情況，進而調控菌球的形態。例如JUsten (JUsten，P.，G. Paul, et al. (1998). Dependence of Penicillium chrysogenum growth, morphology, vacuolation, and productivity in fed-batch fermentations on impeller type and agitation intensity. Biotechnology and Bioengineering 59(6): 762-775.)通過改變發酵槳葉的類型以及攪拌的速率，有效控制了青霉菌的發酵形態，達到青霉素高產的目的。該技術方案的缺陷是調整的效果極其有限，不能有效滿足工業生產中的操作要求。綜上可見，現有技術條件操作方法繁復，工藝條件苛刻，不能滿足有效控制絲狀真菌發酵型態的問題，可控性不高。因此，進行高效便捷的技術方案的設計，控制絲狀真菌發酵生長形態，成為必然需求。發明人在前期的工作中發現，利用絲狀真菌進行各種產品的生產時，纖維素水解液對絲狀真菌的形態存在明顯的影響，而對于其影響菌球形態的機理，發明人正在探索之中。因此，發明人期望在此發現之上，提供一種粗放的操作條件與精準的控制效果相結合的技術方案，從而實現形態的有效控制。

發明內容
本發明的技術目的是提供一種控制絲狀真菌發酵過程中生長形態的方法，使得本方法能高效便捷地控制絲狀真菌發酵過程中的生長形態，提高絲狀真菌的發酵產率。為了實現本發明的技術目的，本發明的技術方案為
一種控制絲狀真菌發酵過程中生長形態的方法，其特征在于將木質纖維素水解后得到的水解液經脫毒處理后，添加至絲狀真菌發酵培養基中進行液體發酵培養，獲得球狀的具有生物催化活性的絲狀真菌團體。其中，本發明所述的木質纖維素的水解方法應理解為現有技術中任意的木質纖維素水解方法，即常規的木質纖維素處理方法。此方法即將諸如秸稈、玉米芯、甘蔗渣等木質纖維素原料用烯酸浸泡、高溫加熱處理、蒸爆酶解處理的方法；木質纖維素酸解液脫毒的方法也是現有技術中任意水解液脫毒的方法，例如向水解液中加入活性炭、Ca(OH)2固體進行吸附脫毒處理，中和水解液酸性等方法。本發明所述的木質纖維素酸解后的水解液脫毒處理后pH值為6 11，并滅菌冷卻。本發明所述的絲狀真菌發酵培養基也應理解為現有技術中任何的常規絲狀真菌發酵培養基。例如，米根霉發酵生產富馬酸的常規發酵培養基、黑曲霉發酵生產殼聚糖/甲殼素的常規發酵培養基等等。絲狀真菌生長所必需的營養物質，均包括碳源、氮源、無機鹽、 水分，將它們配制為一定濃度的溶液，控制PH范圍為2 6，滅菌并冷卻。舉例的培養基配方為葡萄糖或者木糖10 150 g/L，尿素0. 1 4 g/L，KH2PO4 0. 5 2g/L，MgSO4 · 7H20 0. 1 lg/L, ZnSO4 · 7H20 0. 002 0. lg/L, FeSO4 · 7H20 0. 01 0· 1 g/L。本發明所述的脫毒后的木質纖維素水解液向培養基中的添加量為水解液體積占發酵培養基體積的0. 5% 90%。本發明所述的絲狀真菌包括但不限于曲霉屬，根霉屬，毛霉屬，或者青霉屬。本發明所述的液體發酵培養的條件是，控制發酵pH值2 6，接入絲狀真菌孢子懸浮液，于30 35°C下培養12 72小時。本發明所述的具有生物催化活性的絲狀真菌團體可以作為發酵生產預培養的種子或者產品提取所需要的生物量。本發明的有益效果在于
(1)利用木質纖維素酸解液控制菌球形態，成功解決了絲狀真菌發酵過程中控制困難的技術難題。相對于現有技術方案進行發酵過程中菌球形態的控制，該技術方案成本低廉， 簡便易行，可操作性強，效果顯著，重復性較好。(2)通過該技術進行形態控制，可有效增加發酵產物如富馬酸、甲殼素/殼聚糖等產品的產量。相對于現行技術方案，增加了發酵產品的產出，提高了生產該類產品企業的收益。利用木質纖維素控制菌球形態，可有效降低生產時對設備精度的要求，從而降低生產設備的成本。使得該技術在工業化應用中更具有競爭優勢。(3)本發明的技術要點在于向絲狀真菌常規發酵培養基中添加木質纖維素水解液，即可完全實現對絲狀真菌菌體形態的控制，但是目前此方法的具體作用原理有待于進
一步探索。
具體實施例方式實施例1本實施例說明現有技術中一種以稀酸處理木質纖維素并脫毒的獲得木質纖維素脫毒水解液的方法。在本發明專利中所使用的木質纖維素水解液不受該方法的限制，該方法提供的技術只是可適用于現有技術方法中水解木質纖維素的一種。(1)將木質纖維素原料農業廢棄玉米秸稈，用除塵設備除雜，將秸稈粉碎，過標準篩，取粒徑為40-60目之間的微粒。(2)秸稈微粒用1%的稀硫酸浸泡處理M小時，過濾得到秸稈濾渣，往濾渣中添加 3%的硫酸，在100°C處理3小時。(3)將步驟2所獲得成分過濾，濾液即為木質纖維素水解液。(4)將在步驟3所獲得的木質纖維素水解液中加入Ca(OH)2固體進行吸附脫毒處理，直至pH升至6. 0，過濾，所得到濾液即為木質纖維素脫毒水解液。(5) 115°C滅菌 30min，冷卻待用。實施例2
本實施例說明現有技術中一種以蒸汽爆破的方法預處理木質纖維素并經脫毒獲得脫毒木質纖維素水解液的方法。(1)將木質纖維素原料農業廢棄稻草，將稻草粉碎為2-3 cm的顆粒。(2)在該顆粒中按質量比物料比稀硫酸為10:1加入質量濃度為0. 5%的稀硫酸，控制溫度為50°C，酸浸泡干燥后，在蒸汽爆破裝置中蒸爆，獲得酸蒸爆物料。(3)將上述酸蒸爆物料進行水溶，用稀硫酸將pH調制5. 0，加入纖維素水解酶進行水解，控制酶水解的底物濃度5%-10%，過濾得到纖維素水解液。(4)將在步驟3所獲得的木質纖維素水解液中加入活性炭固體進行吸附脫毒處理，并用NaOH將pH調整至11，過濾，所得到濾液即為木質纖維素脫毒水解液。(5) 115°C滅菌 30min，冷卻待用。實施例3
本實施例說明利用木質纖維素脫毒水解液控制菌球形態方法的步驟。菌種本實施例的菌種均是工業生產中常用的具有典型代表的絲狀真菌，黑曲霉(AspergiIlus niger CICC 2160)孢子懸浮液、米根霉 0%辦0/ 狀 oryzae CICC 3087) 孢子懸浮液、少根根霉arrhizus NRRL 1526)孢子懸浮液、橘青霉腫 citrinum CICC 4011)孢子懸浮液。(1)培養基的配制基礎培養基包括，葡萄糖150 g/L，尿素4 g/L, KH2PO4 0.5 g/ L, MgSO4 · 7H20 1 g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 01 g/L, FeSO4 · 7H20 0. 01 g/L,葡萄糖禾口 KH2PO4, 金屬離子，尿素分開滅菌，115°C滅菌30min ；
(2)添加木質纖維素脫毒水解液在基礎培養基中按體積百分數為0.5%的量加入實施例1中所述木質纖維素脫毒水解液，用H2SO4將pH調控為6. 0，并控制500 mL搖瓶的最終裝液量為50 mL ；
(3)菌體的培養往步驟(1)所述培養基中加入黑曲霉Usper識7ΛΛ5niger CICC 2160)孢子懸浮液lmL，于35°C，搖床轉速為200rpm，培養72小時，獲得表面光滑的球狀團體，該細胞團體可以用作發酵生產檸檬酸的種子，也可用于生產殼聚糖/甲殼素所需的生物量。實施例4本實施例說明一種利用木質纖維素脫毒水解液控制菌球形態方法的效果。(1)培養基的配制基礎培養基包括，葡萄糖10 g/L，尿素2 g/L，KH2PO4 0. 6 g/L， MgSO4 · 7H20 0. 5 g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 02 g/L, FeSO4 · 7H20 0. 1 g/L,葡萄糖和 KH2PO4,金屬離子、尿素分開滅菌，115°C滅菌30min ；
(2)添加木質纖維素脫毒水解液在基礎培養基中按體積百分數為6%的量加入實施例 2中所述木質纖維素脫毒水解液，用H2SO4將pH調控為2. 6，并控制500mL搖瓶的最終裝液量為50mL ；不加入纖維素脫毒水解液的培養基作為對照。(3)菌體的培養往步驟(2)所述培養基中加入米根霉OWii^OT1S oryzae CICC 3087)孢子懸浮液lmL，于35°C，搖床轉速為200rpm，培養M小時，結果顯示對照組形成分散的菌絲體和少量菌球，加入纖維素水解脫毒液的培養基中菌體為表面光滑的球狀團體。實施例5
本實施例說明一種利用木質纖維素控制菌球生長形態方法進行富馬酸發酵生產的有益效果。(1)種子培養基的配制基礎培養基包括，木糖50 g/L，尿素2 g/L, KH2PO4 0.5 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5 g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 002 g/L, FeSO4 · 7H20 0. 05 g/L,葡萄糖和 KH2P04，金屬離子、尿素分開滅菌，115°C滅菌30min，
(2)添加木質纖維素脫毒水解液在基礎培養基中按體積百分數為m的量加入實施例 1中所述木質纖維素脫毒水解液，并控制500mL搖瓶的最終裝液量為50mL，不加入纖維素脫毒水解液的培養基作為對照，用H2SO4將pH調控為2. 0。(3)發酵培養基的配制葡萄糖120 g/L,尿素0. 1 g/L, KH2PO4 0. 6 g/L, MgSO4 ·7Η20 0.1 g/L，ZnSO4 · 7Η20 0.002 g/L, FeSO4 ·7Η20 0. 01 g/L,葡萄糖和 ΚΗ2Ρ04， 金屬離子、尿素分開滅菌，將過量CaCO3加入培養基中，使發酵過程中pH控制在5-6之間。(4)添加木質纖維素脫毒水解液在發酵培養基中按體積百分數為m的量加入實施例1中所述木質纖維素脫毒水解液，不加入纖維素脫毒水解液的培養基作為對照。(5)種子培養在步驟(1)中所獲得培養基中接種ImL少根根霉(脅辦印狀 arrhizus NRRL 1526)孢子懸浮液，于35°C，搖床轉速為200rpm，培養M小時，獲得表面光滑的菌球種子。(6)發酵培養將上述步驟(3)中所獲得種子液以15%的接種量接入步驟(2)所述的發酵培養基中，于35°C，搖床轉速為200rpm，培養72小時，獲得富馬酸發酵液。(7)結果顯示，發酵液中的富馬酸濃度為50. 1 g/L，對照組中的富馬酸濃度為45. 3 g/L。實施例6
本實施例說明一種利用木質纖維素控制菌球生長形態方法進行殼聚糖/幾丁質發酵生產的有益效果。(1)培養基的配制基礎培養基包括，木糖10 g/L，尿素0. 1 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5 g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 1 g/L, FeSO4 · 7H20 0. 01 g/L,葡萄糖和 KH2PO4,金屬離子、尿素分開滅菌，115 °C滅菌30 min。(2)添加木質纖維素在基礎培養基中按體積百分數為90%的量加入實施例2中所述木質纖維素脫毒水解液，并控制250 mL搖瓶的最終裝液量為50 mL，不加入纖維素脫毒水解液的培養基作為對照，用H2SO4將pH調控為2. 0。(2)菌體培養用搖瓶進行一級培養，培養條件為向培養基中接種橘青霉的孢子終濃度為2X IO9個/L，接入250 mL的搖瓶中，裝液量為50 mL，于溫度30 °C, 200 rmp下培養M小時，得到發酵種子；以10%的接種量接入7 L的攪拌式發酵罐中，裝液量為5 L，于 30 150 rmp，通氣量為0.5 vvm，培養12小時，得到含有甲殼素/殼聚糖的發酵產物。(3)甲殼素的提取將菌體烘干至恒重，向菌體中加入m的NaOH溶液，121 °〇消化兩小時，脫去蛋白質，離心，過濾；取沉淀物，加入m的乙酸60 °C處理2小時，離心，沉淀物即為甲殼素，水洗至中性，分別用95%乙醇和丙酮洗滌3次，干燥得到精制甲殼素。(4)殼聚糖的提取在殼聚糖提取過程中離心得到的上清液即為殼聚糖溶液，用 10%的NaOH溶液將溶液的PH調整至9. 0，離心取沉淀物，水洗至中性，即為殼聚糖粗品，加入m的乙酸60 V處理2小時，離心，沉淀物即為甲殼素，水洗至中性，分別用95%乙醇和丙酮洗滌3次，干燥得到精制殼聚糖。(5)結果對比見表1。 表1數據統計結果
權利要求
1.一種控制絲狀真菌發酵過程中生長形態的方法，其特征在于將木質纖維素水解后得到的水解液經脫毒處理后，添加至絲狀真菌發酵培養基中進行液體發酵培養，獲得球狀的具有生物催化活性的絲狀真菌團體。
2.根據權利要求1所述的控制絲狀真菌發酵過程中生長形態的方法，其特征在于所述的絲狀真菌是曲霉屬、根霉屬、毛霉屬、或者青霉屬。
3.根據權利要求1所述的控制絲狀真菌發酵過程中生長形態的方法，其特征在于所述的木質纖維素水解后得到的水解液是烯酸浸泡處理后的水解液、高溫加熱處理后的水解液、或者蒸爆酶解處理后的水解液。
4.根據權利要求1所述的控制絲狀真菌發酵過程中生長形態的方法，其特征在于所述的水解液的脫毒處理方法是加入活性炭脫毒處理、Ca(OH)2固體進行吸附脫毒處理、或者中和水解液酸性脫毒處理。
5.根據權利要求1所述的控制絲狀真菌發酵過程中生長形態的方法，其特征在于所述的木質纖維素水解后的水解液脫毒處理后PH值為6 11。
6.根據權利要求1所述的控制絲狀真菌發酵過程中生長形態的方法，其特征在于所述的絲狀真菌發酵培養基為葡萄糖或者木糖10 150 g/L，尿素0. 1 4 g/L，KH2PO4 0. 5 2g/L, MgSO4 · 7H20 0. 1 lg/L, ZnSO4 · 7H20 0. 002 0. lg/L, FeSO4 · 7Η200· 01 0.lg/L。
7.根據權利要求1所述的控制絲狀真菌發酵過程中生長形態的方法，其特征在于所述的脫毒后的木質纖維素水解液向培養基中的添加量為水解液體積占發酵培養基體積的 0. 5% 90%。
8.根據權利要求1所述的控制絲狀真菌發酵過程中生長形態的方法，其特征在于所述的液體發酵培養的條件是控制發酵PH值2 6，接入絲狀真菌孢子懸浮液，于30 35°C 下培養12 72小時。
全文摘要
本發明涉及一種控制絲狀真菌發酵過程中生長形態的方法，屬于生物工程領域。本發明將木質纖維素水解后得到的水解液經脫毒處理后，添加至絲狀真菌發酵培養基中進行液體發酵培養，獲得球狀的具有生物催化活性的絲狀真菌團體。本發明解決了現有技術條件中絲狀真菌成球控制條件苛刻，控制條件重復性差，菌球直徑分布不穩定等缺點。該技術手段操作條件范圍廣，操作簡便可行，可有效降低對設備的要求，使其相對于其他技術手段而言，更具有工業化競爭力。
文檔編號C12N1/14GK102212484SQ20111011477
公開日2011年10月12日 申請日期2011年5月5日 優先權日2011年5月5日
發明者徐晴, 李霜, 熊強, 顧帥, 黃和 申請人:南京工業大學