具有粘度改變表型的絲狀真菌的制作方法

具有粘度改變表型的絲狀真菌的制作方法
【專利摘要】本發明描述的是與具有改變的生長特性的變異絲狀真菌相關的組合物和方法。這種變體非常適于在深層培養中生長，例如用于大規模生產用于商業應用的酶和其他蛋白質。
【專利說明】具有粘度改變表型的絲狀真菌
[0001]優先權
[0002]本專利申請要求二者均于2011年4月22日提交的系列號為61/478，160和61/478，162的美國臨時申請和各自于2011年4月29日提交的系列號為61/480,602、61/480，610和61/480,629的美國臨時申請的優先權，特此這些申請案以引用的方式全文并入本文。
【技術領域】
[0003]本發明的菌株和方法涉及絲狀真菌中的基因突變，該基因突變產生具有改變的生長特性的菌株變體。這種變體非常適于在深層培養中生長，例如用于大規模生產用于商業應用的酶和其他蛋白質或代謝物。
【背景技術】
[0004]絲狀真菌能夠高水平表達天然和異源蛋白質，從而使得它們非常適于大規模生產用于工業應用、醫藥應用、動物健康應用以及食品和飲料應用的酶和其他蛋白質。通常在生物反應器中在菌絲體深層培養中培養絲狀真菌，所述生物反應器適于將氧氣和營養物質引入和分布進培養基(即發酵液)中。菌絲體的形態特征影響發酵液的流變特性，從而影響生物反應器性能。
[0005]一般來講，發酵液的粘度越高，氧氣和營養物質的分布越不均勻，攪拌培養物所需的能量越高。在一些情況下，發酵液的粘度變得足夠高而明顯妨礙氧氣和營養物質的溶解，從而不利地影響真菌的生長。另外，混合粘稠發酵液以及對粘稠發酵液進行充氣所需的能量可大大增加生產成本，以 及招致在馬達和電源供應方面的資本支出較高。

【發明內容】

[0006]本發明描述了涉及絲狀真菌的菌株和方法，所述絲狀真菌具有產生粘度改變表型的遺傳變更。
[0007]在一個方面，提供衍生自親本株的絲狀真菌變異株，該變異株包含能使變異株的細胞與親本株的細胞相比產生改變量的功能性GasI蛋白的遺傳變更，其中變異株的細胞在深層培養有氧發酵過程中，(i)與親本株的細胞相比，產生出需要改變的攪拌量來維持預選的溶氧量的細胞發酵液，和/或(ii)與親本株的細胞相比，產生出在預選的攪拌量下維持改變的溶氧量的細胞發酵液。
[0008]在一些實施例中，功能性Gasl蛋白的改變量為減少量，并且變異株在深層培養有氧發酵過程中，(i)與親本株的細胞相比，產生出需要減少的攪拌量來維持預選的溶氧量的細胞發酵液，和/或(ii)與親本株的細胞相比，在預選的攪拌量下維持增加的溶氧量的細胞發酵液。
[0009]在一些實施例中，遺傳變更包含親本株中所存在的gasl基因的破壞。在一些實施例中，破壞gasl基因是缺失gasl基因的全部或部分所致。在一些實施例中，破壞gasl基因是缺失包含gasl基因的基因組DNA的一部分所致。在一些實施例中，破壞gasl基因是誘變gasl基因所致。
[0010]在一些實施例中，破壞gasl基因是用位點特異性重組進行。在一些實施例中，破壞gasl基因是與在gasl基因的遺傳基因座處引入選擇性標記相結合來進行。
[0011]在一些實施例中，變異株不產生功能性Gasl蛋白。在一些實施例中，變異株不產生Gasl蛋白。
[0012]在一些實施例中，變異株還包含編碼所關注的蛋白質的基因。在一些實施例中，變異株還含sfb3基因的破壞。在一些實施例中，變異株還包含sebl基因的破壞。在一些實施例中，變異株還包含sfb3基因和sebl基因的破壞。在一些實施例中，變異株還包含至少一個選自如下的基因的破壞:sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因。在一些實施例中，變異株每單位量生物質產生與親本株基本上相同量或更多的蛋白質。
[0013]在一些實施例中，絲狀真菌為盤菌亞門(Pezizomycotina)物種。在一些實施例中，絲狀真菌為木霉屬(Trichoderma)物種、曲霉屬(Aspergillus)物種、鐮刀菌屬(Fusarium)物種、足放線病菌屬(Scedosporium)物種、青霉屬(Penicillium)物種、金孢子菌屬(Chrysosporium)物種、頭抱霉屬(Cephalosporium)物種、籃狀菌屬(Talaromyces)物種、Geosmithia屬物種和鏈孢霉屬(Neurospora)物種。在一些實施例中，絲狀真菌可包括但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)(此前分類為長梗木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)和紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、黑曲霉(Aspergillus niger) >煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、解烏頭酸曲霉(Aspergillus itaconicus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillusterreus) > 醬油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、多育賽多抱(Scedosporium pro lif icans)、粗糖脈抱霉(Neurospora crassa)、繩狀青霉(Penicillium funiculosum) > 產黃青霉(Penicillium chrysogenum) > 埃默森籃狀菌(Talaromyces (Geosmithia) emersonii)、腐皮鍵刀菌(Fusarium venenatum)和Chrysosporium lucknowense。在一些實施例中，絲狀真菌為里氏木霉。
[0014]在另一方面，提供制備絲狀真菌細胞的變異株的方法，該方法包括:將遺傳變更引入絲狀真菌細胞的親本株中，與親本株的細胞相比該遺傳變更改變了功能性Gasl蛋白的產生，從而產生變異絲狀真菌細胞，該變異絲狀真菌細胞在深層培養有氧發酵過程中，(i)與親本株的細胞相比，產生出需要改變的攪拌量來維持預選的溶氧量的細胞發酵液，和/或(ii)與親本株的細胞相比，產生出在預選的攪拌量下維持改變的溶氧量的細胞發酵液。
[0015]在一些實施例中，遺傳變更減少或防止功能性Gasl蛋白的產生，從而產生變異絲狀真菌細胞，該變異絲狀真菌細胞在深層培養有氧發酵過程中，(i)與親本株的細胞相比，產生出需要減少的攪拌量來維持預選的溶氧量的細胞發酵液，和/或(ii)與親本株的細胞相比，產生出在預選的攪拌量下維持增加的溶氧量的細胞發酵液。
[0016]在一些實施例中，遺傳變更包括利用遺傳操作破壞親本絲狀真菌細胞中的gasl基因。在一些實施例中，遺傳變更包括利用遺傳操作缺失親本絲狀真菌細胞中的gasl基因。在一些實施例中，遺傳變更利用位點特異性遺傳重組進行。
[0017]在一些實施例中，破壞gasl基因是與在gasl基因的遺傳基因座處引入選擇性標記相結合來進行。在一些實施例中，變異株每單位量生物質產生與親本株基本上相同量或更多的蛋白。在一些實施例中，破壞gasl基因是與破壞sfb3基因相結合進行。在一些實施例中，破壞gasl基因是與破壞至少一個選自sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因的基因相結合進打。
[0018]在一些實施例中，變異株每單位量生物質產生與親本株基本上相同量或更多的蛋白。
[0019]在一些實施例中，絲狀真菌為盤菌亞門物種。在一些實施例中，絲狀真菌為木霉屬物種、曲霉屬物種、鐮刀菌屬物種、足放線病菌屬物種、青霉屬物種、金孢子菌屬物種、頭孢霉屬物種、籃狀菌屬物種、白喬史密斯霉屬(Geosmithia)屬物種和鏈孢霉屬物種。在一些實施例中，絲狀真菌可包括但不限于里氏木霉(此前分類為長梗木霉和紅褐肉座菌)、黑曲霉、煙曲霉、解烏頭酸曲霉、米曲霉、構巢曲霉、土曲霉、醬油曲霉、日本曲霉、多育賽多孢、粗糙脈孢霉、繩狀青霉、產黃青霉、埃默森籃狀菌、腐皮鐮刀菌和勒克瑙金孢菌(Chrysosporium Iucknowense)。在一些實施例中，絲狀真菌為里氏木霉。
[0020]在一些實施例中，親本株還包含編碼所關注的蛋白質的基因。在一些實施例中，在引入減少或防止功能性Gasl蛋白的產生的遺傳變更之前，編碼所關注的蛋白質的基因存在于親本株中。在一些實施例中，親本株內的所關注的蛋白質由內源基因或異源基因編碼。
[0021]在另一方面，提供由上述變異株中任一者產生的所關注的蛋白質。
[0022]在又一方面，提供由上述方法中任一者產生的且具有上述特性中任一者的絲狀真菌。
[0023]在另一方面，提供衍生自親本株的絲狀真菌變異株，該變異株包含:(a)遺傳變更，所述遺傳變更使得(i)與親本株的細胞相比，深層培養物中需要減少的攪拌量來維持預選的溶氧量，和/或(ii)與親本株的細胞相比，在預選的攪拌量下維持深層培養物中增加的溶氧量；和(b)編碼所關注的蛋白質的基因，其中所述編碼所關注的蛋白質的基因在(a)中的遺傳變更之前存在于變異株中。
[0024]在一些實施例中，導致變異株的遺傳變更包含親本株中所存在的gasl基因的破壞。在一些實施例中，破壞gasl基因是與在gasl基因的遺傳基因座處引入選擇性標記相結合進行。在一些實施例中，破壞gasl基因是與破壞sfb3基因相結合進行。在一些實施例中，破壞gasl基因是與破壞sebl基因相結合進行。在一些實施例中，破壞gasl基因是與破壞至少一個選自sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因的基因相結合進行。
[0025]根據本說明書(包括附圖)，本發明的變異株和方法的這些及其他的方面和實施例將顯而易見。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為如實例I中所述的gasl破壞載體pRATT247-gaslD_pyr2的圖譜。
【具體實施方式】
[0027]1.綜沭
[0028]本發明的菌株和方法涉及具有影響其形態和生長特性的遺傳修飾的絲狀真菌細胞變異株。當在深層培養中培養該變異細胞時，其產生與包含親本株細胞的細胞發酵液相比具有不同流變特性的細胞發酵液。這些變異株中的一些非常適于大規模生產酶及其他在商業上重要的蛋白質。
[0029]IL 穿 SL
[0030]在詳細描述本發明菌株和方法之前，為了清楚起見對如下術語進行定義。未定義的術語應該與它們在相關領域中所用的普通含義一致。
[0031]如本文所用，“里氏木霉”是指子囊菌門(Ascomycota)盤菌亞門的絲狀真菌。該生物體此前被分類為長梗木霉或被分類為紅褐肉座菌。
[0032]如本文所用，短語“絲狀真菌細胞的變異株”或類似短語是指例如通過遺傳操作，從屬于盤菌亞門的親本(或參照)株衍生(即從其獲得或可從其獲得)的絲狀真菌細胞的株系。在本說明書中，親本株和變異株可描述為具有某些特性，例如遺傳修飾、表達表型、形態等等；然而，本領域技術人員將理解，在技術上其為具有這些特性的親本株或變異株的細胞，并且為了方便而稱為“菌株”。
[0033]如本文所用，術語“所關注的蛋白質”是指期望在絲狀真菌中表達的多肽。這種蛋白質可以是酶、底物結合蛋白、表面活性蛋白、結構蛋白等等，并且可以高水平表達，且可用于商業化目的。所關注的蛋白質可由相對于變異株和/或親本株的內源基因或異源基因編碼。所關注的蛋白質可在細胞內表達或作為分泌性蛋白表達。
[0034]如本文所用，短語“基本上無活性”或類似短語，意指特定的活性在混合物中不能檢測到或者其存在量不會干擾該混合物的預期目的。
[0035]如本文所用，術語“多肽”和“蛋白質”(和/或它們各自的復數形式)可互換使用來指包含肽鍵連接的氨基酸殘基的任何長度的聚合物。本文中使用氨基酸殘基的常規單字母或三字母代碼。該聚合物可以是直連或支鏈的，其可包含經修飾的氨基酸，并且其可夾雜有非氨基酸。該術語還包含已經以天然方式或通過干預進行修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他的操作或修飾，例如與標記組分綴合。還包括在該定義中的是例如含有一個或多個氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本領域已知的其他修飾的多肽。
[0036]如本文所用，在功能上和/或在結構上類似的蛋白質視為“相關蛋白”。這類蛋白質可衍生自不同屬和/或種的生物體，或甚至不同綱的生物體(例如細菌和真菌)。相關蛋白還涵蓋通過一級序列分析確定、通過二級或三級結構分析確定或通過免疫交叉反應確定的同源物。
[0037]如本文所用，術語“衍生的多肽/蛋白質”是指通過在N末端或C末端任一端或這兩個末端添加一個或多個氨基酸、在氨基酸序列中的一個或多個不同位點置換一個或多個氨基酸、在蛋白質的任一端或兩個末端或在氨基酸序列中的一個或多個位點缺失一個或多個氨基酸和/或在氨基酸序列中的一個或多個位點插入一個或多個氨基酸而衍生自或可衍生自蛋白質的蛋白質。可通過修飾編碼天然蛋白質的DNA序列、將該DNA序列轉化進合適的宿主中并使該經修飾的DNA序列表達而形成衍生的蛋白質來實現蛋白質衍生物的制備。
[0038]相關的(和衍生的)蛋白質包括“變體蛋白”。變體蛋白與參照/親本蛋白(例如野生型蛋白)的差別在于少數氨基酸殘基的置換、缺失和/或插入。變體蛋白與親本蛋白質間的差異氨基酸殘基的數目可以為一個或多個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40,50或更多個氨基酸殘基。變體蛋白可與參照蛋白具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91 %、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或甚至至少約99或更多的氨基酸序列同一性。變體蛋白與參照蛋白的差別還可在于所選的基序、結構域、表位、保守區等等。
[0039]如本文所用，術語“類似序列”是指蛋白質內提供與所關注的蛋白質(即通常是所關注的起始蛋白質)類似的功能、三級結構和/或保守殘基的序列。例如，在含有a-螺旋或片層結構的表位區域中，類似序列中的置換氨基酸優選維持相同的特異性結構。該術語還指核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些實施例中，開發類似序列使得置換氨基酸導致顯示類似或改善功能的變體酶。在一些實施例中，所關注蛋白質中的氨基酸的三級結構和/或保守殘基位于或接近所關注的區段或片段。因而，若所關注的區段或片段含有例如a -螺旋或P -片層結構，則置換氨基酸優選維持該特異性結構。
[0040]如本文所用，術語“同源蛋白”是指具有與參照蛋白類似的活性和/或結構的蛋白質。同源物不一定是進化相關的。因而，意圖是該術語涵蓋從不同生物體獲得的相同、類似或對應的酶(例如，就結構和功能而言)。在一些實施例中，希望鑒別具有與參照蛋白類似的四級、三級和/或一級結構的同源物。在一些實施例中，同源蛋白誘導與參照蛋白類似的免疫應答。在一些實施例中，同源蛋白經工程改造而產生具有所需活性的酶。
[0041]序列之間的同源程度可用本領域已知的任何合適方法測定(參見例如，Smith和Waterman (1981) Adv.Appl.Math.(《應用數學進展》)2:482 ;Needleman 和 Wunsch (1970)J.Mol.Biol.(《分子生物學雜志》)，48:443 ;Pearson 和 Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國科學院院刊》)85:2444 ;諸如威斯康星遺傳軟件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package)(威斯康星州麥迪遜的 GCG 公司(Genetics Computer Group,Madison,WI))中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA 之類的程序；和 Devereux 等人(1984)NucleicAcids Res.(《核酸研究》)12:387-95)。
[0042]例如，PILEUP是測定序列同源性水平的有用程序。PILEUP利用漸進性雙序列比對從一組相關序列產生多序列比對。其還可以繪出關系樹，該關系樹示出了用于產生比對的聚類關系。PILEUP 使用 Feng和 Doolittle (Feng和 Doolittle (1987) J.Mol.Evo1.(《分子進化雜志》)35 =351-60)的漸進比對方法的簡化形式。該方法類似于Higgins和Sharp ((1989)CAB10S5:151-53)所描述的方法。可用的PILEUP參數包括:默認空位權重=3.00，默認空位長度權重=0.10，以及加權的末端空位。可用的算法的另一個例子為BLAST算法，該算法由Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.(《分子生物學雜志》)215 =403-10)和Karlin等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國科學院院刊》)90:5873-87)描述。一種特別有用的 BLAST 程序為 WU-BLAST-2 程序(參見例如，Altschul 等人(1996)Meth.Enzymol.(《酶學方法》)266:460-80)。參數“W”、“T”和“X”決定比對的靈敏度和速度。BLAST程序使用如下默認值:字長(W) = 11、BL0SUM62打分矩陣(參見例如，Henikoff和Henikoff (1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (《美國科學院院刊》)89:10915)、比對(B) = 50，期望值(E)=
10、M' 5、N' -4以及對兩條鏈均進行比較。
[0043]如本文所用，在至少兩個核酸或多肽的情況下，短語“基本上相似”和“基本上相同”通常意指與參照(例如野生型)序列相比，多核苷酸或多肽包含具有至少約70%同一性、至少約75%同一‘丨生、至少約80%同一‘丨生、至少約85%同一‘丨生、至少約90%同一‘丨生、至少約91 %同一丨丨生、至少約92%同一丨丨生、至少約93%同一丨丨生、至少約94%同一丨丨生、至少約95%同一性、至少約96%同一性、至少約97%同一性、至少約98%同一性或甚至至少約99%同一性或更高同一性的序列。序列同一性可用已知的程序如BLAST、ALIGN和CLUSTAL，使用標準參數測定。(參見例如，Altschul等人，(1990) J.Mol.Biol.(《分子生物學雜志》)215:403-410 ;Henikoff 等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國科學院院刊》)89:10915 ；Karin 等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA(《美國科學院院刊》)90:5873 ;和 Higgins等人(1988)Gene(《基因》)73:237-244)。用于進行BLAST分析的軟件可通過國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。另外，可用FASTA(Pearson 等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《(美國科學院院刊》)85 =2444-48)搜索數據庫。兩個多肽基本上相同的一個指示是第一多肽與第二多肽是免疫交叉反應性的。通常，差別在于保守氨基酸置換的多肽是免疫交叉反應性的。因而，例如，若兩個肽差別僅在于保守置換，則多肽基本上與第二多肽相同。兩條核酸序列基本上相同的另一個指示是，兩個分子在嚴格條件(例如在中到高的一系列嚴格性內)彼此雜交。
[0044]如本文所用，術語“基因”與術語“等位基因”在關于編碼和引導蛋白質或RNA表達的核酸時是同義的。絲狀真菌的營養體形式通常是單倍體，因而單拷貝的指定基因(即單個等位基因)足以賦予指定表型。
[0045]如本文所用，術語“野生型的”和“天然的”可互換使用并且是指自然中存在的基因、蛋白質或株系。
[0046]如本文所用，“缺失基因”是指從宿主細胞的基因組移除基因。若基因包括未緊鄰基因的編碼序列的控制元件(例如，增強子元件)，則缺失基因是指缺失該編碼序列，以及任選缺失相鄰的增強子元件，包括但不限于例如啟動子和/或終止子序列。
[0047]如本文所用，“破壞基因”廣義地指基本上在宿主細胞中防止細胞產生功能基因產物，例如蛋白質的任何遺傳或化學操作，即突變。破壞方法的例子包括完全或部分缺失基因的任何部分，包括多肽編碼序列 、啟動子、增強子或另一調控元件，或者誘變上述者，其中誘變涵蓋置換、插入、缺失、倒位以及它們的組合和變型形式，上述突變中的任一者基本上防止功能基因產物的產生。基因還可以利用RNA1、反義或廢止基因表達的任何其他方法來破壞。
[0048]如本文所用，術語“遺傳操作”和“遺傳變更”可交換使用并且是指核酸序列的變更/改變。該變更可包括但不限于核酸序列中的至少一個核酸的置換、缺失、插入或化學修飾。
[0049]如本文所用，“有氧發酵”是指在存在氧氣的情況下的生長。
[0050]如本文所用，術語“細胞發酵液”統指液體/深層培養物中的培養基和細胞。
[0051]如本文所用，術語“細胞群”是指液體/深層培養物中存在的細胞組分(包括完整的和溶解的細胞)。細胞群可以干重或濕重表示。
[0052]如本文所用，術語“流變學”是指研究物質形變和流動的物理學分支。
[0053]如本文所用，“粘度”是流體對機械應力(如剪切應力或拉伸應力)引起的形變的抗性的量度。在本發明語境中，粘度還可以指包含絲狀真菌細胞的細胞發酵液對機械應力(例如通過轉子/葉輪所提供的機械應力)的抗性。由于細胞發酵液的粘度可能難以直接測量，可使用粘度的間接量度，如在預選攪拌量下培養物發酵液的溶氧量、維持預選溶氧量所需的攪拌量、攪拌細胞發酵液以維持所選溶氧量所需的能量量或甚至是固體培養基上的集落形態。
[0054]如本文所用，絲狀真菌細胞的“粘度改變”變異株是指產生這樣的細胞發酵液的變異株，該細胞發酵液與親本株產生的等價細胞發酵液相比具有減少的或增加的粘度(即，減少的或增加的對剪切或拉伸應力的抗性)。一般來講，相當的細胞發酵液或等價的細胞發酵液具有相當的細胞群。優選地，關于粘度的任何直接或間接量度，粘度改變的變異株與親本株之間的差別為至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或甚至至少50%或更多。本發明描述了用于比較絲狀真菌細胞發酵液的粘度的方法。
[0055]如本文所用，絲狀真菌細胞的“粘度降低”變異株是指產生這樣的細胞發酵液的變異株，該細胞發酵液與親本株產生的等價細胞發酵液相比具有減少的粘度(即減少的對剪切或拉伸應力的抗性)。優選地，關于粘度的任何直接或間接量度，粘度改變的變異株與親本株之間的差別為至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或甚至至少50%或更多。
[0056]如本文所用，“溶氧”(DO)是指以體積/體積單位測量的液體培養基中存在的氧
(O2)量。在整個發酵過程中，溶氧水平可維持在高的水平，例如170-100%至20%之間、100-80%至20%之間、70%至20%之間、65%至20%之間、60%至20%之間、55%至20%之間、50%至20%之間、45%至20%之間、44%至20%之間、43%至20%之間、42%至20%之間、41%至20%之間、40%至20%之間、35%至20%之間、30%至20%之間以及25%至20%之間。具體地講，溶氧可在發酵開始時高并且允許隨著發酵進行而下降。溶氧水平可通過攪拌(例如攪動)發酵物的速率和/或通過添加空氣或氧氣的速率來控制。可以400-700rpm攪拌(如攪動)培養物并且通過改變空氣或氧氣流量和葉輪速度將溶氧水平維持在聞于20*%、聞于25*%、聞于30*%、聞于35*%、聞于40*%、聞于45*%、聞于50%和聞于55%或更高。
[0057]如本文所用，“主要遺傳定子”是指基因或其遺傳操作，該基因或其遺傳操作是在缺少其他基因或其他基因的遺傳操作的情況下賦予指定表型所必要且充分的。然而，特定基因是賦予指定表型所必要且充分 的并不排除可通過進一步的遺傳操作實現對表型的附加影響的可能性。
[0058]如本文所用，“功能性多肽/蛋白質”為具有活性，例如酶活性、結合活性、表面活性性質等，并且尚未被誘變、截短或以其他方式修飾來廢止或降低該活性的蛋白質。如所指定的，功能性多肽可以是熱穩定性的或不耐熱的。
[0059]如本文所用，“功能性基因”為能夠被細胞組分用于產生活性基因產物、通常是蛋白質的基因。功能性基因是被破壞的基因的對立物，被破壞的基因被修飾而使得它們不能被細胞組分用于產生活性基因產物，或者具有降低的被細胞組分用于產生活性基因產物的能力。
[0060]如本文所用，如果變異株與親本株之間蛋白質的表達差異小于約20%、小于約15 %、小于約10 %、小于約7 %、小于約5 %、或甚至小于約3 %，則相比于親本株，變異細胞“維持或保持高的蛋白質表達和/或分泌水平”。
[0061]如本文所用，如果宿主細胞已通過遺傳方式或化學方式改變而防止產生表現具有野生型蛋白質的特征性活性、尤其是促進菌絲伸長或以其他方式增加液體培養物中絲狀真菌的粘度的活性的功能性蛋白質/多肽，則宿主細胞已經“經過修飾而防止產生規定的蛋白質”。這類修飾包括但不限于缺失或破壞編碼該蛋白質的基因、修飾該基因而使得所編碼的多肽缺少上述活性、修飾該基因以影響翻譯后加工或穩定性、以及它們的組合。
[0062]如本文所用，“所關注的蛋白質”為期望在絲狀真菌細胞的深層培養中產生的蛋白質。一般來講，所關注的蛋白質在商業上對于工業用途、醫藥用途、動物健康用途以及食品和飲料用途而言是重要的，從而使得期望它們大量產生。所關注的蛋白質應區別于絲狀真菌細胞表達的無數其他蛋白質，這些其他蛋白質通常不是所關注的產品并且主要視為本底蛋白質污染物。
[0063]如本文所用，如果相比于親本株產生的蛋白質的量，變異株產生的蛋白質的量減少不超過20 %、不超過15 %、不超過10 %、甚至不超過5 %，則變異株每單位量生物質產生與親本株“基本上相同的量”的蛋白質，其中蛋白量被歸一化至從中測定蛋白質產量的細胞的生物質總量，其中生物質可以濕重(如細胞團塊)或干重表示。
[0064]如本文所用，如果相比于親本株，變異株產生的蛋白質的量增加至少5 %、至少10%>至少15%或更多，則變異株每單位量生物質產生比親本株“基本上更多的蛋白質”，其中蛋白量被歸一化至從中測定蛋白質產量的細胞的生物質總量，其中生物質可以濕重(如細胞團塊)或干重表示。
[0065]如本文所用，“熒光染料”為發熒光的染料。優選的熒光染料與真菌細胞壁中的纖維素和/或幾丁質結合。
[0066]如本文所用，單數冠詞“一個”、“一種”和“所述”涵蓋多個指代物，除非上下文明確指明不是這樣。特此以引用的方式將本文所引用的所有參考文獻全文并入本文。如下縮寫/首字母縮寫具有如下含義，除非另外規定:
[0067]
【權利要求】
1.一種衍自親本株的絲狀真菌變異株，所述變異株包含使所述變異株的細胞與所述親本株的細胞相比產生改變量的功能性Gasl蛋白的遺傳變更，其中所述變異株的細胞在深層培養有氧發酵過程中，(i)與所述親本株的細胞相比，產生出需要改變的攪拌量來維持預選的溶氧量的細胞發酵液，和/或(ii)與所述親本株的細胞相比，產生出在預選的攪拌量下維持改變的溶氧量的細胞發酵液。
2.根據權利要求1所述的變異株，其中功能性Gasl蛋白的所述改變量為減少量，并且所述變異株在深層培養有氧發酵過程中，(i)與所述親本株的細胞相比，產生出需要減少的攪拌量來維持預選的溶氧量的細胞發酵液，和/或(ii)與所述親本株的細胞相比，產生出在預選的攪拌量下維持增加的溶氧量的細胞發酵液。
3.根據權利要求1或2所述的變異株，其中所述遺傳變更包含所述親本株中存在的gasl基因的破壞。
4.根據權利要求3所述的變異株，其中破壞所述gasl基因是缺失所述gasl基因的全部或部分所致。
5.根據權利要求3所述的變異株，其中破壞所述gasl基因是缺失包含所述gasl基因的基因組DNA的一部分所致。
6.根據權利要求3所述的變異株，其中破壞所述gasl基因是誘變所述gasl基因所致。
7.根據權利要求3-6中任一項所述的變異株，其中破壞所述gasl基因是使用位點特異性重組進行。
8.根據權利要求3-7中任一項所述的變異株，其中破壞所述gasl基因是與在所述gasl基因的遺傳基因座處引入 可選擇標記相結合進行。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的變異株，其中所述變異株不產生功能性Gasl蛋白。
10.根據權利要求1-8中任一項所述的變異株，其中所述變異株不產生Gasl蛋白。
11.根據權利要求1-10中任一項所述的變異株，其中所述變異株還包含編碼目的蛋白質的基因。
12.根據權利要求1-11中任一項所述的變異株，還包含sfb3基因的破壞。
13.根據權利要求1-12中任一項所述的變異株,還包含破壞至少一個選自sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因的基因。
14.根據權利要求1-13中任一項所述的變異株，其中所述變異株每單位量生物質產生的蛋白質量與所述親本株基本上相同或更多。
15.根據權利要求1-14中任一項所述的變異株，其中所述絲狀真菌是盤菌亞門(Pezizomycotina)物種。
16.根據權利要求1-15中任一項所述的變異株，其中所述絲狀真菌是木霉屬(Trichoderma)物種。
17.根據權利要求1-16中任一項所述的變異株，其中所述絲狀真菌是里氏木霉(Trichoderma reesei)。
18.—種制備絲狀真菌細胞的變異株的方法，包括:將遺傳變更引入絲狀真菌細胞的親本株中，與所述親本株的細胞相比所述遺傳變更改變了功能性Gasl蛋白的產生，從而產生變異絲狀真菌細胞，所述變異絲狀真菌細胞在深層培養有氧發酵過程中，(i)與所述親本株的細胞相比，產生出需要改變的攪拌量來維持預選的溶氧量的細胞發酵液，和/或(ii)與所述親本株的細胞相比，產生出在預選的攪拌量下維持改變的溶氧量的細胞發酵液。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述遺傳變更減少或防止功能性Gasl蛋白的產生，從而產生變異絲狀真菌細胞，所述變異絲狀真菌細胞在深層培養有氧發酵過程中，(i)與所述親本株的細胞相比，產生出需要減少的攪拌量來維持預選的溶氧量的細胞發酵液，和/或(ii)與所述親本株的細胞相比，產生出在預選的攪拌量下維持增加的溶氧量的細胞發酵液。
20.根據權利要求18或19所述的方法，其中所述遺傳變更包括利用遺傳操作破壞親本絲狀真菌細胞中的gasl基因。
21.根據權利要求18-20中任一項所述的方法，其中所述遺傳變更包括利用遺傳操作缺失親本絲狀真菌細胞中的gasl基因。
22.根據權利要求18-21中任一項所述的方法，其中所述遺傳變更是使用位點特異性遺傳重組進行。
23.根據權利要求18-22中任一項所述的方法，其中破壞所述gasl基因是與在所述gasl基因的遺傳基因座處引入可選擇標記相結合進行。
24.根據權利要求18-23中任一項所述的方法，其中破壞gasl基因是與破壞sfb3基因相結合進行。
25.根據權利要求18-24中任一項所述的方法，其中破壞gasl基因是與破壞至少一個選自sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因的基因相結合進行。
26.根據權利要求18-25中任一項所述的方法，其中所述變異株每單位量生物質產生的蛋白質量與所述親本株基本上相同`或更多。
27.根據權利要求18-26中任一項所述的方法，其中所述絲狀真菌是盤菌亞門物種。
28.根據權利要求18-27中任一項所述的方法，其中所述絲狀真菌是木霉屬物種。
29.根據權利要求18-28中任一項所述的方法，其中所述絲狀真菌是里氏木霉。
30.根據權利要求18-29中任一項所述的方法，其中所述親本株還包含編碼目的蛋白質的基因。
31.根據權利要求30所述的方法，其中在引入所述減少或防止功能性Gasl蛋白的產生的遺傳變更之前，所述編碼目的蛋白質的基因存在于所述親本株中。
32.一種目的蛋白質，所述蛋白質由根據權利要求11所述的變異株產生。
33.一種絲狀真菌變異株，所述絲狀真菌變異株通過根據權利要求18-31中任一項所述的方法產生。
34.一種衍自親本株的絲狀真菌變異株，所述變異株包含: (a)遺傳變更，所述遺傳變更導致(i)與所述親本株的細胞相比，在深層培養物中需要減少的攪拌來維持預選的溶氧量，和/或(ii)與所述親本株的細胞相比，在預選的攪拌量下維持深層培養物中增加的溶氧量，和 (b)編碼目的蛋白質的基因， 其中所述編碼目的蛋白質的基因在(a)中的所述遺傳變更之前存在于所述變異株中。
35.根據權利要求34所述的變異株，其中所述遺傳變更包含所述親本菌株中存在的gasl基因的破壞。
36.根據權利要求35所述的變異株，其中破壞所述gasl基因是與在所述gasl基因的遺傳基因座處引入可選擇標記相結合進行。
37.根據權利要求35或36所述的變異株，其中破壞所述gasl基因是與破壞至少一個選自sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因的基因相結合進行。
38.根據權利要求35-37中任一項所述的變異株，其中破壞所述gasl基因是與破壞sebl基因 相結合進行。
【文檔編號】C12N1/14GK103502266SQ201280019710
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年4月20日 優先權日:2011年4月22日
【發明者】E·A·博迪, R·J·普萊特二世 申請人:丹尼斯科美國公司