一種里氏木霉突變菌株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明利用輻射誘變技術獲得一株高產纖維素酶的里氏木霉突變菌株LA2-7，其保藏編號為CCTCC NO:,2014564。該突變株LA2-7發酵上清液酶活為3282U/mL，比出發菌提高了276％，蛋白含量為12.2g/L，比出發菌提高了237％。此外，突變株LA2-7的菌落明顯小于出發菌，且菌絲比出發菌的菌絲粗、短，分枝多，有利于在生產過程中降低發酵菌液的粘度，進而可以降低攪拌速度，提高溶氧，能有效降低生產成本，應用前景廣泛。
CCTCC NO：M2014564
20141112
【專利說明】一種里氏木霉突變菌株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物篩選【技術領域】，具體涉及一種里氏木霉突變菌株及其應用。
【背景技術】
[0002] 里氏木霉（Trichoderma reesei)是一種絲狀真菌，屬于多細胞的真核微生物，是 紅褐肉座菌（Hypocrea jecorina)的無性型，分類上隸屬于真菌門、半知菌亞門、絲孢綱、叢 梗孢目、木霉屬。里氏木霉廣泛分布于自然界，在腐木、種籽、植物殘體、有機肥、土壤和甚至 是空氣中（Montenecourt& Eveleigh, 1979, Adv Chem Ser.)。
[0003] 里氏木霉能表達多種胞外纖維素酶和半纖維素酶，包括外切纖維素酶（CBHl和 CBH2)、內切纖維素酶（EG1、EG2、EG3、EG4和EG5等）、beta-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和甘露 聚糖酶等。通過這些纖維素酶和半纖維素酶的協同作用，將纖維素徹底分解為單糖（Biely & Tenkanen. 1998, In Trichoderma and Gliocladium)，因此，木霉產纖維素酶已經是二代 纖維素生物乙醇的主要酶制劑來源。
[0004] 但成本過高已經成為限制纖維素乙醇產業化開發的關鍵，尤其纖維素酶的成本。 當前，每噸纖維素的成本中，纖維素酶的成本超過了 2000元。因此篩選高產纖維素酶的菌 株是降低生產乙醇成本的關鍵因素之一。而影響木霉纖維素酶表達的因素很多。首先，培 養碳源的影響：纖維素，乳糖和槐糖用來誘導木霉產纖維素酶；葡萄糖和甘油等阻遏纖維 素酶的表達。碳源的誘導作用是調控因子來影響表達的，如與誘導表達相關的正調控因子 是 ACEII 和 XYR1，而負調控因子是 CREl 和 ACEI (Ilme' n et al·，1997, Mol. Gen. Genet.; Foreman et al.，2003, J. Biol. Chem.)。其次，菌體（菌絲）形態也是影響分泌表達的關鍵 因素之一。一般認為，絲狀真菌是通過頂端分泌來輸出胞外蛋白的。因此，高效分泌菌株形 態上往往是多分枝的。
[0005] 然而從自然界中直接篩選到的木霉菌株產酶水平往往很低，不適合商業生產。因 此，如何通過現有技術改造木霉菌株提高其胞外蛋白含量，以降低生產成本就成為本領域 的研究熱點之一。
【發明內容】
[0006] 本發明為解決現有技術問題，提供了一種里氏木霉突變菌株及其在產纖維素酶方 面的應用。所述突變菌株是通過輻射誘變的方法獲得的，能高產纖維素酶，進而有效降低纖 維素酶的生產成本，有利于其廣泛應用。
[0007] 本發明一方面提供了一株里氏木霉（Trichoderma reesei)突變菌株LA2-7,已于 2014年11月12日保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO ：M2014564〇
[0008] 本發明還提供了上述里氏木霉突變菌株在纖維素酶生產中的應用。
[0009] 本發明還提供一種生產纖維素酶的方法，是用上述的里氏木霉突變菌株發酵來制 備的；
[0010] 用于發酵的培養基的組成為葡萄糖15. Og/L、乳糖16. Og/L，玉米楽25. 0ml/L， (NH4)2SO4 5. Og/L，MgSO4 l.Og/L，KH2PO4 20g/L，CaCl2 0.4g/L，吐溫-80 0.2ml/L，微量元 素 0.2ml/L，聚丙二醇-2000 0.2ml/L，Na0H 1.0g/L，pH 值 5.0。其中微量元素溶液（g/ U 的組成為：CuSO4 · 5Η200· 048mol/L，FeSO4 · 7H20 0· 18mol/L，CoCl2 · 6H20 0· 034mol/L， MnCl2 · 4H20 0. 08mol/L〇
[0011] 本發明利用輻射誘變技術獲得一株高產纖維素酶的里氏木霉突變菌株LA2-7,該 突變株LA2-7發酵上清液酶活為3282U/mL，比出發菌提高了 276%，蛋白含量為12. 2g/L，比 出發菌提高了 237%。此外，突變株LA2-7的菌落明顯小于出發菌，且菌絲比出發菌的菌絲 粗、短，分枝多，有利于在生產過程中降低發酵菌液的粘度，進而可以降低攪拌速度，提高溶 氧，能有效降低生產成本，應用前景廣泛。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012] 圖1 :出發菌和突變菌的菌落形態比較，其中：A為出發菌L-10，B為突變菌LA2-7 ;
[0013] 圖2 :出發菌和突變菌的菌絲形態比較，其中：A為出發菌L_10，B為突變菌LA2-7。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合具體的實施方案對本發明進行更詳細的描述。但本發明并不受所述實施 例的限制。提供實施方案的目的是為了使說明書全面而透徹，并向本領域的技術人員全面 傳達發明的范圍。除另定義外，本發明所使用的所有技術和科學術語均具有作為本發明所 屬【技術領域】中普通技術人員通常理解的同樣的含義。
[0015] 實施例1里氏木霉菌株的誘變篩選
[0016] 1、菌種處理：
[0017] 將出發菌株里氏木霉L-10 (該菌株是本申請的發明人黃亦鈞于2010年從青島市 嶗山區林場土壤中篩選到的）接種于PDA瓊脂平板（馬鈴薯200-300克，葡萄糖20克，瓊脂 15-20克，自來水1000毫升，自然pH)上，28-30°C恒溫培養1周至穩定期。待孢子成熟后， 往平板上加入5-10ml無菌水洗刷孢子，吸取孢子懸液并計數，依據孢子含量用調整其濃度 至KT 6個/ml，然后進行后續誘變處理。
[0018] 2、核輻射誘變篩選：
[0019] 取上述孢子懸液50ul加入無菌I. 5ml離心管中，共100管，送山東省農科院原子 能所進行60C〇輻射處理，照射劑量分別為l，2,4kGy。誘變后的懸液經適當稀釋涂平板，在 28 - 37°C下倒置避光培養7 - 20天。待平板上呈現肉眼可見的菌落是開始第一次篩選，長 出菌落轉移到另外的平板劃線；最后，挑取菌落形態明顯小于出發菌的突變體菌分別接種 到PDA瓊脂平板。
[0020] 實施例2高產纖維素酶突變菌株的篩選
[0021] 1、利用24深孔板篩選：
[0022] 在24深孔板的孔中各加入3_4ml誘導培養基（誘導培養基（--Μ)的組成為葡萄 糖 15. 0g/L、乳糖 16. 0g/L，玉米漿 25. 0ml/L，（NH4)2S045. 0g/L，MgS04 I. 0g/L，KH2P04 20g/L， CaCl2 0.4g/L，吐溫-80 0.2ml/L，微量元素 0.2ml/L，聚丙二醇-2000 0.2ml/L，Na0H LOg/ L，pH 值 5· 0。其中微量元素溶液（g/L)的組成為：CuSO4 · 5H20 0· 048mol/L，FeSO4 · 7H20 0· 18mol/L，CoCl2 ·6Η20 0· 034mol/L，MnCl2 ·4Η20 0· 08mol/L)。然后將實施例 1 中篩選到的 突變株分別接種于各個孔中，置于搖床上，培養方法為發酵溫度為28°C，搖床轉速為200r/ min，培養2天；然后25°C培養2天。培養結束后，分別離心取上清進行酶活檢測和SDS-PAGE 電泳檢測。根據檢測結果，篩選出酶活和胞外蛋白含量顯著高于出發菌的突變菌共7株，分 別命名為 LA2-1，LA2-2, LA2-3, LA2-4, LA2-5, LA2-6 和 LA2-7。
[0023] (1)酶活測定的方法：CMC法
[0024] (2)測定的原理：纖維素酶能將羧甲基纖維素降解成寡糖和單糖。具有還原性末 端的寡糖和單糖在沸水浴條件下可以與3, 5-二硝基水楊酸（DNS)試劑發生顯色反應。反 應液顏色的深度與酶解產生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應液中纖維素酶 的活力成正比。因此，通過分光比色測定反應液顏色的強度，可以計算反應液中纖維素酶的 活力。
[0025] (3)測定過程：取三支試管各加入0. 5mlCMC底物，與待測酶液一起50°C水浴預熱 5min。在第一、二試管中各加入0. 5ml待測液，并計時，50°C水浴中反應15min。反應完后在 三支試管中各加入I. 5ml的DNS試劑，并在第三支試管中補加0. 5ml的待測酶液。取出并 搖勻三支試管后，在沸水浴中反應5min。迅速冷卻至室溫，用水定容至5. 0ml。以第三支試 管液為對照在540nm波長條件下測得第一、二試管液的吸光度。根據預先繪制的標準曲線 計算出酶活力值。
[0026] (4)酶活力計算：
[0027] 酶活力（IU/ml 或 IU/g)=(葡萄糖等量值 /180/15/0. 5) Xn
[0028] 式中：180-葡萄糖從微克換算成微摩爾
[0029] 15-待測液與底物的反應時間
[0030] 0. 5一加入反應的待測酶液量
[0031] η-酶樣的稀釋倍數
[0032] 2、搖瓶篩選：
[0033] 將上述出發菌株 L-IO 和 7 株突變菌（LA2-1，LA2-2, LA2-3, LA2-4, LA2-5, LA2-6 和 LA2-7)分別接種于500ml三角瓶中（含50ι?1--Μ誘導培養基），置于搖床上，28°C，200rpm， 培養5-7天。培養結束后，分別離心取上清，進行酶活檢測（CMC酶活檢測法）和蛋白含量 測定（考馬斯亮藍檢測法），結果如表1所示。
[0034]
【權利要求】
1. 一種里氏木霉，其特征在于，所述的里氏木霉的保藏編號為CCTCC N0:M2014564。
2. 權利要求1所述的里氏木霉在纖維素酶生產中的應用。
3. -種生產纖維素酶的方法，其特征在于，所述的方法，是將權利要求1所述的里氏木 霉接種到發酵培養基中來發酵生產纖維素酶。
4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的發酵培養基的組成為葡萄糖15. Og/ L、乳糖 16. Og/L，玉米漿 25. Oml/L，（NH4)2S045. Og/L，MgS04l. Og/L，KH2P0420g/L，CaCl20. 4g/ L，吐溫-800. 2ml/L，微量元素 0? 2ml/L，聚丙二醇-20000. 2ml/L，NaOH 1. Og/L, pH 值 5. 0。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的微量元素溶液的組成為：CuS04*5H20 0. 048mol/L, FeS04 ? 7H20 0. 18mol/L, CoCl2 ? 6H20 0. 034mol/L, MnCl2 ? 4H20 0. 08mol/L〇
【文檔編號】C12R1/885GK104371934SQ201410640307
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月13日 優先權日:2014年11月13日
【發明者】黃亦鈞, 許韋, 吳佳鵬, 許麗紅, 李 瑞, 王華明 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司