枯草芽孢桿菌生物保鮮劑及在大黃魚保鮮中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于水產品防腐保鮮技術，具體涉及枯草芽孢桿菌作為生物保鮮劑在大黃魚防腐保鮮中的應用以及保鮮防腐的方法。
【背景技術】
[0002]水產品是人們食品的重要組成部分，冰鮮保藏是水產在市場流通的主要方式之一。由于水產品含有豐富的蛋白質等營養物質，容易引起腐敗細菌快速生長繁殖，腐敗物質大量積累，因而極易變質，影響到水產品的質量，甚至威脅人的身體健康。因此，水產品的保鮮方法成為目前的研究熱點。目前，應用于水產品的保鮮技術主要有低溫保鮮、化學保鮮、氣體保鮮、輻射保鮮和生物保鮮等。生物保鮮以其安全性高、能耗低的優勢成為開發新熱點。植物源保鮮劑主要起抗氧化作用;動物源抑菌劑如魚精蛋白；水產品中常用的微生物源抑菌劑主要有乳酸菌產生的乳酸菌素、納它霉素等。動/植物來源的保鮮劑受原料限制，價格較高;而目前產業化的微生物源保鮮劑均為微生物代謝物，日益受到重視。
[0003]枯草芽孢桿菌菌株具有抑制病原菌和微藻的活性，被允許使用在果蔬、魚飼料中。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種枯草芽孢桿菌作為生物保鮮劑在水產品保鮮防腐中的應用，為水產品特別是冰鮮大黃魚的保鮮提供新的途徑。
[0005]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
本應用中所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(BaciIIus subtulis)BSh0851，保藏日期為2009年12月13日，保藏單位是中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCCN0.3502。
[0006]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)為革蘭氏陽性菌，芽孢橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，常形成皺醭;需氧菌，可利用蛋白質、多種糖及淀粉，V-P陽性。
[0007]采用優化培養后的培養條件，通過液體發酵制得含有高活性物質的發酵液，并采用酸沉淀的方法得到脂肽類活性物質粗提物。粗提物產量為0.45g/L，對105cfu/mL嗜冷桿菌、105cfu/mL假單胞菌和105cfu/mL希瓦氏菌3菌混合液的抑菌率為33%。
[0008]將0.3mg/mL粗提物與0.3mg/mL尼薩普林和20mg/mL殼聚糖鹽酸鹽配伍，制成混合保鮮劑。使用本發明的保鮮劑對大黃魚進行保鮮，儲藏5天后，揮發性鹽基氮(TVB-N)和微生物以及感官指標均符合我國鮮大黃魚等相關衛生標準(SC/T 3101-2010)中一級鮮度，防腐保鮮效果顯著，延長了大黃魚的貨架期。結果表明枯草芽孢桿菌發酵液粗提物能夠有效地抑制大黃魚表面細菌的生長，同時對大黃魚魚肉的脂肪酸氧化和新鮮度也有一定的改善效果。
[0009]大黃魚保鮮方法是用碎冰將鮮活大黃魚失活，將枯草芽孢桿菌粗提物、尼薩普林、殼聚糖鹽酸鹽溶液混合噴灑在魚體，于4°C冰箱內冰上貯藏。
[0010]具體包括以下步驟:(I)種子液制備:從營養瓊脂斜面培養基上挑取一接種環已活化的枯草芽孢桿菌接種到種子培養基中，37°C，200r/min，培養24h ；種子培養基為牛肉霄3g、氯化鈉5g、蛋白胨10g、蒸餾水1000mL、pH7.0-7.2;
(2)發酵液培養基制備:酵母浸膏14g，無水葡萄糖14g，MgS0dg，蒸餾水100mL，pH7.0;
(3)枯草芽孢桿菌無菌體發酵液的制備:在步驟(2)制得的發酵液中接入步驟(I)制得的種子液，接種量為7%;調節初始pH值8;培養溫度38°C，轉速10r.min—1，裝液量150mL/250mL搖瓶;在此條件下培養24h ；
(4)無菌發酵液的制備:將步驟(3)所述枯草芽孢桿菌培養液在10000r/min離心15min后，用0.22μπι濾膜過濾，即為無菌體的發酵濾液；
(5)發酵液粗提物制備:將步驟(4)所述無菌發酵液用2mol/L的HCl調至ρΗ2.0，于4°C放置3d，再次10000r/min離心1min，收集沉淀物，溶解于無菌水中，并用NaCl調節pH至7;
(6)步驟(5)所得發酵液經酸沉得到抑菌活性物質即抑菌脂肽類物質的產量為0.45g/L，對105cfu/mL嗜冷桿菌、105cfu/mL假單胞菌和105cfu/mL希瓦氏菌3菌混合液的抑菌率為33%；
(7)將步驟(5)的粗提物稀釋為活性物質量為0.3mg/mL，與0.3mg/mL尼薩普林和20mg/mL殼聚糖鹽酸鹽制成混合保鮮劑；
(8)于在冰鮮大黃魚全表面，每隔12h噴灑步驟(7)制得的混合保鮮劑，每尾大黃魚每次噴灑的用量約為5mL。
[0011 ]本發明的有益效果如下:1、枯草芽孢桿菌作為一種飼料用益生菌，其代謝產物添加對人體安全無害。2、該枯草芽孢桿菌粗提物的抑菌譜較廣，能夠有效的抑制革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的生長，且在4°C條件下保藏具有顯著的作用，從而對大黃魚的防腐保鮮起到很好的效果。3、該枯草芽孢桿菌來源復合保鮮劑在對大黃魚等水產品保鮮的過程中能夠有效保持水產品的新鮮度、感官性狀等。
【具體實施方式】
[0012]本發明以揮發性鹽基氮(TVB-N)，硫代巴比妥酸(TBA)，菌落總數等指標評價枯草芽孢桿菌來源復合保鮮劑對養殖冰鮮大黃魚保鮮效果。
[0013]參考水產品中揮發性鹽基氮的測定標準(SC/T3032-2007)規定的測定揮發性鹽基氮的方法。稱10g(精確到0.0lg)于均質杯中，再加入90mL高氯酸溶液，均質2min，用濾紙過濾或離心分離，濾液于2°C_6°C的環境條件下貯存，可保存2d。將1mL 2%的硼酸倒入50mL錐形瓶，加1-2滴混合指示劑，將硼酸置于冷凝管下端，并使冷凝管下端浸入液面，精確吸取上述樣品濾液2mL于蒸饋器反應內，加1%氧化鎂混懸液5mL，迅速蓋塞、加水，通入蒸汽。待蒸汽充滿蒸餾器內部，由冷凝管出現第一滴冷凝水開始計算，蒸餾5min即停止，吸收液用約0.0lmol/L鹽酸標準溶液滴定。終點呈紅色，同時作試劑空白試驗。TVB-N值單位為mgN/100g。揮發性鹽基氮(TVBN)是判斷魚類鮮度的主要化學指標之一，魚一級鮮度的TVBN值在5-10mg/100g，一般鮮度的魚TVBN值在 15-25mg/100g，當TVBN值達到30-40mg/100g則魚已腐敗。
[0014]菌落總數測定方法:參照食品安全國家標準-食品微生物學檢驗中的菌落總數測定操作(GB4789.2-2010)。國家標準GBT18108-2008對鮮海水魚細菌菌落數做出規定:魚肉中細菌總數< 14CfVg為一級鮮度(A級)標準，< 105cfu/g標準為腐敗終點(C級)標準。
[0015]將新鮮大黃魚分4組，分別采用殼聚糖鹽酸鹽、枯草芽孢桿菌粗提物-殼聚糖鹽酸鹽和枯草芽孢桿菌粗提物-尼薩普林-殼聚糖鹽酸鹽復合保鮮劑進行保鮮;并作I組對照，為了保證實驗影響因素的一致性，對照組噴灑無菌水。
[0016](I)種子液制備:從營養瓊脂斜面培養基上挑取一接種環已活化的枯草芽孢桿菌接種到種子培養基中，37°C，200r/min，培養24h;種子培養基為牛肉膏3g、氯化鈉5g、蛋白胨10g、蒸餾水 1000mL、pH7.0-7.2；
(2)發酵液培養基制備:酵母浸