專利名稱：含有重組人α-2b干擾素的重組乳酸菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種含有重組人a-2b干擾素的重組乳酸 菌及其應用。
背景技術：
a-2b干擾素屬于I型干擾素，是機體白細胞分泌的一種有廣譜抗病毒、抗腫瘤 及免疫調節作用的細胞因子。自1987年Isaacs和Lindermann發現干擾素以來，人類 就一直試圖將其應用于臨床。而直到20世紀70年代后期，隨著基因工程技術的出 現及發展，用這種方法生產的干擾素才進入了工業化生產，并且大量投放市場。 目前，經大腸桿菌和中國倉鼠卵細胞表達的重組人a-2b干擾素在臨床上得到 廣泛應用，主要用于治療由病毒引起的白血病、乙型、丙型肝炎等。重組干擾 素蛋白需要連續注射高劑量藥才能達到治療效果，且在血液中易被降解易產生 副作用，還可能產生中和抗體。因此有必要研究開發新型的給藥方式，以提高 干擾素在體內的作用，延長在體內的半衰期和降低免疫原性。
乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)千百年來廣泛應用于食品加工工業，
是公認的安全(GRAS)的食品級微生物。乳酸菌的主要作用包括改善食品風味、
防止食品腐敗、增加養分、平衡消化道菌群、降低膽固醇、控制內毒素等。而 分子生物學技術的不斷進步為探索其新的應用潛力提供了基礎如利用基因工
程乳酸菌在生物反應器內發酵食品或直接在人和動物消化道內生產蛋白等，其 中最有前景的應用即是乳酸菌作為活載體將治療性蛋白或抗原傳遞至黏膜表 面，繼而同時誘導黏膜免疫和系統免疫。
Wells等發現用表達破傷風毒素片段C(tetanus toxin， TTFC)的重組乳酸 乳球菌給小鼠口服免疫后，能使小鼠免受致死劑量的TTFC攻擊(Wells JM， Wilson PW (1993) Lactococcus lactis: high-level expression of tetanus toxin fragment C and protection against lethal challenge. Mol Microbiol. 1993 8(6) :1155-62)。表達細胞因子的乳酸乳球菌也可以有效刺激黏膜免疫應 答。表達有IL-12的重組乳酸乳球菌與表達HPV16(人乳頭狀瘤病毒)E7抗原的 重組乳酸乳球菌共同免疫小鼠后，檢測到Thl細胞因子、IL-2、 IFN-y的分泌水平均增加，能有效保護小鼠免受HPV-16誘導的腫瘤的攻擊 (Bermudez-Humaran LG， Cortes-Perez NG， Lefevre F (2005) A novel mucosal vaccine based on live Lactococci expressing E7 antigen and IL—12 induces systemic and mucosal immune responses and protects mice against human papillomavirus type 16-induced tumors. J" Immunol, 175， 7297-302)。
發明內容
本發明的目的在于提供一種重組人a -2b干擾素的重組乳酸菌及其應用。 本發明的重組人a-2b干擾素的編碼基因，是如下1)或2)或3)的核苷酸序
列
1) 序列表中序列l所示的核苷酸序列；
2) 在高嚴謹條件下與序列表中序列l的核苷酸序列雜交且編碼重組人a -2b干 擾素的核苷酸序列；
3) 與序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性且編碼重組人 a-2b干擾素的核苷酸序列。
所述的高嚴謹雜交條件是指，將雜交膜置于預雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖 液，pH7.2， 7%SDS)中，65。C預雜交30min;棄預雜交液，加入雜交液(0.25mol/L 磷酸鈉緩沖液，pH7.2， 7%SDS，同位素標記的核苷酸片段)，65。C雜交12hr;棄雜 交液，加入洗膜液I (20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2， 5%SDS) ， 65。C洗膜2次，每 次30min;加入洗膜液II(20隨ol/L磷酸鈉緩沖液，pH7. 2， 1%SDS) ， 65。C洗膜30min。
含有上述重組人a -2b干擾素的編碼基因的重組表達載體、轉基因細胞系也在 本發明的保護范圍內。
本發明的另一 目的在于提供一種重組乳酸菌，是將含有所述的重組人a -2b干 擾素的編碼基因的DNA分子導入乳酸菌中，獲得該重組乳酸菌。
為了便于重組乳酸菌分泌蛋白，所述重組人a-2b干擾素的編碼基因的5'端連 有編碼信號肽的DNA分子。
所述信號肽的氨基酸序列為序列表的序列2。
本發明的又一 目的在于提供所述的重組乳酸菌在制備重組人a -213干擾素中的 應用。
本發明的又一目的在于提供所述的重組乳酸菌在制備抗病毒、抗腫瘤藥物中的 應用。本發明還提供一種抗病毒、抗腫瘤的藥物，其活性成分為上述的重組乳酸菌。 將含有重組人a-2b干擾素的編碼基因的乳酸菌作為載體，表達內源或外源蛋 白，可以不經表達后加工而直接服用或給藥，在功能食品、醫療保健等方面具有非 常誘人的前景。已有的實驗證實了乳酸乳球菌可有效提高黏膜免疫系統提呈抗 原及誘導特異性免疫應答的能力，具有成為新型口服疫苗誘導黏膜免疫應答的 潛力。
圖1為重組人a-2b干擾素原核表達載體pNZ-ifnm的構建示意圖2為重組人a-2b干擾素在乳酸菌中誘導表達產物的western-blot檢測結
果；
圖3為重組人a-2b干擾素在乳酸菌中誘導表達產物的具體定位的
western-blot結果；
圖4為工程菌NZ(pNZ-ifnm)表達人干擾素的定量檢測結果； 圖5為工程菌NZ(pNZ-ifnm)表達人干擾素的活性測定結果。
具體實施例方式
下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。 下述實施例中，所述百分含量如無特殊說明，均為質量百分含量。 實施例1含有重組人a-2b干擾素的重組乳酸菌的制備及表達產物檢測 一、含有重組人a-2b干擾素的重組乳酸菌的制備
1. 重組人a-2b干擾素基因的合成
根據乳酸菌偏愛密碼子表，在不改變天然人干擾素a-2b的氨基酸序列的情況 下，將其基因序列替換為含乳酸菌偏愛密碼子的序列，見序列表的序列1。合成的重 組人a-2b干擾素基因命名為i/)M7。
2. 構建重組表達載體 重組表達載體的構建流程見圖1。
(1) 將基因ifnm通過5"scl和tT/mI位點連接到pUC57質粒上(Fermentas)， 所得到的含有上述重組人a-2b干擾素基因的重組載體命名為pUC57-ifnm，并經測 序驗證其正確性。
(2) 將跨膜信號肽Usp45的編碼序列連接到上述重組載體pUC57-ifnm中 根據乳酸菌信號肽Usp45的編碼序列(Genbank號M60178)設計引物，并在引物序列的兩端分別添加上限制性內切酶^coRI和5"scl的識別位點，引物序列如下
引物1 (上游引物)5' - CGCGGATCCATGAAAAAAAAGATTATCTCAG-3'(帶下劃線堿 基為限制性內切酶^boRI的識別位點)
引物2(下游引物)5' - CGCTGAGCTCAGCGTAAACACCTGACAAC -3'(帶下劃線堿 基為限制性內切酶^cl的識別位點)
以乳酸乳球菌MG1363(Gasson MJ (1983) Plasmid complements of Streptococcus lactisNCD0 712 and other lactis streptococci after protoplast-induced curing. J Bacteriol 154:1-9)(中國科學院微生物研究所) 的基因組DNA為模板，以引物1和引物2進行PCR擴增，擴增條件為94°C 15sec， 56 °C 15sec， 72°C 25sec，共30個循環。
反應結束后，PCR擴增產物用限制性內切酶fcoRI和5^cI進行雙酶切，回收 100bp的酶切產物，純化后與同樣雙酶切的載體pUC57-ifnm 16。C連接16小時，將連 接產物用氯化鈣法轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，用含100ug/mL氨芐青霉素的LB 抗性平板篩選陽性轉化子，提取陽性轉化子中的重組質粒，用限制性內切酶^coRI 和&cl進行酶切鑒定，經雙酶切得到100bp片段的質粒為陽性克隆。再對陽性克隆 質粒用PCR的方法做進一步鑒定，所用引物為引物1和引物2，對PCR產物進行測序， 測序結果表明乳酸菌信號肽Usp45的編碼序列已插入pUC57-ifmn中且序列正確，信 號肽Usp45的編碼序列是Genbank號M60178的5，末端第101位到181位，編碼序列 表序列2的氨基酸。將此含乳酸菌信號肽Usp45編碼序列及重組人a -25干擾素編碼 序列的重組載體命名為pUC45-ifnm。 (3)乳酸菌表達載體的構建
以pUC45-ifnm為模板，設計使用P3, P4引物進行PCR擴增，擴增包含有Usp45 信號肽及重組人a-2b干擾素編碼基因的融合片段。
P3: 5' -CATGCCATGGTGAAAAAAAAGATTATCTCAG-3'(帶下劃線堿基為限制性內切 酶Afca[的識別位點)
P4: 5' -CGCTGGTACCTTATTCTTTAGAACGTAAAG-3'(帶下劃線堿基為限制性內切 酶f/wl的識別位點)
擴增條件為94°C 30sec， 56°C 30sec， 72°C 90sec，共30個循環。
反應結束后，對PCR擴增產物用限制性內切酶7fca[和^OTl進行雙酶切，再將 600bp的酶切產物純化后與同樣雙酶切并經純化的載體pNZ8048( Kuipers, 0. P.，P. G. G. A. d. Ruyter， M. Kleerebezem & W. M. d. Vos (1998) Quorum sensing—controlled gene expression in lactic acid bacteria. /j57ofec力/ cL/, 64:15-21)(中科院微生物研究所)在16。C下連接16小時，將連接產物用氯化鈣法 轉化大腸桿菌MC1061 (ATCC47035)感受態細胞，用含10ug/mL氯霉素的LB抗性平 板篩選陽性轉化子，提取陽性轉化子中的重組質粒，用限制性內切酶lot和^^1 進行酶切鑒定，經雙酶切能得到600bp片段的質粒為陽性克隆。再對陽性克隆質粒 用PCR的方法做進一步鑒定，所用引物為P3和P4，對PCR產物進行測序，測序結 果表明乳酸菌信號肽Usp45及重組人a-2b干擾素的編碼序列已插入pNZ8048中且 序列正確，得到干擾素的誘導型分泌載體，命名為pNZ-ifmn。 3.重組乳酸菌的制備
將干擾素乳酸菌誘導型分泌表達載體pNZ-ifnra轉化乳酸乳球菌厶 NZ9000( Kuipers， 0. P. ， P. G. G. A. d. Ruyter， M. Kleerebezem & W. M. d. Vos (1998) Quorum sensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria. /A'"ec力加,64:15-21)(中科院微生物研究所)，用含5 u g/mL氯霉素的GM17 抗性平板(胰蛋白胨0.5%，大豆蛋白胨0.5%，牛肉浸膏0.5%，酵母提取物0.25 %，葡萄糖0.5%，維生素C0.05X， 0-甘油磷酸鈉1.9%，硫酸鎂lmmol/L)篩 選陽性轉化子，提取陽性轉化子中的重組質粒，用引物P3和P4進行PCR擴增，PCR 擴增得到600bp目的片段的轉化子為干擾素誘導型表達工程菌，命名為 NZ(pNZ-ifnm)。
二、 基因的表達
將pNZ8048載體轉化乳酸菌，作為對照，命名為NZ (pNZ8048)。將NZ (pNZ-ifnm) 和NZ (pNZ8048)分別接種于含有5 w g/mL氯霉素的GM17液體培養基的試管中，30 。C靜置培養12小時，再按2X接種量接種于新鮮的GM17液體培養基中，3(TC靜置 培養3小時至0De。。值為0. 5-0.6，然后加入終濃度為lng/mL的乳酸鏈球菌素(Nisin) 進行誘導，在3(TC下靜置誘導3小時。對照同樣處理。
三、 表達產物的western-blot鑒定
取誘導型表達產物1. 35ml于4°C以4300g離心5分鐘，分別收集得到上清液1 及細胞沉淀l。
在上清液1加入100%三氯乙酸(TCA)150ul混勻，使TCA終濃度為10。/。，冰浴 10分鐘后，于4'C以11， 500g離心10min,得到的沉淀2，以lml冰冷的丙酮洗滌2次后晾干，并重懸于50ul 50mMNaOH中，所得液體為上清2。
將細胞沉淀1重懸于1/10體積的PBS中，超聲破碎。待菌液清亮后，于4t:以 13200g離心IO分鐘，棄掉含有未破碎細胞及細胞碎片的沉淀3，取上清，即為上 清3存放于-2(TC或4"C。
對重組人干擾素進行更詳細的定位時，需將細胞壁與膜組分的進行進一步分 離，具體方法為將細胞沉淀1以TES(10mM Tris-HC1， pH8. 0， lmM EDTA， 25%蔗 糖)洗滌一次，并以1/10(體積百分比)的TES-LMR(TES中加入溶菌酶10mg/ml，Rnase 0. lmg/ml)重懸，37。C溫育30分鐘后，于4°C以2500g離心10分鐘，獲得上清4 和沉淀4，將上清4以10% TCA沉淀，重懸于50ul 50mMNaOH中，即為胞壁釋放的 蛋白；沉淀4為原生質體，以TES洗滌后，重懸于500ul PBS (NaCl 137 mM, KC1 2. 7 raM， Na2HP04 10 mM， KH2P04 2 mM， pH 7. 4)中，隨后凍融5次，于4。C以21000g離 心45分鐘，獲得上清5和沉淀5。上清5中含有胞質組分，以TCA沉淀后重懸于 50ulTE(10mMTris-Hcl， pH8. 0， lmMEDTA)中;沉淀5為膜組分，以50ul含有1%SDS 的TE溶解。
對細胞的不同組分進行Western-blot鑒定，具體方法如下
1) SDS-PAGE
采用Tris-甘氨酸電泳系統對收集的各細胞組分進行SDS-PAGE (分離膠濃度為 12%)，方法為取待測樣品液15uL，加入6求樣品緩沖液3wL (含100mmol/L Tris-HC1， pH6. 8， 200mmol/L DTT， 4%SDS， 0. 2%溴酚藍，20%甘油)，水浴煮 沸5min，上樣后用25mA穩流電泳，待溴酚蘭進入分離膠后，改用35 mA電泳至玻 璃板底部。
2) 免疫雜交
SDS-PAGE電泳結束后，不對膠染色，進行Western-blot分析，具體方法為 將膠用蒸餾水沖洗并在電轉移液(25mM Tris， 192mM甘氨酸，pH8. 3， 20%甲醇) 中浸潤15分鐘。裁好的PVDF膜先用甲醇潤濕20秒后用蒸餾水洗2分鐘，然后以 電轉移液浸潤5分鐘。安裝好電轉裝置后，在冰浴中以100mA電流轉移1.5h;轉有 蛋白的PVDF膜用蒸餾水漂洗后，以封閉液(含有0. 05% Tween20和5%脫脂奶粉的 pH7.4的PBS)于4。C封閉過夜。然后與一抗溶液(用封閉液以1:1000稀釋的小鼠抗 人a -2b干擾素(mouse monoclonal antibody to interferon alpha 2b， Abcam， ab9386) 37。C保溫lh，用PBST(含有0. 05% Tween的pH7. 4的PBS)洗膜三次，每次10min;與二抗溶液(用封閉液以1:5000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG)37'C保溫lh， 再以PBST洗膜三次，每次lOmin。以商業化的ECL試劑盒顯色。參照試劑盒說明書， 將試劑盒中的A液與B液等體積混合，按照O. 125ml/cm2在膜上加上顯色液，去掉 多余的顯色液后，于暗室壓片曝光。重組人干擾素在乳酸菌中誘導表達產物的 Western-blot檢測結果如圖2所示。表明重組乳酸菌經發酵后，菌體中產生能夠與 干擾素的抗體特異性相互作用的蛋白，但是表達產物沒有切除信號肽。圖2中泳道 1為工程菌NZ (pNZ-ifnm)的發酵上清液(上清2)，泳道2為工程菌NZ (pNZ-ifnm)的 細胞(上清3)，泳道3為同樣誘導的轉化pNZ8048的乳酸乳球菌L hc^s NZ9000 作為陰性對照。蛋白分子量標準(170kDa、 130kDa、 95kDa、 72kDa、 55kDa、 43kDa、 34kDa、 26kDa、 17kDa、 llkDa)標注在右邊。
為對重組乳酸菌中表達的干擾素進行更詳細的定位，對細胞的各組分進行了分 離。圖3為干擾素在乳酸菌中表達的定位圖，表明重組乳酸菌表達的Usp45-IFN蛋 白大部分位于膜上，沒有分泌到胞外。
圖3中泳道1為誘導的NZ(pNZ8048)樣品作為陰性對照，泳道2為誘導的 NZ (pNZ-ifnm)細胞內組分(上清5)，泳道3為誘導的重組乳酸菌膜組分(沉淀5)， 泳道4為誘導的重組乳酸菌細胞壁組分(上清4)。蛋白分子量標準(170kDa、 130kDa、 95kDa、 72kDa、 55kDa、 43kDa、 34kDa、 26kDa、 17kDa、 llkDa)。
實施例2含有重組人a-2b干擾素重組菌表達產物的含量測定 用商業化的重組人a-2b干擾素含量測定試劑盒，根據說明書進行實驗。首先 將試劑盒中的標準品以200ul蒸餾水溶解，加入200ul樣品稀釋液稀釋至終濃度為 2000pg/ml。然后依次做倍比稀釋，使濃度分別為2000， 1000， 500， 250， 125， 62.5， 31.25pg/ml。將標準品加入到板條孔中，每孔100ul，并做復孔，留下兩孔做空白 對照。在其余孔中分別加入100ul實施例1中的上清2和上清3， 37。C孵育1小時。 用20倍稀釋的洗滌液洗滌4-6次，在吸水紙上拍干。然后加入酶標記的抗體100ul， 37"C孵育1小時。洗滌4-6次后，每孔加100ul顯色液，于37。C避光顯色15-30 分鐘，然后加上50ul終止液，于酶標儀490nm處讀數。根據標準品的含量數算出 樣品中干擾素的含量。圖4為重組乳酸菌表達干擾素的含量圖。圖4中，S代表上 清2， C代表上清3。經過3次獨立的實驗，菌體分泌到培養基即上清2中的干擾素 含量為41. 7pg/ml，菌體細胞即上清3中的干擾素含量為11. 6pg/ml。實施例3含有重組人a-2b干擾素重組菌表達產物的活性測定 生物學活性參照2005年《中華人民共和國藥典》三部附錄XC細胞病變抑制法 進行，依據人羊膜細胞(WISH)-水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV) 系統，采用CPE (細胞病變效應)抑制為基礎的抑制微量測定法，以每毫升干擾素檢 品的最高稀釋度仍能保護半數細胞(50%)免受病毒攻擊的稀釋度的倒數為干擾素單 位。
具體方法為
取WISH細胞在96孔板中培養至全部貼壁生長后，去除培養液，分成兩組，一 組將人a干擾素標準品(購自中國藥品生物制品鑒定所)稀釋成1000U/ml，每孔加 入100W，做4倍系列稀釋，供8個稀釋度，每個稀釋度做2個復孔。另一組每孔 分別加入4倍系列稀釋的實施例1中的上清1和上清3，用100TCID50劑量 的水泡性口炎病毒(VSV)進行攻毒，對照孔加無病毒的培養液，同時設立陰性對照 (只加經系列稀釋的重組人a干擾素，不加病毒)、陽性對照(不加干擾素，只加 病毒)、空白對照(不加干擾素，不加病毒)，在倒置顯微鏡下觀察標準品1U/ral 的孔出現50%病變的時候判斷結果。以結晶紫染色后在波長570nm處測定吸光度， 采用四參數回歸計算法進行處理，并按下式計算干擾素生物學活性。 供試品生物學活性(IU / ml) =Pr X [ (Ds X Es) / (Dr X Er)] 式中Pr為干擾素標準品生物學活性，1U/ml; Ds為供試品預稀釋倍數； Dr為干擾素標準品預稀釋倍數； Es為供試品相當于干擾素標準品半效量的稀釋倍數； Er為干擾素標準品半效稀釋倍數。 干擾素生物學活性測定結果如圖5所示，上清1即重組菌分泌到培養基中的干 擾素活性為105U/ml，而上清3即滯留在細胞內的干擾素活性為73. 2U/ml。 圖5中，S代表上清l， C代表上清3。序列表
<110>中國科學院微生物所
〈120〉含有重組人a-2b干擾素的重組乳酸菌及其應用 <130〉 1 〈160〉 2
<210〉 1
<211> 498
<212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220> 〈230〉
〈400〉 1
tgtgatttaccacaaacacattctttaggttctcgtcgtacattaatgtt60
atgcgtcgtatttctttattttcttgtttaaaagatcgtc3tgattttggttttccacaa120
gaagaatttgtcaa^a3gcaga犯c犯1:tccagttttacatgsaMgatt180
caacaaat 11"ttaatttattt "t c t ac aaaagattcttcagcagcacgtga240
ttagata^atat tatat caaCgLdttd^tg3tttagaagc300
caaggtgttggtgttacsgaatgaaagaagattctattttagcagttcgt360
aaatattttcaacgtattaca^tatatttaaaagaaaaaaaatattctccatgtgcatgg420
gaagttgttcgtgcaga^ttatgcgttctttttctttatct^ca^tttaca^gaatct■
ttacgttcta498
〈210〉 2
〈211〉 27
<212〉 PRT <213>人工序列〈220〉
〈230〉 〈400> 2
Met Lys Lys Lys lie lie Ser Ala lie Leu Met Ser Thr Val lie Leu 1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Phe Ser Ala Val Tyr Ala 20 2權利要求
1、一種重組人α-2b干擾素的編碼基因，是如下1)或2)或3)的核苷酸序列1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高嚴謹條件下與序列表中序列1的核苷酸序列雜交且編碼重組人α2b干擾素的核苷酸序列；3)與序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性且編碼重組人α-2b干擾素的核苷酸序列。
2、 含有權利要求l所述基因的重組表達載體。
3、 含有權利要求l所述基因的轉基因細胞系。
4、 一種重組乳酸菌，是將含有權利要求l所述的重組人a-2b干擾素的編碼基因的 DNA分子導入乳酸菌中，獲得的重組乳酸菌。
5、 根據權利要求4所述重組乳酸菌，其特征在于，所述重組人a-2b干擾素的編碼 基因的5'端連有編碼信號肽的麗A分子。
6、 根據權利要求5所述重組乳酸菌，其特征在于，所述信號肽的氨基酸序列為序 列表的序列2。
7、 權利要求4-6任一所述的重組乳酸菌在制備重組人a-2b干擾素中的應用。
8、 權利要求4-6任一所述的重組乳酸菌在制備抗病毒、抗腫瘤藥物中的應用。
9、 一種抗病毒、抗腫瘤的藥物，其活性成分為權利要求4-6任一所述的重組乳酸菌。
全文摘要
本發明公開了一種重組人α-2b干擾素的編碼基因，是如下1)或2)或3)的核苷酸序列1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高嚴謹條件下與序列表中序列1的核苷酸序列雜交且編碼重組人α-2b干擾素的核苷酸序列；3)與序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性且編碼重組人α-2b干擾素的核苷酸序列。本發明提供一種重組乳酸菌，是將上述的重組人α-2b干擾素的編碼基因的DNA分子導入乳酸菌中，獲得該重組乳酸菌。本發明還提供所述的重組乳酸菌在制備重組人α-2b干擾素中以及制備抗病毒、抗腫瘤藥物中的應用本發明還提供一種抗病毒、抗腫瘤的藥物，其活性成分為上述的重組乳酸菌。
文檔編號A61K35/66GK101538572SQ20091008307
公開日2009年9月23日 申請日期2009年4月28日 優先權日2009年4月28日
發明者張秋香, 還連棟, 瑾 鐘 申請人:中國科學院微生物研究所