專利名稱：高濃度低裝量重組人干擾素α2b注射液的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種干擾素a 2b注射液制劑及其生產工藝，具體說是一種高濃度低 裝量重組人干擾素a 2b注射液制劑，成品濃度達1000萬IU/ml，比活性可達到2. 9X108IU/ mg蛋白，內毒素小于0. 25EU/1000萬IU，外源DNA殘留小于lng/1000萬IU，宿主菌殘留蛋 白量低，不高于0. 001%。
背景技術：
干擾素是目前應用非常廣泛且臨床效果顯著的治療類生物藥物，具有廣譜抗病 毒、抗腫瘤及免疫調節功能，在臨床治療中有不可取代的地位。現在國內的注射用干擾素一 般有兩種一種是干擾素注射液，即液體干擾素；一種是凍干干擾素，即固體干擾素。絕大 多數的單劑活性含量最高在500-600萬IU之間，這兩種干擾素的最終使用裝量都是1ml。伴隨著藥物制劑學和生物藥劑學的發展，以及新制劑技術在生物制藥領域的應 用，干擾素成為生物制藥中劑型種類最多的一個。隨著對干擾素作用機理及其臨床應用的 深入研究，干擾素的治療范圍和使用形式有了較大發展和突破，對劑型的要求也越來越高 了，但是目前現有的注射劑型尚不能滿足臨床的需要。原因是絕大多數的注射劑單劑活性 含量最高在500-600萬IU，最終使用裝量都是lml。而在實際的臨床治療中有相當部分患者 對注射劑型有特殊要求，比如慢性病患者需要長期注射的，最好能有小體積的液體干擾素 自行注射，而且最好是單劑給藥，這樣購買，保存，使用，及使用后處理都很方便，造價也低； 另外一些新的適應癥如新生兒血管瘤，Peyronie, s病等，還有實體瘤都需要在病灶局部注 射一定量的干擾素才能達到治療目的，為此需要有高濃度小體積的干擾素；再有就是目前 提倡個性化治療和單劑給藥，雖然市售干擾素有注射筆，但是無法單劑給藥，針頭太短不利 于局部注射，價格昂貴，另外反復使用保存也不方便。綜上所述目前臨床需要低裝量高濃度，且高純度高穩定性低副反應的液體干擾 素。而現有干擾素的工藝如果要縮小裝量提高濃度則內毒素和副反應也會加大，這是一個 普遍的矛盾，另外保持高活性，穩定性也是一個難題。針對這種情況我們通過改良菌種提 高目的蛋白表達量和活性，比活性可以達到2. 9X108IU/mg，合理組合純化系統提高收率，增 加監控環節保證高純度，應用獨特的穩定劑系統等措施研制了高濃度，高純度，高生物學活 性，高穩定性，低裝量，低副反應的干擾素液體制劑，并將其分裝在管制抗生素瓶或者預充 式注射器中。
發明內容
本發明提供了一種高濃度低裝量重組人干擾素a 2b注射液制劑，成品終濃度為 1000萬IU/ml，純度大于98%，外源DNA殘留小于lng/1000萬IU，比活性可達2. 9X108IU/ mg 蛋白，規格有 0. 3ml (300 萬 IU)，0. 5ml (500 萬 IU)，0. 6ml (600 萬 IU)，1. 0ml (1000 萬 IU) 等，內毒素標準高于藥典(10EU/300萬單位)，低于0. 25EU/1000萬單位，副反應低于國內同 類產品，穩定性達36個月以上。
本發明中的干擾素是以攜帶干擾素a 2b基因的質粒pADUA-4轉化工程菌大腸桿 菌K-12LE392經發酵表達。本發明是以高壓勻質機為破碎系統，能達到破碎完全，包涵體回收充分，高回收率 保證了純化效果，適于工業化生產的目的。本發明是以色譜層析為純化系統，并在純化中使用反相高效液相和觸手型離子 色譜柱保證高純度產品，外源DNA殘留小于lng/1000萬IU，宿主菌殘留蛋白量低，不高于 0. 001%。本發明應用反相高效液相監控干擾素注射液的純度，純度控制在98%以上，如此 才可以提高成品濃度而副反應低，并有良好的穩定性。本發明中的干擾素注射液是以一種以苯甲醇-聚山梨醇酯80做為穩定劑系統，此 穩定劑系統可以保持不含人血白蛋白的液態重組人干擾素a 2b穩定性在36個月以上。本發明中的干擾素注射液可以裝在管制抗生素瓶中，也可以裝在預充式注射器 中，有利于醫生根據具體情況使用，也可以使需要長期注射的患者自行注射，利于保存和單 劑給藥。本發明還提供了生產工藝，適于工業化生產。本發明的技術解決方案如下1、工程菌種PADUA-4/K_12LE392，為古巴工藝菌種，由攜帶干擾素a 2b基因的質 粒pADUA-4轉化大腸桿菌K-12LE392構建的工程菌經發酵后，目的蛋白表達量達30%以上， 經過復性及后續的純化工藝后純度高，無聚合體存在，比活性可以達到2. 9X108IU/mg蛋白， 穩定性好。這是要做到高濃度低裝量高純度重組人干擾素很關鍵的一個技術點。2、包涵體提取采用高壓勻質機對細胞進行分階段連續破碎，離心回收包涵體。3、純化通過一系列色譜層析提純，得到重組人干擾素a 2b原液，并使最終外源 DNA殘留小于lng/1000萬IU (藥典10ng/劑)，宿主菌殘留蛋白不高于0. 001 % (藥典不 高于總蛋白量的0. 1% ) 3、純度監控原液以RP-HPLC檢測監控，要求純度大于98%。4、穩定劑以苯甲醇-聚山梨醇酯80做為穩定劑系統，兩種組分的濃度比例約為 50 1，此穩定劑系統可以保證液體干擾素的穩定性在36月以上。5、緩沖液以磷酸鹽做為緩沖液。6、分裝容器可以是管制抗生素瓶和預充式注射器兩種。本發明具有以下特點及優勢1、為液體干擾素的一種，除了有一般液體干擾素的特點外，還具有濃度高，裝量 低，純度高，副反應小的優勢。2、濃度高，裝量低，給藥方便，疼痛感小，順應性好。分裝在預充式注射器中，慢性 丙型肝炎患者可以腹部皮下每日自行注射0. 3ml (300萬IU)，痛感輕微且不會因為藥物體 積大而外泄或腫脹；實體瘤患者在瘤周注射1000萬IU的干擾素，其他產品需注射2ml，這 在臨床很難實現，而本產品只有1ml，可以滿足臨床需要；新生兒血管瘤患者，可以采取瘤 內注射的方式，在病灶部位每3天注射600萬IU干擾素，新生兒個體小，而現有產品要大于 1.2ml,不適用在新生」L和局部注射，本發明產品僅0. 6ml，解決了此矛盾。3、純度高，本發明對純度的要求為大于98%，高于國家規定的95%。4、比活性高，
4本發明在經過一系列純化后，比活性可達到2. 9X108IU/mg蛋白，遠高于同類產品。5、外源DNA殘留低，小于lng/1000萬IU，生物安全性更高。6、宿主菌殘留蛋白量低，不高于0.001% (藥典不高于總蛋白量的0. 1%)，生物
安全性更高。7、穩定性好，本發明中以苯甲醇-聚山梨醇酯80做為穩定劑系統，可以保證液體 干擾素的穩定性在36月以上。8、副反應小，此點為區別于國內同類產品的一大特點。
具體實施例方式實施例10. 6ml (600萬IU)重組人干擾素a 2b注射液1、發酵培養、包涵體提取采用搖床培養的方式擴增種子液，發酵培養基以LB培養基為基礎的綜合培養基， 當細菌的生長率和目的蛋白的合成量達到高峰時采用低溫離心法收集菌體。采用高壓勻質機對細胞進行破碎，破碎率可達到100%。2、包涵體溶解及復性用變性液(Tris，NaCl，鹽酸胍)溶解包含體，加入還原劑，在2_6°C將變性液緩慢 地連續加入到復性緩沖液(TriS，NaCl，CUS04)中，復性過夜，蛋白復性液分別使用深度濾器 和筒式濾器進行澄清過濾。3、層析純化回收目的蛋白，并且濃縮，樣品的比活性可達2. 9X108IU/mg蛋白，外源DNA殘留小 于lng/1000萬IU，然后經0. 2 y m纖維素膜過濾后分裝后保存于_70°C冰箱。4、管制抗生素瓶分裝本品稀釋合并后，每支管制抗生素瓶中分裝0. 6ml本品。2_8攝氏度保存。5、使用時，從2-8攝氏度保存狀態下取出，用注射器吸取，注射使用。實施例2預充式0. 6ml (600萬IU)重組人干擾素a 2b注射液1、發酵培養、包涵體提取采用搖床培養的方式擴增種子液發酵，培養基以LB培養基為基礎的綜合培養基， 當細菌的生長率和目的蛋白的合成量達到高峰時采用低溫離心法收集菌體。采用高壓勻質機對細胞進行破碎，破碎率可達到100%。2、包涵體溶解及復性用變性液(Tris，NaCl，鹽酸胍)溶解包含體，加入還原劑，在2_6°C將變性液緩慢 地連續加入到復性緩沖液(TriS，NaCl，CUS04)中，復性過夜，蛋白復性液分別使用深度濾器 和筒式濾器進行澄清過濾。3、層析純化回收目的蛋白，并且濃縮，樣品的比活性可達2. 9X108IU/mg蛋白，外源DNA殘留小 于lng/1000萬IU，然后經0. 2 y m纖維素膜過濾后分裝后保存于_70°C冰箱。4、預充式注射器分裝本品稀釋合并后，每支預充式注射器中分裝0.6ml本品，2-8攝氏度保存，使用時，打開 包裝即可注射使用。
權利要求
一種高濃度低裝量重組人干擾素α2b注射液及其制備方法。其特征在于，由攜帶干擾素α2b基因的工程菌經發酵表達，提取包涵體，再經過系列層析提純，以RP-HPLC檢測并監控純度，得到重組人干擾素α2b原液，以苯甲醇-聚山梨醇酯80做為穩定劑系統，以磷酸鹽緩沖液為稀釋液，稀釋合并，分裝于容器中，成品終濃度為1000萬IU/ml，規格有0.3ml(300萬IU)，0.5ml(500萬IU)，0.6ml(600萬IU)，1.0ml(1000萬IU)等，。
2.權利要求1的重組人干擾素α2b注射液，其特征在于表達干擾素的工程菌為大腸桿 菌 K-12LE392。
3.權利要求1的重組人干擾素α2b注射液，其特征在于攜帶干擾素α 2b基因的是質 粒為 pADUA-4。
4.權利要求3的質粒，其特征在于質粒帶有色氨酸啟動子，質粒大小3.50Kb。
5.權利要求1的重組人干擾素α2b注射液，其特征在于提取采用高壓勻質機對細胞進 行破碎。
6.權利要求1的重組α2b人干擾素注射液，其特征在于以RP-HPLC檢測并控制純度。
7.權利要求1的重組人干擾素α2b注射液，其特征在于原液純度大于98%。
8.權利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于以苯甲醇-聚山梨醇酯80做 為穩定劑系統。
9.權利要求8的穩定劑系統，其特征在于苯甲醇的濃度為5-12mg/ml。
10.權利要求8的穩定劑系統，其特征在于聚山梨醇酯80的濃度為0.01mg/ml-0. 2mg/ml ο
11.權利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于所述pH值為7. 00-7. 60。
12.權利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于分裝后的成品終濃度為1000 萬 IU/ml。
13.權利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于成品的比活性可達到 2. 9X108IU/mg 蛋白。
14.權利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于成品的外源DNA殘留小于 lng/1000 萬 IU0
15.權利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于成品的宿主菌殘留蛋白不高 于 0. 001%。
16.權利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于分裝容器是管制抗生素瓶。
17.權利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于分裝容器是預充式注射器。
18.權利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于成品內毒素含量低于 0.25EU/1000 萬 IU0
19.權利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于成品規格有0.3ml (300萬 IU)，0. 5ml (500 萬 IU)，0. 6ml (600 萬 IU)，1. Oml (1000 萬 IU)。
全文摘要
本發明提供了一種高濃度低裝量重組人干擾素α2b注射液及其制備方法。其特征在于，由攜帶干擾素α2b基因的質粒pADUA-4轉化大腸桿菌K-12LE392的工程菌經發酵表達，再經過提取及一系列層析提純，以RP-HPLC檢測并控制純度，得到重組人干擾素α2b原液，以苯甲醇-聚山梨醇酯80做為穩定劑系統，以磷酸鹽緩沖液為稀釋液，稀釋合并，分裝于容器中，成品終濃度為1000萬IU/ml，規格有0.3ml(300萬IU)，0.5ml(500萬IU)，0.6ml(600萬IU)，1.0ml(1000萬IU)等。本發明產品具有高純度高穩定性，副反應小的特點，裝量體積小更有利于大劑量或皮下或病灶局部注射，為臨床應用尤其是一些特殊疾病或慢性需長期注射干擾素患者的治療提供了多種給藥方式及達到更佳藥效的可能。
文檔編號A61K47/34GK101843896SQ20091013250
公開日2010年9月29日 申請日期2009年3月27日 優先權日2009年3月27日
發明者郭德本 申請人:長春海伯爾生物技術有限責任公司